Name: 原発性異形性神経膠腫は浸潤性の増殖とイソクエンテインゲナーゼI突然変異 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-14T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学ぶ原発性異形性神経膠腫の動物モデル構築法。免疫不全マウス脳内に人間脳腫瘍細胞を移植し、浸潤性増殖とIDH突然変異の維持を再現する。組織学的・分子解析により悪性神経膠腫の特性を保持し、前臨床研究に有用なモデルを提供する。

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私たちは、分子脳神経外科組織銀行のための貴重な研究資料を提供したヴァンダービルト大学医療センターの患者に特にお世話になっています。ティッシュバンク、リード・C・トンプソンMD(主任研究者)、チェリー・キナードRN(リサーチナース)、ラリー・A・ピアースMS(マネージャー)を設立し、維持してくれた方に感謝します。組織学的サービスは、ヴァンダービルト大学医療センター(VUMC)トランスレーショナル病理学共有リソース(ヴァンダービルト・イングラムがんセンターに授与5P30 CA068485によってサポートされている)によって部分的に行われました。この作業は、NINDS(1R21NS070139)、バロウズ・ウェルカム・ファンド、VMC開発資金からのMKCへの助成金によって支えられました。MKCは、退役軍人省、退役軍人保健局、研究開発局、生物医学研究所研究開発局の助成金1 I01 BX000744-01によってサポートされています。内容は退役軍人省や米国政府の見解を表すものではありません。

