抗精神病薬の作用のメカニズムを研究するための方法

この手順の全体的な目標は、ウミエルカの発育と咽頭ポンプに対する抗精神病薬の効果を調べることです。これは、最初に成虫の線虫の個体数を増加させ、それらから動物の同期した個体群を生成することによって達成されます。次のステップは、同期卵または成体を薬物混入アッセイプレートに移すことです。

最後のステップは、線虫に対する薬の効果を観察し、採点することです。最終的に、この結果は、抗精神病薬が薬物に曝露された動物の発達を遅らせ、咽頭ポンプを阻害することを示すことができます。この方法は、抗精神病薬の作用機序についての洞察を提供することができるが、それはまた、他の小分子、さらには脂質のような大きな分子を研究するために適用することができる既知の作業濃度で関心のある薬物を準備している。

まず、12ウェルプレートに2ミリリットルのNGM(ウェルあたり培地)をロードします。プレートを脇に置いて、室温で硬化させます。次に、OP 50細菌のコロニーを選び、それをLB培養液の50ミリリットルボトルに移します。

バクテリアは摂氏37度で一晩中、翌日220RPMで振とうして、準備したプレートの各ウェルに入れます。細菌培養物の20マイクロリットルで、プレートを翌日摂氏37度で一晩インキュベートするように設定します。作業濃度で関心のある薬物の80マイクロリットルをそれぞれよく着座させてください。

この場合、薬はCクロザピンです。アリコートを服用する前に、必ず溶液をボルテックスしてください。溶液を渦巻いてウェル内に均等に分布させ、プレートの蓋を外した状態で室温で吸収させます。

その後、アッセイを続行するか、プレートを摂氏20度で一晩保存し、翌日からアッセイを開始します。関心のある遺伝子型から卵を採取することから始めます。多くのGR成虫がいるワームの集団から始めます。

M nineバッファーを使用して、3.5センチメートルのプレートでワームを洗い流します。次に、15ミリリットルのチューブで2000RPMで1分間スピンダウンします。吸引によって上清を取り除き、5ミリリットルの漂白剤と交換します。

次に、チューブを反転させて成虫をそっと乱し、動物が連続的に溶解し始めるのを待ちます。スコープの下で溶解するワームを観察します。ワームの約半分が溶解したとき。

約5分後、チューブを回転させて卵を採取し、上清を吸引し、すぐにM nineバッファーと交換します。次に、前と同じようにチューブを再び回転させ、約100マイクロリットルのMナイン上清を除くすべてを取り除きます。卵を懸濁するには、チューブを渦巻きにします。

次に、2マイクロリットルの懸濁液をNGMプレートに移し、移された卵の数を数えます。次に、薬物処理されたプレートにウェルあたり30〜35個の卵をロードし、プレートを摂氏20度で24時間インキュベートします。24時間後、孵化した卵の数をスコアリングします。

25匹を超えるワームが存在する場合は、余分なワームをよく取り除きます。プレート上の線虫をインキュベーターに戻し、後で毎日24時間間隔で観察し、線虫のサイズと外陰部の形状に基づいて井戸内の線虫の発達段階をスコアリングします。通常、3日目と4日目に強い効果が見られます。

実験は約1週間続く予定です。このプロトコルでは、前日に説明したように薬物テストプレートを準備し、アッセイを開始します。実験の各遺伝子型に対して50 Lの4段階動物を選びます。

それらをNGMプレートに移し、プレートを摂氏20度で24時間インキュベートします。翌日、15分から20分ごとに、グループが薬物に30分間さらされた後、10匹の動物をテストウェルにロードします。解剖顕微鏡で咽頭ポンプの観察を開始します。

まず、線虫を見つけ、次にその咽頭ポンプを20秒間数えます。得点したら、プレートからワームを選びます。同じ方法で井戸内のすべてのワームにスコアを付けます。

実験遅延を実施した場合の期待される結果。野生型コントロールによる致死性アッセイは、典型的な成長速度とは異なり、cクロザピンに曝露された動物はまだ若い幼虫期にあるか、または死んでいることを示す必要があります 異なるクロザピン濃度の変異体をテストすると、ミュート1などの抑制変異体とMU2などのエンハンサー変異体が明らかになりました。普遍的に、ミュート1の致死率は野生型よりも低く、MU2の致死率は、対照群の生存者であるミュート1の動物はより発達しやすく、ミュート2の生存者はより遅れ

さらなる調査により、クロザピン曝露は濃度依存的に咽頭ポンプ速度を低下させることが明らかになりました。しかし、ミュート1の減少率は野生型よりも低く、ミュート2の減少率は野生型よりも大きかった。このビデオを見れば、抗精神病薬のアッセイを小規模で行う方法についてよく理解できるはずです。

また、メッセージをスケールアップして、大規模な遺伝子スクリーニングを実施することもできます。