Name: NF-κB依存性神経新生の調節および分析のための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-13T23:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: 学ぶNF-κB依存性神経新生の調節法。マウスを用いた空間パターン分離Barnes迷路行動テストと組織学的解析により、歯状回依存性学習と構造変化の相関を解明する手法を紹介します。

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私たちは、優れた技術サポートを受けるにはアンジェラKralemann - ケーラーに感謝します。ここに記載された実験の仕事は、私たちの研究室で実施し、CKとBKとBKの研究教育のドイツ省（BMBF）の付与にドイツの研究評議会（DFG）の補助金によって支えられている。

倫理声明この研究は、政府の動物ケア使用委員会、国家ノルトライン=ヴェストファーレン州（デュッセルドルフ、ドイツ）のLANUVの規定に厳密に従って行った。すべての動物実験は、ライセンス番号8.87-51.04.20.09.317（LANUV、NRW）の下でLANUV、デュッセルドルフによって承認された。すべての努力は、苦痛および研究に必要な動物の数を最小限にするために行われた。 1。動物実験住宅<ol><li>フェデレーション欧州実験動物学会（FELASA）によって定義されるように本明細書に記載されたプロトコルで使用されるすべての動物は、特定病原体フリー条件下で維持されるべきである。 </li><li> HEPA空気を濾過したマウスは、昼行性の条件（12時間の明/暗サイクル）の下で、温度と湿度が管理（22℃）の部屋で、標準のケージに維持されるべきである。 </li><li>標準化された食品や水は自由に与えなければならない。&lt;/李&gt; <li> IκB/ tTAをし、IκB/ IF -対照マウスが使用されている7、18で説明したように、PCRベースの遺伝子型判定は、各動物のために行われるべきである。 </li><li>より小さい四日間の年齢差を有する雄の動物は、個々の変動性を減少させるために使用されるべきである。 </li><li> （オプション）：NF-κBの活性化​​実験のために、ドキシサイクリンは、少なくとも14日間（2.5％スクロースとの2 mg / ml）を飲料水に投与しなければならない。 </li></ol> 2。空間パターン分離バーンズ迷路（SPS-BM） <ol><li>すべての行動試験は、国際的、地域ガイドラインに従って行われるべきである。 </li><li>重要！ 6カ月以上の年齢によってのみ雄マウスを使用してください。 1試験シリーズの動物の間の年齢差が4日以上でなければなりません。テストでは、各シリーズの同じオペレータが行う必要があります。マウスは、さらに部分的になどによって駆動モチベーションを高めるために、試験前に標準的な食事を受けるべきであるウィート食品の報酬。 </li><li>硬質プラスチックから作られた白い円板を設定し、少なくとも4×80 Wおよび3×215 Wネオン蛍光灯で照明された湿度および温度制御された部屋（22℃）、中（直径120センチメートルは、 図5Aを参照してください） 。重要！マウスのモチベーションを部分的に明るく、当たる場所への嫌悪によって駆動され、食品の家に入るよう、正しい照明が使用されていることを確認してください。 </li><li>ビデオ·トラッキング·システムを設定します。カメラは、115センチメートル板の中心（ 図5A参照 ）の上方に配置されるべきである。 </li><li>動物のための見やすい位置にある白色の布、プレートの国境から約100センチメートル（ 図5Aを参照）にマルチカラーの余分な迷路の手がかり（EMC）を取り付けます。 </li><li>慎重に実験の設定から任意の臭いを除去することができ、急速消毒剤でプレートを清掃してください。 </li><li> 7同一の黄色い食糧家を配置（12センチ×7センチメートル×8センチ、 図5（a）参照 </白板に強い&gt;）。位置は（ 図5Aを参照）明確にマークする必要があります。 </li><li>一つだけ定義されている食品の家は動物に自由にアクセス可能で（ 図5Aを参照）に定義された位置でのすべての食品の家の中に甘い食べ物ペレットの報酬（Kellogs `sのフルート教授のループ/食品住宅の4分の1）を配置（位置F、 図5（a）参照 ）。透明ホイルで非対象食品の家を閉じます。 </li><li>試験の前に、（作業を開始する前に1日）馴化を行ってください。すべての食品の家が自由にアクセスできるようにし、マウスは自由に迷路を探索する、食品ペレットの報酬（10分/動物）を取得することができます。 </li><li>上のコンピュータとカメラを切り替えて、ビデオ·トラッキング·システム·ソフトウェアを起動します。 </li><li>録音を開始します。 </li><li>円板上の定義された開始点（ 図5（a）、S：スタート位置）で動物を置き、マウスは10分間、対象食品のペンションを検索できます。 </li><li> STOPビデオ追跡。 </li><li>重要！迅速な消毒剤で、各試行の後に円板や食品の家をきれいにしてください。 </li><li> （各動物用）7日間連続して毎日テストを繰り返します。 </li><li>適切な統計ソフトウェアを使用して結果（レイテンシ、距離覆われており、エラー）を分析します。間違った食糧の家および/または入ると食品ペレットの報酬を取得せずに、適切なボックスに接触に近づくようにエラーを定義します。グループ化された分析のためのボンフェローニ事後検定を二元配置分散分析を使用しています。 </li><li> （オプション）マウスを屠殺し、後述のように海馬を分析。 </li></ol> 3。 BrdU標識<ol><li> 3日間（分化と統合の分析​​）、または単回注射用200 mg / kgのIP（増殖の分析）のために腹腔内に50 mg / kgの腹腔内にBrdU一日一回注射する。 </li><li>動物を犠牲に、海馬を解剖し、以下に説明するように40μmの切片を作製。 </li><li>変性さ10分間、2 M HClでセクションと、10分間、0.1 Mホウ酸緩衝液中でインキュベートする。 </li><li> BrdUのに対して向けられた抗体を用いて以下に説明するように、免疫組織化学的に各動物から40μmの切片（離れて240ミクロ​​ン）の1·イン·12シリーズにラベルを付けます。 </li><li>顆粒細胞層と下帯の体軸方向の程度を通して、共焦点顕微鏡分析によって標識された細胞を定量化する。 DGあたりの標識細胞の合計数を取得するために2によって海馬および除算ごとのBrdU標識細胞の推定総数を取得するために12で生じた数値を掛けます。 </li></ol> 4。かん流されない動物の脳や凍結切片の調製の除去<ol><li>動物を安楽死させるためのローカルで承認された手順に従ってください。マウスは、直接頸椎脱臼により安楽死させてもよい。 </li><li> （オプション）動物は、腹腔内麟蹄するなど 、地元および国際的なガイドラインに従って安楽死の前に麻酔をすることができます（新たに生理食塩水または生理緩衝の1.85ミリリットルと2.2 mgの2,2,2 - トリブロモイソアミルエタノール1ミリリットル中で作られた150ミリリットルの原液を混合した）33グラムのマウス用の0.8ミリリットルアベルチンのction。 </li><li>ベタジンその後70％エタノールに浸したガーゼで（10％ポビドンヨード）に浸したガーゼや綿棒でヘッドを殺菌。 </li><li>適切な外科はさみを用いて動物を首、脇の皮膚を引っ張る。 </li><li> （オプション）固定器は、バック遅滞皮膚の折り畳みを避けるために適用することができます。 </li><li>頭蓋骨に正中切開を行い、慎重に脇頭蓋骨の断片を引っ張る。 </li><li>慎重に適切な外科手術用器具（ 例えばモリアスプーン）を使用して脳全体を削除します。 </li><li>ドライアイス上で-30〜-40℃〜50ミリリットルのビーカー（ 例えばショットデュラン）中の2 -メチルブタンの予冷25ミリリットル。 注：理想的に共焦点レーザー走査顕微鏡に適して「厚い」のセクションのフリーフローティング染色のために、脳を取り外し、3を洗う脳が（通常は一晩）下まで沈んするまで、リン酸、4℃でバッファとストア内の時間は、50ミリリットルチューブに30％ショ糖溶液をバッファリング。 </li><li>慎重にNescofilm（パラ）の一部に脳を置き、TissueTek OCT化合物の十分な量でカバーし、使用するまで-80℃で2 - メチルブタン、店舗でNescofilmに凍結する。 注：22.9％スクロース、7のMgCl 2、50 mMリン酸緩衝液、44％グリセロール中で-20℃店で長期保存してください。 </li><li>適切なクライオ上の10から12ミクロン厚の切片に脳をカット。 注：厚い、フリーフローティングのセクションでは、（ 例えばライヘルトユング、Frigomobil。）と-20℃で40μmの水平部分をカットし、適切なクライオトームのクライオトームステージに脳を凍結- 25℃、細かいブラシでナイフからのセクションを収集し、バッファに収集したり、長期保存のために-20℃でストレージ·ソリューション（ステップ4.9）で保管してください。 </li><li>慎重に、単一の顕微鏡スライド上で2のスライスをマウントします。私達スーパーフロストUltraPlusスライドのEは、高度のセクションの接着性を最大化することをお勧めします。 </li><li>室温で5分間、スライドを乾燥させる。スライドは、使用するまで-80℃で保存することができる。 </li></ol> 5。灌流動物からの切片の調製<ol><li> （ステップ4.2）、上記のような動物を麻酔。 </li><li> 10〜15分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド、続いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）2-4分間ヘパリン（0.025溶け溶液PBS）およびプロカイン（0.5g/100mlにPBS）を含む、で経動物を注意深くを潅流。