Name: グルコース感知を勉強する成体マウス由来の膜視床下部腹内側部のニューロンの電位色素イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-27T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 学ぶ膜電位色素イメージングによる成体マウス視床下部腹内側部ニューロンのグルコース感知評価法。この手法は代謝研究や神経活動のリアルタイム観察に有用です。

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NIHのR01 DK55619、NIHのR21をCA139063

<ol><li>Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-sensing+neurons%3A+are+they+physiologically+relevant%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?</a> Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).</li>
<li>Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+impairs+glucose+and+insulin+regulation+of+nitric+oxide+production+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).</li>
<li>Canabal, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose%2C+insulin%2C+and+leptin+signaling+pathways+modulate+nitric+oxide+synthesis+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Reg.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).</li>
<li>Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP-activated+protein+kinase+and+nitric+oxide+regulate+the+glucose+sensitivity+of+ventromedial+hypothalamic+glucose-inhibited+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).</li>
<li>Murphy, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fasting+enhances+the+response+of+arcuate+neuropeptide+Y-glucose-inhibited+neurons+to+decreased+extracellular+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).</li>
<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucokinase+is+a+critical+regulator+of+ventromedial+hypothalamic+neuronal+glucosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing.</a> Diabetes. 55, 412-420 (2006).</li>
<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+hypoglycemia+enhances+glucose+responsiveness+in+some+ventromedial+hypothalamic+glucosensing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Reg.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons.</a> Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (2004).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 4th edn, Academic Press. (1998).</li>
<li>Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+pre-+and+postsynaptic+influences+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).</li>
<li>Song, Z., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+glucose+and+lactate+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 54, 15-22 (2005).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

成体マウスの神経細胞の活動を研究することができることへの鍵は、健康的な神経細胞を解離させる能力である。成体マウスの視床下部ニューロンの解離は幼若マウス由来のニューロンと比較して、プロトコルのいくつかの重要なステップでより困難である。我々は、多くの方法でこの問題を克服している。厚手の500ミクロンの脳スライスを作ることは、若いマウスからの脳組織のために使用される通常250〜350程度のスライスに比べて神経細胞への機械的な損傷を最小限に抑えることができます。しかし、厚いスライスが心臓灌流し、脳組織のパパイン消化に大きな注意を払う必要があります。血液が脳組織で見ている場合は、右心房に切断し、左心室に配置された針の精度および配置を評価する。灌流液の流量及び量も調整することができる。血液が神経細胞に毒性があり、健康的なニューロンの低収量の原因となりますので徹底した灌流が不可欠です。パパイン消化はできるほど効率的である必要があります優しいチュレーションおよび脳組織からの単一細胞の容易な放出のために。より大きな組織片が二チュレーション中に存在する場合にVMH組織は消化の最後に素早く沈み、いつ非効率的なパパイン消化が疑われる。良好な消化を、組織片は、か...