1. 腫瘍細胞懸濁液の調製
注: 原発性異種異種移植片を確立し維持するためには、患者材料および動物の使用に関する適切な制度的承認が必要である。ヴァンダービルト大学医療センターでは、診断目的で必要なものを超える切除腫瘍材料を、研究組織リポジトリの患者の同意を得て収集します。検体は無作為化された5桁のREDcapデータベース番号でラベル付けされ、すべての患者固有の識別子が除去される。REDcapデータベースには、性別、年齢(年)、人種、生存状態、病理、癌治療、切除年、および進行までの時間を含む組織リポジトリ内の各標本の同定解除された臨床データが含まれています。滅菌を維持し、原発異種移植法の成功を最適化するために、試薬、蒸気オートクレーブ手術器具、および外科部位は事前に組み立てるか、または準備する必要があります。
注: グリオーマ標本には、多くの場合、大量のミエリンおよび破片が含まれています。試料のサイズによっては、ミエリンやデブリを適切に除去するために4つ以上の不連続勾配チューブを使用する必要があります。
注: このプロセスは、明確に見える解剖されていない組織が残っていない場合、またはほとんど残っていない場合に完了する。トリアージプロセス中に気泡の導入を避けてください。
注: 解離後の細胞生存率は、典型的には>90%である。低い生存率は、手術室からの最適でない組織処理または輸送時間、凍結保存法、またはパパイン解離技術を含む多くの変数を反映し得る。しかし、十分な数の生存可能な生存率が適切な体積で移植される限り、より低い細胞の生存率は依然として十分である。各マウスに対して、50,000-200,000個の生存細胞が2μlの容積に埋め込まれます。シリンジ針のベベル先端により、最終的な体積に5μlの細胞懸濁液を追加して、各注射用の注射器に適切な材料を引き込むことができるようにする必要があります。例えば、5匹のマウスに2μl/マウスを注入するには、最終体積は15μl(15μl=(5 x 2 μl)+5μlでなければなりません。
<ol><li>実験室への輸送のために氷の上に滅菌されたキャップ付き容器に、切除され、識別され直された患者材料を置きます。移植のために直接検体を処理するか、液体窒素(下記参照)で標本を凍結保存し、液体窒素に保管し、後で使用します。</li>
	<li>キットコンポーネントとメーカーから提供される指示と滅菌フードにパパイン解離液(パパイン溶液、洗浄/プロテアーゼ阻害剤溶液および不連続勾配溶液)を準備します。ラベル無菌15 mlポリスチレン対等管と次のようにソリューションを配布します。<ul>
<li>チューブ1:パパイン溶液5ml</li>
			<li>チューブ2:3 mlの洗浄/プロテアーゼ阻害剤溶液</li>
			<li>チューブ 3-6: 5 ml 不連続勾配溶液</li>
		</ul>
</li>
	<li>5 mlのパパイン溶液でグリオーマ標本をチューブ1に入れ、10〜20分の期間にわたって5mlピペットでトリチュレートします。</li>
	<li>材料を10回上下にピペットし、次のトリアーレーションサイクルを開始する前に室温で2〜3分間インキュベートします。</li>
	<li>5 ml ピペットの先端を円錐形チューブの底に近づけ、トリチャレーションの各サイクルで、先端が最後の 2 サイクルチューブの底面に触れるようにします。</li>
	<li>室温で5分間300×gで遠心分離機。上清を取り除き、3mlの洗浄/プロテアーゼ阻害剤溶液中の10倍のペレットを上下にピペットします。</li>
	<li>慎重に「重力」分配速度に設定されたピペットで、5 mlの不連続勾配溶液(チューブ3〜6)の各上に懸濁液の等量を重ね合わせた。</li>
	<li>スイングバケットローターを装備した遠心分離機にチューブを入れ、加速速度を最低の設定に下げ、ブレーキをオフにします。室温で12分間76×gで遠心分離機。ブレーキをオフにすると、一般的に20分後に遠心分離が完了します。</li>
	<li>上清を取り除き、再懸濁し、各ペレットを5mlの無菌バランス塩溶液に組み合わせ、細胞を氷の上に置きます。</li>
	<li>細胞懸濁液の部分(10〜100 μl)を取り除き、ヘモサイトメーターによるトリパンブルー排除により生存細胞の密度を決定します。</li>
	<li>遠心分離機 300 x g で 5 分間上清を取り除き、μl当たり25,000-125,000個の生存細胞の密度で細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>細胞懸濁液の十分な容積を200 μlマイクロ遠心分離管(PCRチューブ)に移し、氷の上に置きます。</li>
</ol>2. 手術部位と器具の準備
注: 滅菌外科用手袋は処置の間に着用される。各機関の要件に応じて、外科用ガウン、キャップ、フェイスガードが必要な場合があります。
<ol><li>動物の準備、操作フィールドおよび動物の回復のための分離された隣接領域とげっ歯類の外科のための、分解されたベンチトップを準備する。</li>
	<li>蒸気オートクレーブで手術器具を殺菌する。続いて、ホットビーズ滅菌器を使用して、ある動物の対象から次の動物に移行する際に器具をフラッシュ滅菌します。</li>
</ol>3. 誘導、麻酔、麻酔
注: マウスが麻酔された時点から15分を超える手術は、接触熱源を必要とする。低体温症を予防するために、マウスは術前および術後の期間中に熱源(循環湯毛布)を提供される。 
<ol><li>各マウスが体重1グラム当たり10 μlのカクテルを注入してケタミン100mg/kgおよびキシラジン10mg/kgを受け取るような誘導麻酔用ケタミン/キシラジンカクテルを調製します。</li>
	<li>
表 1.麻酔カクテル。
		<table><tbody>
<tr>
<td rowspan="2"></td>
					<td rowspan="2">在庫集中</td>
					<td colspan="3">準備するボリューム </td>
				</tr>
<tr>
<td>1つのマウス</td>
					<td>5匹のマウス</td>
					<td>10匹のネズミ</td>
				</tr>
<tr>
<td>ケタミン</td>
					<td>100 mg/ml</td>
					<td>25 μl</td>
					<td>125 μl</td>
					<td>250 μl</td>
				</tr>
<tr>
<td>キシラジン</td>
					<td>100 mg/ml</td>
					<td>2.5 μl</td>
					<td>12.5 μl</td>
					<td>25 μl</td>
				</tr>
<tr>
<td>等張生理生理</td>
					<td></td>
					<td>223 μl</td>
					<td>1,113 μl</td>
					<td>2,225 μl</td>
				</tr>
<tr>
<td colspan="2">トータル</td>
					<td>250 ul</td>
					<td>1,250 μl</td>
					<td>2,500 μl</td>
				</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>ストック溶液(10 mg/ml)1:20を無菌で1:20に希釈して鎮痛用ケトプロフェン溶液を調製し、各マウスが体重1グラム当たり10μlの溶液を注入して5mg/kgの用量を受け取るようにします。</li>
