Name: 天然のタンパク質からアミロイドの迅速な生成インビトロ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: 学ぶ天然タンパク質からアミロイドを迅速に生成する方法。MESバッファーと高温処理、EDC架橋を用いてタンパク質ミスフォールディングを誘導し、ハイブリッドアミロイド形成のメカニズムを解明します。

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この研究は、国立衛生研究所助成金AI074809およびテキサス大学MDアンダーソンがんセンターの機関研究助成金プログラムからW.C.への助成金によってサポートされています。

1. MESバッファの準備
<ol>
	<li>MESバッファー(0.1 M 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸および0.9 M NaCl)を使用して、タンパク質のみのアミロイドと安定化した可溶性タンパク質オリゴマーの両方を調製します。1.95 gのMESと5.27 gのNaClを量ります。H2Oを添加し、pHを4.7に調整します。最終容量を100mlにします。4°Cで最大6か月間保管してください。</li>
</ol>
2. 天然タンパク質から直接タンパク質のみのアミロイドを調製する
<ol>
	<li>選択したタンパク質(任意の天然タンパク質またはペプチド)を秤量し、MESバッファー中で10 mg/mLに再構成します。</li>
	<li>65°Cの水浴中で4時間インキュベートします。期間の終わりまでに、溶液中に白い沈殿物が見えます。</li>
	<li>10%(v/v)のTris-HCl(1 M、pH 10.5)でサンプルを中和します。</li>
	<li>透析カセットでタンパク質を一晩透析し、目的のバッファーに交換してさらに分析します。</li>
	<li>天然タンパク質のコントロールサンプルは、ステップ2.1、2.3、および2.4に従って、熱沈殿なしで調製できます(ステップ2.2)。</li>
</ol>
3. 天然タンパク質の安定化可溶性オリゴマーからハイブリッドアミロイドを調製する
<ol>
	<li>安定化可溶性タンパク質オリゴマーの調製
	<ol>
		<li>選択したタンパク質を秤量し、MESバッファー中で10 mg/mLに再構成します。室温で15分間放置します。</li>
		<li>1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC)を秤量し、MESバッファーに20 mg/mlのフレッシュストックを調製します。</li>
		<li>タンパク質とEDC溶液を2:5(v/v)の比率で、つまりEDC10 mgごとに2 mgのタンパク質で混合します。 </li>
		<li>室温で2時間インキュベートします。</li>
		<li>10%(v/v)のTris-HCl(1 M、pH 10.5)でサンプルを中和します。</li>
		<li>透析カセットでタンパク質を一晩透析し、目的のバッファーに交換してさらに分析します。</li>
		<li>安定化した可溶性タンパク質オリゴマーは、4°Cで最大4週間保存してください。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安定化された可溶性タンパク質オリゴマーからハイブリッドアミロイドを調製します。
	<ol>
		<li>DNA含有アミロイドを調製するには、DNAと安定化可溶性タンパク質オリゴマーを1:1の比率(w / w)で混合します。4°Cで少なくとも2時間放置します。この期間中、初期タンパク質濃度が0.5 mg / ml以上の場合、溶液中に不溶性沈殿物が見られます。</li>
		<li>RNA含有アミロイドを調製するには、RNAと安定化可溶性タンパク質オリゴマーを1:1の比率(w / w)で混合します。4°Cで少なくとも2時間放置します。この期間中、初期タンパク質濃度が0.5 mg / ml以上の場合、溶液中に不溶性沈殿物が見られます。</li>
		<li>ヘパリン含有アミロイドを調製するには、ヘパリンと安定化可溶性タンパク質オリゴマーを1:1の比率(w/w)で混合します。4°Cで少なくとも2時間放置します。この期間中、初期タンパク質濃度が0.5 mg / ml以上の場合、溶液中に不溶性沈殿物が見られます。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+proteins+in+fatal+ways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding proteins in fatal ways.</a> Nature. 426, 900-904 (2003).</li>
<li>Schnabel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding%3A+The+dark+side+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein folding: The dark side of proteins.</a> Nature. 464, 828-829 (2010).</li>
<li>Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+and+protection+against+misfolded+or+damaged+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins.</a> Nature. 426, 895-899 (2003).</li>
<li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+functional+amyloid%2C+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366 (2006).</li>
<li>Goldschmidt, L., Teng, P. K., Riek, R., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+amylome%2C+proteins+capable+of+forming+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identifying the amylome, proteins capable of forming amyloid-like fibrils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3487-3492 (2010).</li>
<li>Fowler, D. M., Koulov, A. V., Balch, W. E., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+amyloid+-+from+bacteria+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional amyloid - from bacteria to humans.</a> Trends Biochem. Sci. 32, 217-224 (2007).</li>
<li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Escherichia+coli+Curli+Operons+in+Directing+Amyloid+Fiber+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Escherichia coli Curli Operons in Directing Amyloid Fiber Formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li>
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<li>Maji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Amyloids+As+Natural+Storage+of+Peptide+Hormones+in+Pituitary+Secretory+Granules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional Amyloids As Natural Storage of Peptide Hormones in Pituitary Secretory Granules.</a> Science. 325, 328-332 (2009).</li>
<li>Badtke, M. P., Hammer, N. D., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Amyloids+Signal+Their+Arrival%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Functional Amyloids Signal Their Arrival.</a> Sci. Signal. 2, pe43(2009).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIP1%2FRIP3+Necrosome+Forms+a+Functional+Amyloid+Signaling+Complex+Required+for+Programmed+Necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RIP1/RIP3 Necrosome Forms a Functional Amyloid Signaling Complex Required for Programmed Necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li>