灌流を最適約1.2〜1.4メートルまたは約15 ml /分に設定した蠕動ポンプを利用する静水圧を用いて左心室と右心房の開口部を介して灌流することにより行われる。赤い血管が見えないように構成されている淡い白、脳内の最適な灌流の結果。 </li><li>解剖と24時間4℃で4％パラホルムアルデヒド中の脳をポスト修正。 </li><li>クライオ少なくとも24時間、4℃でPBS中30％スクロース中に脳を保護します。 </li><li>クライオトームステージ上で脳を凍結する。 </li><li>適切なクライオトームを使用して、全前脳から40μmの横切片を作製。 </li><li>スライドは-20℃で使用するまで凍結保護物質溶液（0.1 Mリン酸緩衝液、50％グリセロール、0.14％の塩化マグネシウム、8.6％スクロース）に格納することができる。 </li></ol> 6。かん流されない動物の脳切片の免疫組織化学<ol><li> 10分間、-20℃の冷メタノールを用いて、上記のように調製した凍結切片を後固定する。 </li><li> 4℃で一晩（二次抗体を上昇させるために使用した種から）、0.3％トリトン-Xを含む5％正常血清でブロックし</li><li> 1X PBSで3回洗浄し、4℃で一晩一次抗体でインキュベート</li><li> 1×PBSで3回すすぎ、室温で1時間二次抗体とともにインキュベートする。 </li><li> 1X PBSで3回すすぎ</li><li>カップSYTOXグリーン、またはDAPI（または代替DNA色素）を用いてDNAの項nterstain。 </li><li> 1X PBSで3回すすぎ</li><li>水埋媒体中でのセクションを埋め込む。 </li><li>包埋剤は、少なくとも48時間重合してみましょう。 </li></ol> 7。灌流動物の脳切片の免疫組織化学<ol><li>ステップ6.2に記載し、続いて4℃で一晩、0.3％トリトン-X（浮遊）を含有するPBSで希釈した一次抗体溶液中で固定した脳切片をインキュベートするように、ブロック</li><li> 1×PBSで3回すすぎ、3時間室温で0.3％トリトン-X（フリーフローティング）を含有するPBS中に希釈した二次抗体溶液中でインキュベートする。 </li><li> 1X PBSで3回すすぎ</li><li>緑またはDAPI SYTOX（または代替DNA色素）を用いてDNAのセクションを対比染色。 </li><li> 1×PBSで3回すすぎ</li><li>水埋媒体中でのセクションを埋め込む。 </li><li>包埋剤が探し重合してみましょうT少なくとも48時間。 </li></ol> 8。苔状線維投影の調査<ol><li> 、動物を犠牲に上記のように40μmの冠状切片を作製し、神経フィラメントMのための抗体を用いて、海馬部分を染色</li><li>苔状線維および核を可視化するために、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて適切な波長でのセクションをスキャンしてください。低倍率でスキャンを開始します。 </li><li>オリエンテーションのための低倍率の画像を使用し、苔状線維突起海馬を対象としています。 </li><li>高解像度、高倍率でのセクション（Z-切片）をスキャンします。 </li><li> NF-Mの染色を通して可視化苔状線維の形態学的な外観と接続性を分析します。 </li><li> （オプション）海馬のブレードのサイズとボリュームを分析します。測定のためのDNAの信号を使用してください。 </li></ol> 9。フルオロジェイドCアッセイ（神経細胞死） <ol><li>動物を犠牲に、海馬を解剖ampus、そして前述のように12μmの切片を作製。 </li><li>切片を室温で30分間乾燥させます。 </li><li>室温で40分間、4％PFA中のセクションを修正します。 </li><li>簡単に言うのセクションでは、蒸留H 2 Oで3回洗浄</li><li>連続、穏やかに振盪下に10分間0.06％の過マンガン酸カリウム（KMnO 4）を持つセクションをインキュベートします。 </li><li>のセクションでは、蒸留H 2 Oで3回洗う</li><li>室温で20分間、0.002％フルオロ - ジェイドC溶液で切片をインキュベートする。 </li><li> （オプション）の同時核染色のために、0.002％フルオロジェイドC溶液10μg/ mlのDAPIで補うことができる。 </li><li>簡単に言うのセクションでは、蒸留H 2 Oで3回洗浄</li><li>切片を室温で30分間乾燥させます。 </li><li>キシレンで切片をインキュベートし（1分） </li><li>キシレン系封入剤（DPX）を使用してセクションをマウントします。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、利害関係のないことを宣言します。