	<li>計量し、術前の体重を記録します。個々のマウスウェイトは異なりますが、一般的には18〜22gの範囲です。</li>
	<li>マウス体重1グラム当たりケタミン/キシラジンカクテルをインスリン注射器で腹腔内空間に10μl注入します。例えば、20gマウスに200μlを注入します。</li>
	<li>後ろ足のつまみでマウスが完全に麻酔を受けるかどうかを確認します。マウスがピンチから撤退しなくなるのに、一般的に3〜5分かかります。</li>
	<li>マウス体重1グラム当たりのケトプロフェン溶液をインスリン注射器で脇腹の緩い皮膚に皮下に10μl注入する。例えば、20gマウスに200μlを注入します。</li>
	<li>頭蓋骨の上に髪をバリカンで剃り、綿の先端アプリケーターを使って露出した頭皮をポビドネヨウ素でこすり、アルコールパッドを拭きます。これらのステップを繰り返し、ポビドネヨウ素スクラブとアルコール拭き、さらに2回。</li>
	<li>マウスの目に眼科軟膏を塗布する。</li>
	<li>無菌メスの刃で目の前に耳の後ろから伸びる1cmの正中線切開を作ります。</li>
	<li>マウスを解剖スコープの下に置き、頭蓋骨を露出させて縫合線を特定します。ドリルで円形の動きを使用して、2.5mmの横方向のバリ穴をブレグマに、1 mm後部をコロナ縫合糸に中央に配置します。</li>
</ol>4. 頭蓋内移植
注: 2.5 μlを超える注入量は、マウスに対して致死的である可能性があります。
<ol><li>上部の切り込み部を切り身バーの上に引っ掛け、鼻クランプを適用して、頭蓋骨が中立的な位置にしっかりと保持されるようにして、ステレオチックフレームにマウスを置きます。</li>
	<li>マイクロ遠心分離管内の細胞の5〜10 μlを数回上下に引き込み、立体式マニピュレータのプローブホルダーにクランプした10μlのハミルトンシリンジに取り込み、懸濁液を混合して気泡を除去します。プランジャーを押し下げるので、シリンジに2μl(1匹の動物を注入するのに十分な量)がロードされます。</li>
	<li>皮膚切開部の横縁を引っ張ってバリ穴を露出させ、マイクロマニピュレーターで針をバリ穴に入れ、ベバ部分が頭蓋骨表面のすぐ下になるようにします。<ol>
<li>針を3mm進めてから針を0.5mm引き出して、注射用のスペースを作ります。</li>
			<li>プランジャーを30秒以上ゆっくりと進め、針を脳内に残してさらに2分間進めます。0.5 mm上昇して徐々に針を引き出し、さらに30秒待ってから、脳から針を取り除きます。</li>
		</ol>
</li>
	<li>定位フレームからマウスを取り外し、オートクリップで巻を閉じます。</li>
	<li>体温を維持し、粘膜と露出した組織(足の裏)の呼吸パターンと色を継続的に監視するために、加温パッドの上にマウスを置きます。</li>
	<li>麻酔(胸部および外来)から完全に回復したら、無菌ミクロアイソレーターケージにマウスを入れ、動物の住宅施設に戻します。</li>
</ol>5. 移植後の動物のケアと観察
注: 腫瘍の生着および浸潤成長の最も信頼できる徴候は、ハンチ姿勢および粗い毛髪の上皮の発達を伴う漸進的で持続的な体重減少である。まれに、神経学的欠乏は運動失調、麻視、発作を含む指摘される。異形性原発異種移植片は非常に侵襲性が高く、長期間にわたって発達する。マウスは通常、移植後3〜6ヶ月の腫瘍増殖の症状を現す。
<ol><li>切開部位での食物および水の摂取、行動、グルーミング、および感染の兆候について、異交性異種移植片を持つマウスを毎日観察する。</li>
	<li>痛みや苦痛が術後に観察された場合、ケトプロフェン(皮下5mg/kg、1日1〜2倍)を投与する。</li>
	<li>手術後8~10日後にオートクリップを取り外します。</li>
	<li>マウスの体重は毎週です。</li>
	<li>腫瘍の生着の徴候および症状を監視する。</li>
</ol>6. 腫瘍ハーベスティング
注: この方法により、第1のコロナスライス(#1)は、嗅球の後部の側面と前葉の前部の側面を含む。生着した腫瘍は、その後の3つのコロナスライス(スライス#2、#3、#4)の右半球に最も豊富であり、注射部位はコロナスライス#3に日常的に含まれています。実験の必要性に応じて、材料は、腫瘍の通過、凍結組織切片、ホルマリン固定パラフィン埋め込み組織切片、解離組織のフローサイトメトリー、DNA、RNA、またはタンパク質分析のための細胞培養またはリセートに使用され得る。腫瘍の一部は、80〜95%の範囲の細胞生存率を有する将来のニーズのために凍結保存され得る。
<ol><li>二酸化炭素への長期暴露によってマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行う。</li>
	<li>脳の基部(頭蓋マグナムレベル)で大きな手術用ハサミで安楽死させたマウスを切断し、切開から皮膚を前方に引っ張って頭蓋骨を完全に露出させる。</li>
	<li>脳を取り除く。<ol>
<li>頭蓋骨の左側に沿って後頭部骨を切断するために、左外部聴覚肉のレベルに孔マグナムの側面に細かい外科用ハサミの1つの先端を挿入します。右側に同じカットを実行します。</li>
			<li>一方の外部聴覚肉からもう一方の外熱部に沿って後頭部骨を切断し、小脳を露出させるために骨を取り除く。</li>
			<li>目の間の鼻骨板を切ります。</li>
			<li>鼻骨板から尾大に矢状縫合糸に沿って後に切断することによって、矢状縫合を切断します。ラムダからブレグマに前から切断することによって、矢状縫合に沿って正中切開を完了します。</li>
			<li>慎重に頭蓋の開口部に沿って鉗子の細かいペアの先端を挿入して、頭蓋骨の硬膜接着を脳に引き裂き、2つの頭蓋骨を横に皮をむいて脳と嗅球を逆に露出させる。</li>
			<li>嗅球の腹側の側面と頭蓋骨の間の鉗子を滑って、あらゆる癒着を解放する。</li>
			<li>頭蓋骨を後ろに傾けて、視神経やその他の脳神経が露出するように脳を後退させます。脳神経を切断し、脳を無菌PBSを含む皿に放出する。</li>
		</ol>
</li>
	<li>重さのあるヘラで脳をマトリックススライサーに移し、カミソリの刃で2mmコロナスライスを生成します。</li>
	<li>さらに目視検査と組織処理のために滅菌PBSを含む皿にコロナスライスを配置します。</li>
</ol>7. 腫瘍凍結保存
<ol><li>凍結保存培地のストック溶液を準備する。<ol>
<li>増殖サプリメント50ml、ペニシリン100x溶液5ml、レンサマイシン溶液5ml、0.2%ヘパリン450μlを450mlの基底培地に加えます。</li>
			<li>光から保護された4°Cで在庫液を保管してください。</li>
		</ol>
</li>
	<li>凍結保存媒体の作業溶液を準備します。<ol>
<li>50mlポリプロピレンコニカルチューブに47.5mlの凍結保存培地と2.5mlの無菌DMSOを組み合わせてよく混ぜます。</li>
			<li>アリコート1.0 mlの作業溶液を各クライボシャルにし、光から保護された4°Cで保存します。</li>
		</ol>
</li>
	<li>ゼノグラフトされた脳の2mmコロナスライスを氷の上に凍結保存培地を含む凍結に入れる。</li>
	<li>バイアルをしっかりとキャップし、-80°Cの冷凍容器に入れます。 翌日、凍結液を液体窒素タンクに移し、より長く貯蔵します。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