<li>Stefani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+biophysical+features+of+both+oligomer%2Ffibril+and+cell+membrane+in+amyloid+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Biochemical and biophysical features of both oligomer/fibril and cell membrane in amyloid cytotoxicity.</a> FEBS J. 277, 4602-4613 (2010).</li>
<li>Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+classification+of+toxic+amyloid+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural classification of toxic amyloid oligomers.</a> J. Biol. Chem. 283, 29639-29643 (1074).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+with+nucleic+acids+or+glycosaminoglycans+converts+soluble+protein+oligomers+to+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding with nucleic acids or glycosaminoglycans converts soluble protein oligomers to amyloid.</a> J. Biol. Chem. 287, 736-747 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Li, J. -P., Lijuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+in+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mol.+Biol.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans in amyloidosis.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 93, 309-334 (2010).</li>
<li>Jiménez, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-DNA+Interaction+at+the+Origin+of+Neurological+Diseases%3A+A+Hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Alzheimer%27s+Dis%22%5BJournal%5D)">Protein-DNA Interaction at the Origin of Neurological Diseases: A Hypothesis.</a> J. Alzheimer's Dis. 22, 375-391 (2010).</li>
<li>Bhattacharya, M., Jain, N., Mukhopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+Mechanism+of+Aggregation+and+Fibril+Formation+from+Bovine+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Insights into the Mechanism of Aggregation and Fibril Formation from Bovine Serum Albumin.</a> J. Phys. Chem. B. 115, 4195-4205 (2011).</li>
<li>Vetri, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+Serum+Albumin+protofibril-like+aggregates+formation%3A+Solo+but+not+simple+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Bovine Serum Albumin protofibril-like aggregates formation: Solo but not simple mechanism.</a> Arch. Biochem. Biophysics. 508, 13-24 (2011).</li>
<li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li>
<li>McParland, V. J., Kalverda, A. P., Homans, S. W., Radford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+properties+of+an+amyloid+precursor+of+b2-microglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural properties of an amyloid precursor of b2-microglobulin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 9, 326-331 (2002).</li>
<li>Chiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+conditions+for+in+vitro+formation+of+amyloid+protofilaments+and+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3590-3594 (1999).</li>
<li>McParland, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+Unfolded+States+of+b2-Microglobulin+and+Amyloid+Formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Partially Unfolded States of b2-Microglobulin and Amyloid Formation in vitro.</a> Biochemistry. 39, 8735-8746 (2000).</li>
<li>Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glimpse+of+a+possible+amyloidogenic+intermediate+of+transthyretin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).</li>
<li>Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH+on+aggregation+kinetics+of+the+repeat+domain+of+a+functional+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Pmel17.+Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid.</a> Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid-containing+amyloid+fibrils+potently+induce+type+I+interferon+and+stimulate+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid-containing amyloid fibrils potently induce type I interferon and stimulate systemic autoimmunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14550-14555 (2012).</li>
<li>Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NALP3+inflammasome+is+involved+in+the+innate+immune+response+to+amyloid-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β.</a> Nat. Immunol. 9, 857(2008).</li>
<li>Masters, S. L., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+amyloid+and+misfolded+protein+aggregates+activate+the+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome.</a> Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).</li>
</ol>