ドキシサイクリンを経由して、成人の神経発生、および神経細胞におけるNF-κBの阻害を介して、その操作の可能性、およびそれ以降の再活性化、成人の脳内だけでなく、神経細胞の脱·再世代に新生ニューロンの調査のための魅力的なシステムを提供しています。このシステムの美しさはある神経細胞死、前駆細胞の増殖や遊走、および重度の構造的および解剖学的変化だけでなく、明らかな学習欠陥の変化のニューロンの結果だけでなく、中のNF-κBシグナル伝達経路阻害。重要なのは、IκB/ tTAを動物の表現型は、実験的にドキシサイクリンを投与した後に反転して救出することができます。この表現型の復帰が構造的側面 ​​を含み、またDG-2依存性の学習の有意な改善をもたらすことができる。 行動実験のための解釈可能な結果を​​確保するためには、重要であること、年齢のdiffereでのみ雄動物未満4日のNCEを使用すること。さらに、すべての試験シリーズは、同一のオペレータによって行われるべきである。試験室に関しては、我々は強く、ストレスと外部のノイズ源から生じる注意の損失を避けるために音響的に絶縁された...

存在論的に、海馬は既知の最古の解剖学的な脳構造の1つである。このような長期記憶、空間的な向き、及びそれぞれのメモリの形成及び連結の調節において中心的な機能などの多様な複雑なタスクを担当する。解剖学的に、海馬はその下帯内の顆粒細胞といくつかの神経細胞の前駆細胞が含まれているアンモン角（CA1、CA2、CA3、およびCA4）領域と歯状回（ 歯状回 ）、などの錐体細胞層（ 角質錐体 ）で構成されています。顆粒細胞は、いわゆる苔状繊維（顆粒細胞の軸索）を介して、CA3領域に向かって突出する。 前世紀の終わりまで、大人の哺乳類の脳は、細胞の可塑性と神経新生を欠い静的臓器であると考えられていた。しかし、最後の二十年の間に、証拠の成長量が明確に行われている成人の神経発生を実証する、少なくとも2脳領域、脳室下帯（SVZ）および海馬の下帯。 我々の以前の研究で、他のグループのものは、転写因子NF-κBは、成人の神経発生の重要な分子調節因子の一つであり、深刻な構造的な海馬欠陥や認知障害1-6年の規制緩和の結果ということが示されている。 NF-κBは5 DNA結合サブユニットの異なる二量体の組み合わせで構成される誘導性転写因子の総称です。P50、P52、C-REL、RELB、およびp65（RelAの）、後者の3つはトランス活性化ドメインを持っている。脳内では、細胞質に見られる最も豊富な形態は、カッパB（IκB）タンパク質の阻害剤によって不活性型で保持されているp50およびp65のヘテロ二量です。 NF-κB駆動型の神経発生を研究し、直接操作するために、我々は、NF-κB活性subunのすべての単純な抑制を可能にするトランスジェニックマウスモデルを使用その、前脳特異7（ 図1参照）。この目的のために、我々は次のトランスジェニックマウス系統交雑、IκB/ - と-/tTA。トランスジェニックIκB/ -ラインは、NF-κB阻害剤IκBa（スーパーリプレッサーIκBa-AA1）のトランスドミナントネガティブ変異体を使用して生成された8。野生型IκBαとは対照的に、IκBα-AA1は、阻害剤のリン酸化およびそれに続くプロテアソーム分解を妨げるアラニン（V32及びV36）に変異2つのセリン残基を有する。 IκBa-AA1-ジーンの前脳ニューロン特異的発現のためには、IκB/ - マウスは、マウスは、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼを保有するとのクロス交配したIIαテトラサイクリントランス活性化因子（TTA）で駆動することができる（CAMKIIα） - プロモーター9。 P65ノックアウトマウスは、大量の肝アポトーシス10に、胚致死表現型を持っているので、ここに示されているアプローチは、エレガントな方法を提供し、出生後および成体の神経発生におけるNF-κBの役割を調査するため。 空間学習と記憶を研究するための古典的な行動試験はリチャード·モリス、モリス水迷路（MWM）11として知られている試験で、1980に記載された。このオープンフィールド水迷路では、動物は向きや余分な迷路の手がかりをもとに、隠されたプラットフォーム上に不透明な水から脱出することを学ぶ。 MWMの乾燥変種は、いわゆるバーンズ迷路（BM）12である。このテストでは、1エスケープボックスとして定義されている穴、および方向のための視覚的な余分な迷路の手がかりと、プレートの境界に配置された20円形の穴が円形プレートを利用しています。両方の実験パラダイムは、げっ歯類の `sの水への嫌悪感、またはオープン、明るく照らさスペースによって誘導された飛行挙動に依存しています。両方のテストは、空間的方向の調査、および関連のメモリの性能を可能にします。海馬は、空間的記憶形成における一般的な必要不可欠な役割を果たしているが、海馬rを関与egionsが適用テストによって異なります。 BMでテストメモリはenthorinal皮質（EC）と、DG 13〜16の寄与なしに、海馬のCA1領域に位置する錐体ニューロン間の神経活動から生じる。具体的には、古典的なBMが主に重要なのは、DGが決定的の処理だけでなく、意味、いわゆる空間的パターン認識17、に関与しているEC IIIからのCA1に、EC Vの単シナプス側頭アンモニアの経路を介してナビゲーションに依存しています視覚と空間情報だけでなく、非類似、重複しない表現に類似した表現やメモリの転換。このタスクは、BM 15でテストすることができない機能的なトライシナプスのEC IIからのDGにCA3とCA1に回路とECのVIを、必要とします。 これらの課題に対処するために、我々は、特に共同での歯状回依存認知能力をテストするための行動試験として、SPS-BMを考案したntrol動物、およびNF-κB活性阻害後、IκB/ tTAは、スーパーリプレッサーモデルで。重要なのは、MWMまたはBMとは対照的に、SPS-BMが神経発生の障害に起因する微妙な行動障害を明らかにすることができます。空間パターン分離がEC IIおよびDGおよびCA3とCA1とEC VI間の機能回路に厳密に依存するので、このテストでは、内の潜在的な神経新生の変化、苔状線維経路の変更や組織の恒常性の変化がに非常に敏感であるDG。 技術的には、我々のテストのセットアップはクレランドらの研究に基づいています。、空間的な分離パターンが木造8アーム放射状迷路（RAM）19を使用して試験された。私たちの修正されたセットアップでは、8本のアームは7同一の黄色の食品の家に置き換えられました。要約すると、これらの方法は、ダブルコルチンを発現する海馬内（DCX +）細胞、苔状線維投射、神経細胞ドの分析を含め、ここに示されている第a、特にSPS-BMは、ここに提示、成体神経新生に影響を与える遺伝子を組み込んだ他のマウスモデルの研究に適用することができる。さらにアプリケーションは、薬理学的物質の研究とDGと空間パターン分離への影響を測定するを含むことができる。