培養細胞株、異種移植片および遺伝子組み換えマウスは、神経膠腫をモデル化するための最も一般的な方法であり、各モデルシステム3,13,14には明確な利点と限界がある。原発性異形性神経膠腫の関連する利点には、びまん性神経膠腫を代表する浸潤性増殖と、培養グリオーマ細胞で維持することが非常に困難な遺伝的変化および重要なシグナル伝達メカニズムの保持が含まれる。例えば、Iは、15,16個の第一交位異種異種移植片において、デヒドロゲナーゼ変異およびソニックヘッジホッグリガンド産生をソクチングするが、培養グリオーマ細胞14,17-19ではまれにしか維持されない。しかし、実験的ニーズに応じて、一次異交性異種移植片の重大な欠点を考慮することが重要です。十分な患者材料へのアクセスにもかかわらず、異所性部位よりも脳内の時間の経過とともにグリオーマの成長を測定することはより困難である。さらに、一次異交性異種移植片は異種異種移植片よりも著しく遅い割合で増殖する。したがって、研究者は、重要な組織学的および分子的特徴もまた保持することができる免疫不全マウスの側面に細胞を移植することを好む...

悪性神経膠腫は、脳および時には脊髄で起こる中枢神経系の原発性グリア腫瘍である。神経膠腫は、組織学的に天文学的に類似しており、組織学的に占星細胞、オリゴデンドロサイトまたはエセンディマル細胞に従って分類され、悪性腫瘍の病的特徴について数値的に等級(I〜IV)に分類される。最も一般的な組織学的サブタイプは、アストロサイトーマ、オリゴデンドロリオ腫および混合オリゴアストロサイトーマである。WHOグレードII〜IVを包含する悪性神経膠腫は、侵襲的な成長および現在の治療法への再特性によって特徴付けられる。米国では毎年、約15,750人が悪性神経膠腫と診断され、推定12,740人の患者がこの病気に屈しています。これらの統計は、悪性神経膠腫の特に致死的な性質と強化された治療効果の重要な必要性を強調する。
がんモデルは、腫瘍生物学や治療法の調査に不可欠です。ヒト癌細胞株は、インビトロ操作および生体内異種移植研究(二次異種移植片)1に対する重要な第一歩を表す。しかしながら、標準的な癌細胞培養は、二次異種移植片5では回復し得ない形質および遺伝子型変換2~4を受ける。さらに、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(IDH)変異6などの遺伝子改変は、癌細胞培養において、明確な幹細胞集団7および主要なシグナル伝達経路8への依存性が失われ得る。ゲノムプロファイルは、癌球培養においてより良い程度まで維持することができるが、原発性腫瘍2,3の遺伝子型を完全にミラーリングすることができない。直接の異形性移植は、インビトロ培養の影響を否定し、適切な微小環境を提供し、腫瘍開始細胞9,10の完全性を維持する。したがって、原発異種移植片は、将来の臨床試験5,11,12の合理的な設計を支援するために、標的剤を厳格に試験するための強力で関連性の高い前臨床モデルを表す。