脳は神経内分泌および自律神経系を通じてエネルギー恒常性を調節する。視床下部腹内側部（VMH）は、腹内側核（VMN）と弓状核（ARC）で構成され、エネルギー恒常性の中央制御に重要である。専門的なグルコース感知ニューロンは、VMH内で、神経活動と周辺グルコース恒常1をリンクします。励起されたグルコース（GE）グルコース（GI）ニューロンは、細胞外グルコースが増加するにつれて、それらの活性を低下させる阻害したニューロンが増加;ニューロンを感知するグルコースの2種類がある。 VMHのグルコース感知ニューロンは、一般的に電気生理学またはカルシウム/膜電位感受性色素イメージングを用いて研究している。 電気生理学的パッチクランプ法は、ex vivoで神経活動の研究にゴールドスタンダードであると考えられている。この技術では、ガラスマイクロピペット電極は、高抵抗を介して細胞膜に結合している（GΩ）シール。パッチクランプ電極は、活動電位の周波数（電流クランプ）をリアルタイムで記録またはイオンコンダクタンス（電圧クランプ）は、単一のニューロン内での変更を可能にする。パッチクランプ法は、特定のイオンチャネルコンダクタンスの変化に関する詳細な情報を提供するが、主な欠点は、1つのニューロンが同時に観察され得ることである。それも、具体的な実験的治療を開始する前に、グルコース感知ニューロンからその1が記録されていることを確認するために記録の約30〜45分かかります。また、GI及びGEニューロンは&lt;総VMHニューロン集団の20％を含む。この問題を配合すると、これらのニューロンの識別の細胞マーカーの多くの場合、不足です。従って、明らかである他の技術は、パッチクランプ分析は面倒であることができない貴重な電気的情報、時間がかかり、低い収率を与えるにもかかわらず。 解離VMHニューロンの蛍光イメージングの使用は、HUの研究を可能にする同時にニューロンのndreds。カルシウム感受性色素は、間接的に神経活動の変化に相関する細胞内カルシウムの変化を測定するために使用することができる。膜電位感受性色素、膜電位の変化をモニターするために使用される。細胞膜電位を測定することは、細胞内カルシウムレベルの変化と比較して、ニューロンの活動のより直接的な指標である。さらに、膜電位色素（MPD）イメージングは​​、潜在的に活動電位発火が変更されておらず、細胞内カルシウムレベルは変化しない可能性があり、膜電位の小さい変化を検出する。これらの蛍光イメージング技術の両方が、幼若マウス2-7からVMHグルコース感知ニューロンを研究するために使用されてきた。結果は、パッチクランプ電気生理学を用いて得られたものよりも詳細であるが、イメージング実験の強度は、それらが同時に必然的にグルコース感知ニューロンの有意な数を含む細胞の大きな集団を評価することである。 MPDイメージングIより均一に全体VMH全体局在している消化管の神経細胞を研究するために特に有用だ、したがって解離しVMH（〜15％GI）で勉強するための十分な集団を提供する。 GEのニューロンが密腹-VMNとARCとVMN間のセルが悪い領域に局在している間は対照的に、彼らはVMH内のニューロン（&lt;1％、GE）のかなりの数を表すものではありません。さらに、単離された神経細胞を研究することによって、星状細胞とシナプス前効果が除去される。生理的接続およびプロセスが失われるので、これは一次ニューロン効果を研究する利点、ならびに不利であることができる。 パッチクランプ電気生理学およびMPD /カルシウム色素イメージングの両方を制限する要因は、若い動物（ 例えば 。マウスやラット&lt;8週齢）を使用する必要がある。これは、加齢に伴って起こる減少し、神経細胞の生存能力と組み合わせて、増加した結合組織に主にある。脳スライスの電気生理学スタッド中新設、結合組織の増加は、それがより困難にニューロンを可視化することができる。増大した結合組織はまた、硬いイメージング研究のための健康なニューロンの大多数を解離することができる。さらに、若い動物からのニューロンは、パッチクランプ記録や撮影のいずれかの間長く生き残る。しかし、若いマウスの使用が主な制限することができます。神経活動および/または神経伝達物質または循環の栄養素に対する応答は、年齢とともに変化する。エネルギーバランスは密接生殖状態に固定されているので、たとえば、エネルギーバランスを調節する視床下部ニューロンは、事前VS思春期後の動物で異なる反応を示すことがある。さらに、多くの疾患は、長期治療を必要とするか、または成人期まで現れていない。このような疾患の主な例は、食事性肥満や2型糖尿病である。グルコース感知ニューロンは、これらの疾患において役割を果たしていると考えられているので、我々が正常MPD撮像expのに使用するために、健康な成人VMHニューロンを培養するための方法論を開発eriments。