<table><tbody><tr><td>モリア MC17 パンチングスプーン&nbsp;</td><td>FST</td><td>10370-18</td><td>脳の除去解</td></tr><tr><td>剖顕微鏡</td>Carl <td>Zeiss</td><td>Stemi SV8</td><td>脳の除去</td></tr><tr><td>手術用ハサミ&nbsp;</td><td>FST</td><td>14084-08</td><td>脳の除去外科</td></tr><tr><td>用ハサミ&nbsp;</td><td>FST</td><td>14381-43</td><td>脳の除去</td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>脳の除去</td></tr><tr><td>SuperFrost スライド</td><td>カール・ロス</td><td>1879</td><td>免疫組織化学用スライド</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>固定剤</td></tr><tr><td>TissueTek OCT 化合物</td><td>Sakura Finetek</td><td>脳</td><td>の埋め込み1004200018</td></tr><tr><td>正常なヤギ</td><td>血清 Jackson Immunolabs</td><td>005-000-001</td><td>IHCのブロッキング</td></tr><tr><td>正常なウサギ</td>血清<td>Jackson Immunolabs</td><td>011-000-001</td><td></td></tr><tr><td>IHCのブロッキング 正常なロバ</td>血清<td>Jackson Immunolabs</td><td>017-000-001</td><td>IHC</td></tr><tr><td>抗ニューロフィラメント-M抗体</td><td>のブロッキング Developmental Studies ハイブリドーマバンク</td><td>2H3</td><td>IHC、希釈 1:200</td></tr><tr><td>反ダブルコーチン&nbsp;抗体</td><td>sc-8066</td><td>Santa Cruz</td><td>IHC, 希釈率 1:800</td></tr><tr><td>抗GFP抗体</td><td>アブカム</td><td>ab290</td><td>IHC, 希釈率 1:2,000</td></tr><tr><td>抗BrdU抗体</td><td>OBT0030G</td><td>Accurate Chemicals</td><td>IHC, 希釈率 1:2,000&nbsp;</td></tr><tr><td>フルオロジェイドC</td><td>FJ-C</td><td>HistoChem</td><td>ニューロン細胞死の測定</td></tr><tr><td>ベタジン</td><td>・ムンディファーマ</td><td>D08AG02</td><td>消毒剤</td></tr><tr><td>クライオミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>CM1900</td><td>脳スライスの調製</td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム塩</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>H3393</td><td>灌流</td></tr><tr><td>硬質プラスチック(直径120cm)から作られた円形プレート</td> <td>ラボ製</td><td></td><td>SPS-BM用プレートなし、直径120cm</td></tr><tr><td>ブラトン迅速消毒剤&nbsp;</td><td>Sch&uuml;lke Mayr</td><td>113 911</td>消毒<td>剤</td></tr><tr><td>ソフトウェアパッケージVideoMot2付きTSE VideoMot 2</td><td>TSEシステム</td><td>302050-SW-KITSPS-BM</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100の追跡と分析&nbsp;</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T8787</td><td>透過化/ IHC</td></tr><tr><td>クライ</td><td>オートームライヒェントユング/ライカ</td><td>フリゴモービル12064</td><td>の40&microの準備;m brain slices</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Carl Roth</td><td>Art.-Nr. 0713</td><td>embedding of the slides</td></tr><tr><td>SYTOX green</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td>核染色</td></tr><tr><td>食品ペレット (Kellog's Froot Loops)</td><td>Kellog's</td><td></td><td>SPS-BM</td></tr><tr><td>Prism, Version 3.0</td><td>Graph Pad Software, San Diego, USA</td><td></td><td>SPS-BM</td></tr><tr><td>Zen 2008 または Zen 2011 ソフトウェアの</td>統計的評価<td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Software(共焦点顕微鏡)</td></tr><tr><td>D.P.X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>317616</td><td>Fluoro-Jade C染色用封入剤</td></tr></tbody></table>