<table><tbody><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Life Technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>パパイン解離システム</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LK003150</tr><tr><td>トリパンブルー溶液 0.4%</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン HCl</td><td>施設の薬局または地元の獣医供給会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キシラジン HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ケトプロフェン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 眼科用軟膏 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ポビドンヨード </td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック<td>190061617</td><td> </td></tr><tr><td> 凍結保存培地および増殖サプリメント </td><td>StemCell Technologies</td><td>05751</td><td> </td></tr><tr><td> 0.2% ヘパリンナトリウム塩 PBS </td><td>StemCell Technologies</td><td>07980</td><td> </td></tr><tr><td> ペニシリン-ストレプトマイシン </td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td> </td></tr><tr><td> ジメチルスルホキシド </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6250-5X10ML</td><td> </td></tr><tr><td> NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ マウス </td><td>ジャクソン研究所</td><td>005557</td><td> NSG マウス </td></tr><tr><td> 抗ヒトビメンチン抗体 </td><td>Dako</td><td>M7020</td><td> 使用 1:200〜1:800 </td></tr><tr><td> 抗ヒト IDH1 R132H 抗体 </td><td>ダイアノバ</td><td>DIA-H09</td><td> 使用 1:100 〜 1:400 </td></tr><tr><td> スイングバケットローター付き遠心分離機 </td><td></td><td></td><td> </td></tr> 分<tr><td>注速度制御付きピペッター </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td> ディスポーザブル血球計算盤</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック<td>22-600-100</td><td> </td></tr><tr><td> 滅菌手術用手袋</td>フィ<td>ッシャー・サイエンティフィ</td>ック<td>11-388128</td><td> </td></tr><tr><td> ディスポーザブル・ガウン</td>フィ<td>ッシャー・サイエンティフィ</td>ック<td>18-567<</td><td>p> </td></tr><tr><td> 外科マスク </td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>19-120-1256</td><td> </td></tr><tr><td> ツベルクリン注射器 </td><td>BD</td><<td>p>305620</td><td> </td></tr><tr><td> アルコールパッド</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>22-246-073</td><td> </td></tr><tr><td> 携帯電子スケール</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td><td>ック01-919-33</td><td> </td></tr><tr><td> ズーム実体顕微鏡</td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td> 外科用クリッパー</td><td>ストールティング</td><td>51465</td><td> </td></tr><tr><td> メスの柄</td>ファイン<td>サイエンスツール</td><td>10003-12</td><td> </td></tr><tr><td> メス刃, #10 </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td> 脳定位固定装置 </td><td>ストールティング</td><td>51730</td><td> </td></tr><tr><td> 高速ドリル</td><td>ストールティング</td><td>51449</td><td> </td></tr><tr><td>ドリルビット, 0.6 mm</td><td>ストールティング</td><td>514552</td><td></td></tr><tr><td> ハミルトン シリンジ </td><td>ハミルトン</td><td>80336</td><td> </td></tr><tr><td> オートクリップ、9 mm </td><td>BD</td><<td>p>427630</td><td> </td></tr><tr><td> 循環水温パッド </td><td>ケント サイエンティフィ</td>ック<td>TP-700 <>TP-1215EA</td><td> </td></tr><tr><td> ホットビーズ乾式滅菌器 </td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>INS300850</td><td> </td></tr><tr><td> 外科用ハサミ</td>ファイン<td>サイエンスツール</td><td>14101-14</td><td> </td></tr><tr><td> ファインハサミ</td>ファイン<td>サイエンスツール</td><td>14094-11</p</td><td>> </td></tr><tr><td> 春はさみ</td>ファイン<td>サイエンスツール</td><td>15018-10</td><td> </td></tr><tr><td> デュモン鉗子</td>ファイン<td>サイエンスツール</td><td>11251-30</td><td> </td></tr><tr><td> Semimicroスパチュラ</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>14374</td><td> </td></tr><tr><td>マウス脳スライサーマトリックス </td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS002-1</td><td> </td></tr><tr><td> 極低温保存バイアル</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>12-567-501</td><td> </td></tr></tbody></table>