開示するものは何もありません。

ここで説明する方法は、選択したほぼすべてのタンパク質またはペプチドから in vitroで アミロイドフィブリルを調製するための迅速かつ柔軟な手段を提供します。タンパク質のみのフィブリル、またはDNA、RNA、またはグリコサミノグリカンを含むハイブリッド凝集体など、いくつかの異なるタイプのアミロイドを確実に調製できます。手順はシンプルで簡単で、高度な技術トレーニングは必要ありません。この方法で調製されたアミロイドは非常に安定しており、4°Cで安全に保存することも、-80°Cで長期間凍結することもできます。
アミロイドおよびアミロイド前駆体の生成を確実に成功させるための最も重要な要素の1つは、MESバッファーの適切な酸性度です。私たちの経験では、pH範囲が3〜5.5のMESバッファーは、アミロイドおよびアミロイド前駆体の成功と再現性のある調製を提供します。pH 6.5では、アミロイド前駆体を生成する効率が大幅に低下します。これは、他の以前の報告の結果と一致しています-トリフルオロエタノールを含むpH 5.5の酢酸緩衝液を使用して、ウシホスファチジル-イノシトール-3...

タンパク質は、あらゆる種類の細胞に存在する最も豊富な生体高分子です。それらは、非常に多様なサイズ、構造、および翻訳後修飾で発生し、天然の形態では膨大な範囲の重要な生物学的機能を果たします。20種類以上の異常なポリペプチドが、アルツハイマー病、パーキンソン病、2型糖尿病1-4など、多数のヒトの病理学的状態に関与しています。末端のミスフォールドタンパク質は、細胞外または細胞内で発生する不溶性の安定凝集体であるアミロイド線維として蓄積します。
特定の疾患における特定のタンパク質の意味にもかかわらず、すべてのポリペプチドがアミロイド形質転換を可能にする固有の特性を持っているという考えを支持する証拠が増えています。ゲノムワイドな配列調査により、アミロイドになりやすいフラグメントが大腸菌からヒトまでのすべてのコードペプチドセグメントの約15%を占める「アミローム」が特定されました5。したがって、近年、さまざまな重要な細胞プロセスに関与する機能性アミロイドの数がますます発見されています。例えば、細菌はアミロイドを組み立ててバイオフィルムや胞子構造を形成し、これらはその生存と病因に重要な6-9。ペプチドホルモンは、放出される前に哺乳類の分泌顆粒内に貯蔵中にアミロイド沈着物を形成し、さらに、タンパク質アミロイド型が有益な生物学的機能を果たすことができることを示唆しています6,10,11。さらに、タンパク質はアミロイド線維に集合して、重要な細胞シグナルを中継することもできる12,13。
長年にわたり、最も研究されているアミロイドは、アミロイドベータやプリオンペプチドなど、ヒトの疾患に関連する個々のペプチドから調製されています。これらのペプチドは通常、明確に定義された構造を欠いており、時間の経過とともに溶液中で自発的にアミロイドを形成しますが、これは不溶性アミロイドの前駆体として機能する部分的に誤って折り畳まれた中間体によって媒介されるプロセスです。アミロイドの前駆体は可溶性タンパク質オリゴマーとも呼ばれ、天然ペプチドから生成されるとまれで不安定です14,15。しかし、先に述べたように、原理的にはほとんどすべてのタンパク質が適切な条件下でアミロイドコンフォメーションを採用することができます。私たちは最近、さまざまな補因子の存在下で容易にアミロイドを形成する天然タンパク質の安定化可溶性オリゴマーを調製する方法を確立しました16。結果として生じるアミロイド線維は、末端タンパク質のミスフォールディング凝集体17,18の複雑な性質を反映している。ここでは、補因子を含まないタンパク質原線維を指すためにタンパク質のみのアミロイドという用語を使用し、非タンパク質成分を含む原線維を指すハイブリッドアミロイドを使用します。
これまで、高温、疎水性環境、pH変化19-23など、タンパク質のミスフォールディングに有利な条件を適用することにより、in vitroでアミロイドを生成するためのさまざまな方法が開発されてきました。ただし、それらは、低効率、可逆的な折り畳み、大きなバッチ変動、低速動力学など、さまざまな問題に関連しています。ここで説明するアプローチは、再現性があり、スケールアップが容易で、アミロイド変換のタイミングと条件を正確に制御することができます。