nf-κb依存性神経新生の調節および分析のための方法

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

海馬はエピソード記憶の形成及び連結の範囲に極めて重要な役割を果たしており、空間的な向きで。歴史的には、成人の海馬は、哺乳類の脳の非常に静的な解剖学的領域として見てきた。しかし、最近の調査結果は、海馬の歯状回は、既存の神経回路の修正だけでなく、大人の神経新生のみならずを含む、成人では驚異的な可塑性の領域であることを実証した。この可塑性は、転写因子NF-κBの顕著な役割を果たしている、複雑な転写ネットワークによって調節される。大人の神経新生を研究し、操作するには、NF-κB活性の前脳特異的なニューロン抑制のためのトランスジェニックマウスモデルを使用することができます。 本研究では、これらの方法は、whic、その構造的側面を含む、NF-κB依存性の神経発生、神経細胞アポトーシスおよび前駆細胞増殖、および認知的意義の解析のために説明されているHは、特に歯状回（DG）依存性行動試験、空間パターン分離バーンズ迷路（SPS-BM）を経由して評価した。 SPS-BMプロトコルは単に成人海馬神経新生上の特定の遺伝子の影響を評価するために設計された他のトランスジェニック動物モデルでの使用に適合させることができる。さらに、SPS-BMは、薬理学的薬剤を用いて、例えば、DG-依存性の学習を調査し、操作することを目的とした他の実験設定において使用することができる。

IκB/の異種交配-とのtTAトランスジェニックマウス系統は、海馬におけるNF-κB活性の条件付抑制につながる。 二重トランスジェニックマウス（ 図1A）におけるIκBα-AA1-導入遺伝子の発現を調べるために、脳を単離し、凍結切片およびGFP（緑色蛍光タンパク質）に対する抗体を用いて染色した。共焦点レーザー走査顕微鏡はCA1及びCA3領域において、及びDG（ 図1B）における導入遺伝子の高い発現を明らかにした。 IκBα-AA1-導入遺伝子は、タイプ-2B前駆細胞に発現しており、中間の未熟の状態で、成熟顆粒細胞中でアクティブになっているされている。 海馬神経形成領域でCAMKIIα駆動型IκBα-AA1を表現する最も初期の細胞の種類を確認するには、IκB/ tTAを動物からの海馬の凍結切片をダブルコルチンについて染色した（DCX）および導入遺伝子（GFP）。共焦点解析はCAM...