<table><tbody><tr><td>Neurobasal-A Medium (Custom)</td><td>Invitrogen</td><td>0050128DJ</td><td>custom made glucose free</td></tr><tr><td>Hibernate-A Medium (Custom)</td><td>BrainBits</td><td></td><td>custom made glucose free</td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin (20,000 U/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td>other vendors acceptable</td></tr><tr><td>Stericup vacuum filter units (0.22 &mu;m)</td><td>ミリポア</td><td></td><td>他のベンダーは許容範囲</td></tr><tr><td>25 mm ガラスカバースリップ</td><td>Warner</td><td>#1 25mm 丸</td><td></td></tr><tr><td>型 18 mm ガラスカバースリップ</td><td>Warner</td><td>#1 18mm 丸</td><td></td></tr><tr><td>型 GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>B27 マイナスインスリン (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>VWR</td><td>55411</td><td></td></tr><tr><td>ビブラトーム&冷却チャンバー</td><td>ビブラトーム</td><td>シリーズ1000セクショニングシステム</td><td></td></tr><tr><td>ビブラトームブレード</td><td>Polysciences</td><td>22370</td><td>インジェクターまたはダブルエッジブレード 他のベンダーから 許容される</td></tr><tr><td>パパイン、懸濁液</td><td>ワーシントン</td><td>LS003124</td><td></td></tr><tr><td>BSA、細胞培養に適した</td><td>シグマ</td><td></td><td>他のベンダー</td></tr><tr><td>許容されるDNAse、細胞培養用</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>その他のベンダーが許容</td></tr><tr><td>するクローニング シリンダー、6 mm x 8 mm</td><td>Bellco Glass</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>膜電位色素 (青)</td><td>Molecular Devices</td><td>R8042</td><td></td></tr><tr><td>インライン ヒーター</td><td>Warner</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ ポンプ</td><td>WPI</td><td>sp100i</td><td>その他のベンダー</td></tr><tr><td>許容されるチャンバー</td><td>Warner</td><td>RC-43C</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレン チューブ</td><td>ワーナー</td><td>PE-90</td><td></td></tr><tr><td>メタモル</td><td>フ分子デバイス</td><td></td><td>代替画像解析ソフトウェア 許容可能</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX61 WI</td><td> 10X&nbsp;対物レンズ</スパン></td></tr>カメラ <tr><td></td><td>測光</td><td>クールスナップHQ</td><td></td></tr><tr><td>ナロー Cy3フィルターセット</td><td>Chroma</td><td>41007a</td><td></td></tr><tr><td>照明システム</td><td>サッター装置</td><td>ラムダ DG-4</td><td></td></tr></tbody></table>

グルコース感知を勉強する成体マウス由来の膜視床下部腹内側部のニューロンの電位色素イメージング

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

神経活動の研究はしばしば増加結合組織に関連する技術的な問題へのげっ歯類歳未満2ヶ月から神経細胞を使用して実行し、年齢とともに起こる神経細胞の生存率を減少している。ここでは、成人老齢マウスから健康的な視床下部ニューロンの解離のための方法論を説明します。成人老齢マウスからニューロンを研究する能力は、後の年齢で現れる疾患モデルを使用することができ、より正確な発生的に、特定の研究のためかもしれません。単一ニューロンを研究するために電気を使用するのではなく、解離したニューロンの蛍光撮像は、ニューロンの集団の活性を研究するために使用することができる。希望の神経細胞のタイプは、視床下部グルコース感知ニューロンの希である異種のニューロン集団を研究するときに特に便利です。私たちは、茶への回答を研究する大人の腹内側視床下部ニューロンの膜電位色素イメージングを利用細胞外のグルコースのnges。グルコース感知ニューロンは、エネルギーバランスの調節において中心的な役割を果たしていると考えられている。大人のげっ歯類でグルコース感知を研究する能力は機能不全のエネルギーバランスに関連する疾患の優位ので、特に有用である（ 例えば 。肥満）年齢とともに増加。

離れて他の視床下部のエリアからVMHの正確な解剖は一貫性のある結果を得ることが重要である。他のエリアを含めることは、計算された脱分極ニューロンの％を変え、VMHニューロン集団が希薄化する可能性があり。さらに、神経細胞を検出するグルコースは、VMHのグルコース感知ニューロンから機能的にも機構的に異なる可能性が外側視床下部などの他の視床下部の地域で確認されている。 図1は、適切な解剖の正しい解剖学的位置を示している。上記のプロトコルに従って、正しいVMH領域を含有する脳組織を解離させることができる。できない場合があり、各部分集団の全体を維持しながら、さらなる切開は、正確に、VMN及びARCを分離する。 図2は、健康な一例は、VMHニューロンを解離示す。免疫細胞を使用して、我々は我々の準備が&gt; 90％の神経細胞であることを確認した。唯一の健康なニューロンは、データ析のために使用されるべきであるあまりにも多くの不健康なニューロンとSISと料理が廃棄されるべきである。不健康であるニューロンは、多くの場合、大きな程度で、MPDを取る、非常に暗いエッジを有し、かつ不規則な形状を...