原発性異形性神経膠腫は浸潤性の増殖とイソクエンテインゲナーゼi突然変異

Primary Orthotopic Glioma Xenografts Recapitulate Infiltrative Growth and Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

悪性神経膠腫は、臨床的および分子的特徴が異なる非常に浸透性の高いグリア新生物の不均一なグループを構成する。原発性異形移植片は、前臨床動物モデルにおける悪性神経膠腫サブタイプの組織病理学的および分子的特徴を再現する。移植アッセイでIIIおよびIV悪性神経膠腫を採点するWHOをモデル化するために、ヒト腫瘍細胞は免疫不全マウスの同位体部位、脳に異種移植される。培養した腫瘍細胞を利用する二次異種移植片とは対照的に、ヒトグリオーマ細胞は切除標本から解離され、組織培養で事前に通過せずに移植され、原発性異種移植片を生成する。この報告書の手順は、腫瘍サンプル調製、免疫不全マウスへの頭蓋内移植、腫瘍生着および腫瘍収穫のモニタリングを詳述し、その後のレシピエント動物への通過または分析を行う。腫瘍細胞の調製は2時間を必要とし、外科的処置は20分/動物を必要とする。

解剖したグリオーマ細胞は、免疫不全マウスの脳に直接移植され、一次異形移植ラインを得る。各腫瘍標本には、保護された健康情報を除去する識別プロセスの一環として、移植前に無作為化数が割り当てられる。この目的のために、5桁のREDcapデータベース番号を使用します。 図1 は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ1(IDH1)変異アルギニン132をヒスチジン(R132H)と共に神経膠芽腫(GBM 17182)から異種移植片線を確立するためのプロセスおよび命名法を示す。移植後、異種移植腫瘍を示す腫瘍同定番号に「X」が付加され、続いて「P」が通過数を追跡する。P0は、最初の移植レシピエントを指定し、P1は、第1異種移植片の通過のレシピエントマウスを指定する。典型的には、3〜5匹のマウスは最初に移植されてラインを確立し、異種移植された腫瘍は10匹のレシピエントマウス(P1)に継代され、今後の研究のためにラインを拡大する。
異形移植後、レシピエントマウスは腫瘍の生着および成長の徴候および症状をモニターする。腫瘍の生着の最も敏感な徴候は有意で持続的な体重減少である。マウスは...