NF-κB依存性の成人の海馬の神経新生の操作および分析するための方法が説明されています。詳細なプロトコルは、マウスでの認知転帰の調査のための歯状回依存行動試験（空間パターン分離バーンズ迷路と呼ばれる）のために提示されている。この技術は、他の実験設定での調査を可能に役立ちます。

NF-κB依存性神経新生の調節および分析のための方法

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

この手順の全体的な目標は、成人の脳における転写因子NFκBの機能を調査することです。これは、ニューロンのNFκB活性を特異的に阻害するトランスジェニックマウスを最初に育種することによって達成されます。手順の2番目のステップは、空間パターン、分離または納屋、迷路を使用して、NFκB阻害の行動結果をテストすることです。3番目のステップは、動物を慎重に豊富に育て、脳を取り除き、その適切な切片化です。最後のステップは、免疫染色による苔状線維の突起の視覚化など、組織学的および構造的影響の解析です。最終的には、行動テストとそれに続く組織学を使用することで、歯状回依存性学習の変化と関連組織の構造変化を関連付けることができます。火星の花瓶のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、空間パターン分離結合MAが、この脳領域における反子供依存学習プロセスや神経変性および再生を具体的に測定する機会を提供することです。この方法は、特別なパターン分離としての学習など、成人のニューロン新生の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。迷路のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるAngela Kulaが行います。灌流は、研究員のピーター・ハイマンが発表します。その後、脳の切片化がウルリッヒKA技術者によって示されます。そして最後に、共焦点走査型顕微鏡は、私の研究室の博士課程の学生であるJeanine Muahによって発表されます。バーンズ迷路国際および地域のガイドラインに従った行動テスト。このアッセイでは、生後6か月以上の雄マウスのみを使用することが重要です。各試験シリーズでは、動物は生後4日以内である必要があり、同じオペレーターが試験前にすべての試験を実施する必要があります。マウスには標準的な食事を与えて、甘い食べ物にやる気を起こさせる必要があります。最初にテストを設定するには、硬質プラスチックで作られた直径120センチメートルの白いプレートを入手します。追加の迷路の手がかりは、さまざまな素材で作成でき、さまざまな形状を持つことができます。重要なのは、動物の走行輪がはっきりと認識するためには、コントラストが高くなければならないということです。はしごやトンネルはすべて良い手がかりです。適度に強いいくつかのネオン蛍光灯の下にプレートを配置して、マウスが光から逃れるように動機付けます。部屋は湿度が管理され、摂氏22度に一定でなければなりません。次に、ビデオ追跡システムを設定します。カメラをプレートの中心から115センチ上に配置します。次に、プレートに合う白い色の布に、色とりどりの追加の迷路の手がかりを取り付けます。動物が見やすいように、布の中央近くに配置します。次に、実験セットアップから臭いを取り除くことができる迅速な消毒剤でプレートを慎重に清掃します。白い皿に7つの同一の黄色のフードハウスを配置します。それらの位置は、テストを開始する1日前に明確にマークされ、各マウスをディスクに慣れさせる必要があります。居住試験のために、7つの食料の家のそれぞれに四分の一の果物のループのような甘い食べ物のペレットの報酬を配置します。各マウスをプレートの始点に置き、10分間探索します。この探索をマウス間で記録します。円形のプレートとフードハウスを迅速な消毒剤で清掃します。また、食べ物の報酬を補充します。次の 7 日間連続して、テストのテスト試行を実行します。実験全体を通して、1軒を除くすべての家は透明なテープで閉じられています。いつも同じ家です。各家にはまだ報酬がロードされており、テストは慣れ試行のように実行されます。概日リズムの変動を避けるために、各動物について同じ時間にテストを実行します。後で、適切な統計を使用して、遅延、カバーされる距離、およびエラーを分析します。ソフトウェアは、エラーを間違った食品ハウスに近づくか、適切なボックスに接触したが、入って報酬を取り戻さなかったと定義しています。グループを比較するには、二元配置分散分析とボンファー事後検定を使用します。ベルチンの腹腔間注射で動物に麻酔をかけた後、ヘパリンとプロパンを含むPBSで慎重に経的に灌流します。.26ゲージの針を使用して左心室に穴を開けます。また、右心房に切り込みを入れて、血液と灌流8が流れ出るようにします。灌流針を穴の左心室にまっすぐな角度で、1〜2ミリメートルの深さまで挿入します。1.2〜1.4メートルの静水圧を使用し、マウスを2〜4分間灌流します。ヘパリンとプロパンをPBS中の4%パラアルデヒドで10〜15分間追跡します。灌流は毎分15ミリリットルの速度であるべきです。次に、脳を解剖します。それは目に見える赤い血管がない淡い白でなければなりません。採取したすべての脳を4%パラホルムアルデヒドに摂氏4度で24時間固定します。