<table><tbody><tr><td>2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸 (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>1-エチル-3-[3-ジメチル-アミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩 (EDC)</td><td>Thermo/Pierce</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>サケ精子由来DNA</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>トルラ酵母由来RNA</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>豚腸粘膜からのヘパリン</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP152-1</td><td></td></tr><tr><td>機器:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>フィッシャーサイエンス</td><td>Isotemp 210</td><td></td></tr><tr><td>スライド・A・ライザー透析カセット</td><td>サーモ/ピアス</td><td>66380</td><td></td></tr></tbody></table>

天然のタンパク質からアミロイドの迅速な生成<em&gt;インビトロ</em

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

タンパク質は、それらの特異的な三次元フォールドの誘発機能を発揮することによって生物で重要なタスクを実行する。ポリペプチドの天然の構造は、多くの目的を果たすが、それは現在ほとんどのタンパク質は、β-シートリッチアミロイドの代替的なアセンブリを採用することができることが認識される。不溶性のアミロイド線維は、最初は複数のヒトの病気と関連しているが、それらは、ますます様々な重要な細胞プロセスに関与する官能選手として表示されます。加えて、患者の組織において沈着したアミロイドは、そのような核酸およびグリコサミノグリカン（GAG）のような非タンパク質性成分を含む。これらの補因子は、不溶性沈殿物の異なるタイプの生成をもたらす、アミロイドの形成を容易にすることができる。タンパク質は、可溶性アミロイド前駆体の中間段階を介して誤って折り畳ま方法我々の理解を活用することにより、我々は、in vitroでアミロイド原繊維への天然タンパク質に変換する方法を考案した</EM&gt;。このアプローチは、一つは、大量のアミロ​​イドの準備特定のタンパク質から生成されるアミロイドのプロパティを調べ、変換に伴う構造変化を評価することができます。

天然タンパク質を直接アミロイドに変換できる能力は、MESバッファー中の高温状態で引き起こされる構造変化に依存しています。溶液中の沈殿は、タンパク質の凝集およびアミロイド形成が起こったことを示す良好な指標となります。一方、可溶性タンパク質オリゴマーを安定化させるために、EDCを用いてタンパク質を架橋し、MESバッファーで誘導されたオリゴマー構造を固定します。その結果、安定化されたタンパク質オリゴマーはマルチマータンパク質となり（図1）、SDS-PAGEで分離した際に、単量体の天然タンパク質や熱誘導凝集体とは明確に区別されます。
安定化された可溶性タンパク質オリゴマーは溶液中で安定しているため、共因子によるアミロイドへの変換を、バッファー条件、タンパク質と共因子の相対比、その他のパラメータを制御しながら、都合の良い方法で別途行うことができます。オリゴマーからアミロイドへの変換プロセスは急速に進行するため、核酸やGAGと混合してから数分以内に不溶性沈殿が形成されても驚く必要はありません。安定化された可溶性タンパク質オリゴマーの品質を確認するために、いくつ...