悪性神経膠腫は、臨床的および分子的特徴が異なる非常に浸透性の高いグリア新生物の不均一なグループを構成する。原発性異形移植片は、前臨床動物モデルにおける悪性神経膠腫サブタイプの組織病理学的および分子的特徴を再現する。

原発性異形性神経膠腫は浸潤性の増殖とイソクエンテインゲナーゼI突然変異

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary ...

この手順の全体的な目標は、原発性同所性神経膠腫、再現する異種移植片、組織病理学的、および分子的特徴を生成することです 前臨床動物モデルにおける悪性神経膠腫サブタイプの特徴。これは、最初に直接移植用のヒト脳腫瘍標本を取得することによって達成されます。2番目のステップは、検体から細胞懸濁液を調製することです。次に、腫瘍細胞を免疫不全マウスの脳に移植します。次に、レシピエントマウスは、腫瘍、生着、および成長の兆候がないか監視され、その後、分析または連続移植のために採取されます。最終的に、組織学、DNAシーケンシング、およびその他の分子アッセイを使用して、浸潤性腫瘍の成長と、ISOクエン酸デヒドロゲナーゼ変異などの遺伝的変化の保持を示します。がんの前臨床動物モデルは、腫瘍の生物学と治療法の研究に不可欠です。原発性神経膠腫異種移植片が、二次GLI異種移植片などの既存の方法よりも優れている点は、神経膠腫細胞が培養において遺伝子型および表現型の変化を受け、培養神経膠腫細胞をマウスに移植しても回復できないことである。手順のデモンストレーション。今日は私と一緒に博士ヘラルド・バレス、私の研究室のメンバーになります キットのコンポーネントとメーカーから提供された指示書を使用して、滅菌フード内のペパン解離溶液を準備し始めます。チューブ1に5ミリリットルのペパン溶液を入れます。チューブ2には3ミリリットルの洗浄プロテアーゼ阻害剤溶液が含まれ、チューブ3〜6には5ミリリットルが含まれます。不連続な勾配解のそれぞれ。準備ができたら、神経膠腫検体をチューブ1に入れ、5ミリリットルのピペットで10〜20分かけて三量化します。材料を10回上下にピペットで動かし、室温で2〜3分間インキュベートしてから、次のテーションサイクルを開始する前に、5ミリリットルのピペットの先端を円錐管の底部に近づけます。最後の2サイクルで先端がチューブの底に触れるようにトライの各サイクルでは、テーテーションプロセス中に気泡が入らないようにすることが重要です。このプロセスは、はっきりと見える非関連組織が残っていないか、ほとんど残っていないときに完了します。遠心分離後、スナットを取り外し、洗浄プロテアーゼ阻害剤溶液の3ミリリットルでペレットを10回上下にピペットで動かします。次に、不連続なグラジエント溶液を含む各チューブに等量の懸濁液を慎重に重ねます。ピペッターを重力分注速度にセットした状態で、スイングバケットローターを備えた遠心分離機にチューブを置きます。加速速度を最低設定に設定し、ブレーキを切ってからマシンを始動してください。細胞を回収した後、上清を再懸濁液を取り除き、各ペレットを5ミリリットルの滅菌平衡塩溶液に混ぜ合わせます。先に進む前に、細胞を氷の上に置きます。細胞懸濁液のサンプルを取り出し、ヘモサイトメーターで

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

ルシフェラーゼで修飾された人間の脳の腫瘍異種移植片は、腫瘍の成長および生物発光イメージング法を用いて治療に対する反応のその後のモニタリングで、胸腺欠損マウスでは頭蓋内に確立することができます。生存時間解析と組み合わせることで、生物発光のモニタリングは、脳腫瘍の治療を検討している治療法の前臨床試験に不可欠な研究ツールです。...

生物発光イメージングを使用して腫瘍の成長や治療に対する反応のその後の分析では頭蓋内脳の腫瘍異種移植片の確立

私たちは、ヌードマウスとその後シリアルの脳に人間の多形性膠芽腫細胞の正確な、定位注入のための統合方法を説​​明...