成人老化マウスからの単一ニューロンの活性は、特定の脳領域のニューロンを解離し、蛍光膜電位色素イメージングを用いて研究することができる。グルコースの変化に対する応答を試験することによって、この手法は、成体腹内側視床下部ニューロンのグルコース感受性を研究するために使用することができる。

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

この手順の全体的な目標は、ニューロン活動の指標として膜電位感受性色素を使用して、高齢マウスの腹側内側視床下部または VMH ニューロンにおけるグルコース感知を評価することです。これは、脳を摘出する前に、麻酔をかけたマウスの脳から血液を洗い流すために最初に心臓灌流を行うことによって達成されます。2番目のステップは、冠状脳スライスを作成し、VMHを解剖することです。次に、VMHニューロンを解離させ、カバースリップ上で培養します。最後のステップは、膜電位色素の存在下でグルコースが減少するときのニューロンの蛍光を測定することです。最終的に、各ニューロンの蛍光変化は、グルコース変化に対するそのグルコース阻害ニューロンの応答を定量化するために使用されます。電気生理学などの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、成体マウスのニューロンを研究できることです。これにより、成人期の病状を研究することができます。この手順は、解剖した脳をビブラムチャンバーのチャックに置くことから始め、ビブラムをレベル2で低速、レベル9で高振幅に設定し、視床下部領域に到達するまで300〜500ミクロンでスライスをカットします。次に、後部から前部にかけて100ミクロンの薄切りをして、正確なVMH領域を分離します。bgmaマイナス2.30ミリメートルの解剖学的変化に細心の注意を払ってください。第3脳室は背側と腹側に分かれています。コロナ。第3心室ヒューズの断面が500ミクロンのスライスを2つ切断すると、これらのスライスにはVMHの正しい領域が含まれます。これらのスライスを、培養培地が入った氷上のシャーレに移します。次に、VMHを解剖します。ピペットを使用して、VMHピースを氷上のミリリットルの培養培地に穏やかに移します。このステップでは、VMHを含む培地を氷から取り出し、室温まで順応させます。4ミリリットルの培地にパペ1ミリリットルあたり20単位を加え、次に反転させて混合し、摂氏34度の水浴に入れます 消化培地が曇らなくなるまで毎分逆転して混合します。その後、滅菌フラスコにろ過し、組織を消化培地に移します。次に、100RPMで摂氏34度で30分間振とうして組織を消化します。消化中に、80ミリグラムのBSAを1ミリリットルの培養培地に溶解し、円錐形のチューブにろ過することにより、8%ウシ血清アルブミンを含む1ミリリットルの培地を準備します。組織を円錐形のチューブで5ミリリットルの培養培地に移し、ゆっくりと反転させて組織を洗浄します。その後、30マイクロリットルのDNA酵素を6ミリリットルの培養液、培地に加え、混合してテンション培地を作製します。次に、洗浄媒体を吸引し、3ミリリットルのtation媒体を追加します。ガラスピペットを使用して、大きいものから小さいものの順に10回ゆっくりとトライレートし、大きな

membrane-potential-dye-imaging-ventromedial-hypothalamus-neurons-from

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Neuroscience

神経科学

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グルコース代謝がアップレギュレートされたショウジョウバエ幼虫の運動ニューロンにおけるグルコース取り込みの評価

出典:Changou, C. A., et.al. デコンボリューション顕微鏡を用いたマウス初代視床下部ニューロンにおけるGLUT4タンパク質輸送のライブ画像。J. Vis. Exp.

デコンボリューション顕微鏡を用いたマウス初代視床下部ニューロンにおけるGLUT4タンパク質輸送のイメージング

視床下部の機能や医療の重要性にもかかわらず、...

マウスの遺伝子操作は、視床下部を介して開発<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーション

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腸-脳神経コミュニケーションのリアルタイム解析:腸管グルコース刺激に応答した皮質ワイドカルシウムダイナミクス

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