タンパク質は、天然構造を採用するか、不溶性アミロイドに誤って折り畳まれる可能性があります。ミスフォールディング経路に有利な条件は、さまざまな種類のアミロイド線維の形成につながります。ここで説明する方法は、in vitroで天然タンパク質をアミロイドに迅速に変換することを可能にします。

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

次の実験の全体的な目標は、in vitroで任意のタンパク質からアミロイドフィを迅速に取得することです。これは、選択したタンパク質をMESバッファーに溶解して構造のミスフォールディングを誘導することで達成されます。その後、タンパク質を高温でインキュベートすることができ、他の補因子がない状態でアミロイドの形成を促進します。あるいは、タンパク質をEDCによって架橋して、アミロイドの前駆体である安定化された可溶性タンパク質靭帯を生成します。最後に、非タンパク質補因子を安定化された可溶性タンパク質オリゴマーと混合してハイブリッドアミロイドの形成を可能にする結果が得られ、好ましい条件によって促進されると、天然タンパク質が容易にアミロイド確認に変換できることを示す結果が得られます。この方法は、可溶性タンパク質オリゴマーからアミロイドがどの程度正確に形成されるか、異なるタイプのアミロイドが明確な生物学的および病理学的機能を持っているかどうかなど、タンパク質のミスフォールディング疾患における重要な質問に答えるのに役立ちます。まず、タンパク質のみのアミロイドおよび安定化可溶性タンパク質の両方について、テキストプロトコールに記載されているようにMESバッファーを調製します。次に、すべての靭帯で選択したタンパク質を秤量し、MESバッファーで1ミリグラム/ミリリットルに再構成します。このデモンストレーションでは、ヒト血清アルブミンまたはHSAを使用し、溶液を摂氏65度で水浴中で4時間インキュベートします。期間の終わりまでに、溶液中に白い沈殿物が見えます。サンプルを体積あたり10%の量で中和します。T tris、HCLは、透析カセットでタンパク質を一晩透析し、目的のバッファーに交換します。さらなる分析のために、これらの手順に従って、熱沈殿せずに天然タンパク質のコントロールサンプルを調製します。安定化された可溶性タンパク質を調製するために、すべての靭帯は選択したタンパク質の重量を量り、それを1ミリグラムあたり1ミリグラム/ミリリットルに再構成します。MESバッファーに、タンパク質溶液を室温で15分間放置します。MESバッファーに1ミリリットルあたり20ミリグラムのEDCを新たに調製します。タンパク質とEDC溶液を2〜5個の割合で混合し、インキュベーション後2時間室温でインキュベートします。トリスHCLの容量あたり10%の容量でサンプルを中和し、透析カセットでタンパク質を一晩透析して、目的のバッファーに交換します。さらなる分析のため。安定化された可溶性タンパク質全靭帯を摂氏4度で最大4週間保存します。この懸濁液は、アミロイドを含む DNA とアミロイドを含む RNA の両方を調製するためのハイブリッド アミロイドを調製するために使用されます。核酸と安定化した可溶性タンパク質を全て靭帯とを

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶ天然タンパク質からアミロイドを迅速に生成する方法。MESバッファーと高温処理、EDC架橋を用いてタンパク質ミスフォールディングを誘導し、ハイブリッドアミロイド形成のメカニズムを解明します。

天然のタンパク質からアミロイドの迅速な生成

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