定位頭蓋内注入と<emインビボ&gt;</em多形性膠芽腫のマウスモデル系における腫瘍異種移植片の&gt;生物発光イメージング

我々は、腫瘍の成長の間の遊びで、通常の生物物理学的な制約を再現生体2光子顕微鏡用マウスにおける皮質同所神経膠芽腫モデルを確立している。腫瘍の上に頭蓋骨を交換慢性ガラス窓は、2光子顕微鏡による経時的な腫瘍進行のフォローアップを可能にします。...

同所神経膠芽腫モデルマウスは、脳実質細胞の物理的制約を維持し、生体内二光子顕微鏡に適し

表現型の野生型アストロサイトと神経幹細胞は、floxed、条件付き発癌性対立遺伝子で操作され、ウイルスCre媒介組換えを介して形質転換されたマウスから採取され、同系で免疫能力のある同腹仔の脳に形質転換細胞を同所性注射することにより、in vitroおよびin...

モデル星細胞腫発症機序体外とインビボ皮質アストロサイトまたは条件付き、遺伝子改変マウスから神経幹細胞を使用した

脳はよくインビトロまたは異所性の分析によって示されていない資質を持つユニークなサイトです。再現性のある場所および成長特性を有する同所性マウスモデルを確実に定位固定装置及び低圧シリンジポンプを用いて頭蓋内の注射を使用して作成することができる。...

解剖学的に正確な作成と人間の脳の腫瘍の再現性頭蓋内異種移植片

GL261神経膠腫細胞は、神経膠芽腫の有用な免疫適格動物モデルを提供します。このプロトコルの目標は、in vivo 生物発光イメージングを使用して頭蓋内腫瘍の成長を監視するための適切な技術を実証し、腫瘍免疫学および神経膠芽腫を治療するための免疫療法アプローチを研究するためのルシフェラーゼ修飾 GL261...

神経膠芽腫のための免疫担当動物モデルの生物発光イメージング

3 D 文化として成長した神経幹細胞は神経膠腫の生物学を勉強するための強力なツールを構成します。パラフィン包埋による神経膠腫細胞の 3次元構造を維持しながら免疫を実行するプロトコルをご紹介します。このメソッドは、幹細胞性など神経分化神経膠腫 neurosphere...

パラフィン埋め込まれた 3 D 神経膠腫 Neurosphere 文化に免疫組織化学による神経膠腫におけるバイオ マーカーの評価

ここでは、遺伝子操作されたモデルマウス腫瘍に由来する細胞の頭蓋内注射によって樹立されたGBMの前臨床同所性マウスモデルについて述べる。このモデルは、ヒトGBMの疾患の特徴を示しています。トランスレーショナル研究のために、マウス脳腫瘍は in vivoMRI および組織病理学によって追跡される。...

多形性膠芽腫の並進同所性モデル

IDH1変異体びまん性低悪性度神経膠腫は、培養が困難な希少腫瘍です。私たちは、IDH1変異タンパク質の発現を保持し、数ヶ月間培養を維持するシンプルな非酵素的外植片法を紹介します。重要なことに、この技術は凍結保存された腫瘍に作用し、神経膠腫の研究に貴重なリソースを提供します。...

IDH1変異体びまん性低悪性度神経膠腫の外植片培養のためのプロトコール

同所性小児脳腫瘍モデルの開発には、がん細胞を正確に移植するための定位固定装置を使用するという、細心の注意を払った精度が必要です。ここで紹介する方法論は、脳腫瘍細胞の調製、頭蓋内注射の実施、および脳腫瘍の生着を評価するための術後モニタリングシステムの実装に関連するステップを概説しています。...

脳腫瘍に対する同所性患者由来異種移植モデルの確立

このプロトコルの目的は、研究者に頭蓋内移植のための再現性の高い技術を提供することです。...

マウスにおける膠芽腫患者由来異種移植細胞株の立体定位頭蓋内移植

学ぶ原発性異形性神経膠腫の動物モデル構築法。免疫不全マウス脳内に人間脳腫瘍細胞を移植し、浸潤性増殖とIDH突然変異の維持を再現する。組織学的・分子解析により悪性神経膠腫の特性を保持し、前臨床研究に有用なモデルを提供する。

原発性異形性神経膠腫は浸潤性の増殖とイソクエンテインゲナーゼI突然変異

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