翌日。クライオは、PBSの30%スクロースで脳を保護し、少なくとも24時間後に摂氏4度で保存します。脳はクライオトーンステージで凍結され、厚さ40ミクロンの水平セクションにスライスされます。切片をニューロフィラメントMの抗体で染色した後、蛍光抗体に適した波長の共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して、苔状線維の突起を視覚化できます。低倍率でスキャンを開始し、海馬と苔状繊維の突起に向きを変えます。次に、高倍率で、苔状線維の高解像度C切片スキャンを収集して分析し、I kappa B alpha AA one導入遺伝子の発現を調査します。ダブルトランスジェニックマウスの脳を単離し、クライオ切片化し、GFP共焦点レーザースキャンに対する抗体を用いて染色した。顕微鏡検査により、CA 1領域、CA 3領域、およびDGで導入遺伝子の高発現が明らかになり、海馬神経原性領域でCAMK 2 α drivenI、kappa B、alpha AA oneを発現する最も初期の細胞タイプが特定されました。I Kappa BTTAのカバカンピのクライオセクション。動物をダブルコートチンで染色し、導入遺伝子共焦点分析により、CAMK 2α活性による導入遺伝子の発現の誘導を示す矢印で示された若いDCX陽性顆粒細胞におけるGFPシグナルが明らかになりました。i kappa BTTAマウスとi Kappa Bマウスの海馬の冠状切片をニューロフィラメントMで染色し、苔状線維の突起を可視化し、I kappa BTTAマウスの複雑で水疱性の組織を明らかにしました。苔むした繊維の突起はひどく損なわれていました。さらに、NF κ B 阻害により、スペラルブレードの厚さが大幅に減少し、DG 体積が小さくなり、劇的な構造欠陥の潜在的な理由が研究されました。コントロールマウスとI kappa BTTAマウスからの新鮮な未固定の海馬スライスをフルオロジェイドCで染色し、ニューロン細胞死の特異的検出を可能にしました。劇的に増加した変性神経突起の数は、単一のトランスジェニックコントロールと比較して、ダブルトランスジェニック動物で観察されました。さらに、3つの陽性細胞の切断されたcapaceの有意な増加がI kappa BTTAマウスで検出されました。対照的に、DCXに対する免疫組織化学的染色では、I kappa BTマウスの脳内のDCX陽性細胞の量が有意に増加していることが明らかになりました。さらに、I kappa B TTA hippo Campiのd CX陽性細胞は、亜顆粒帯のみに配列されたのではなく、dgのより深い領域にも見られました。一方、対照動物のD CX陽性前駆細胞は、ほぼ独占的に亜顆粒帯内に局在していました。DCX発現細胞の増加量を試験することは、初期の前駆細胞の成熟の結果であるか、または直接的にDCX陽性細胞の増殖によるものであった。BRDUをi kappa BTTAとコントロールマウスの腹腔内注射し、その後、増殖の分析のためにDCXとBRDUで凍結切片化および染色しました。BRDU は 1 回注入され、24 時間後に分析が行われました。分化の解析のために、毎日3回の注射を行い、続いてBRDUの1回の注射から7日後に解析を行いました。I kappa BTTA陰性動物と対照動物との間のBRDU陽性細胞の総数に有意差は観察されなかった。対照的に、3回の連続注射アプローチでは、I capaのDG、BTTAにおけるB-R-D-U-D-C-X陽性細胞の量が明らかに増加していることが明らかになりました。DCX発現細胞の分化または統合を阻害されたマウスは、細胞数が増加し、ダブルトランスジェニックマウスの挙動を特異的に試験するために3型細胞が関与した可能性がある。DG依存タスクでは、S-P-S-B-Mが採用されました。IカッパB対照動物は、実験初日に連続してフードハウスを探索しました。7日間の訓練の後、動物たちは直接オープンフードハウスを見つけることができました。それに対して、IA BTTAの動物たちは、トレーニング後もエサハウスを連続して探索し続けます。i kappa B対照動物と比較して、i kappa BTTA動物では、カバーされる距離の有意な増加、およびより高い遅延およびエラー率の観察は、これらの動物が深刻な学習障害を持っていたことを示唆しています。一度確立されると、この技術は、開発後に適切に実行されれば、動物あたり30分で行うことができます。この技術は、マウスの成体ニューロン新生、変性、再生など、デイドジャイロ依存のタスクに関心のある他の神経科学者への道を開く可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

成熟した動物で新生児歯状回顆粒細胞の統合を研究する方法が記載されている。この手法は、生体機能の統合に決定するために電気生理学的記録に続いて新生ニューロンを、ラベルを付けるために設計されたレトロウイルスを使用しています。...

アダルト生まれのニューロンの統合を検討し

アダルト生まれの哺乳動物の神経細胞の機能は、調査のアクティブエリアのまま。電離放射線は、新たな神経細胞の誕生を阻害する。コンピュータ断層撮影誘導焦点照射（CFIR）を用いて、特定の神経前駆細胞集団の三次元解剖学的ターゲティングは現在、成体神経新生の機能的役割を評価するために使用することができる。...

焦点放射線阻害と大人の視床下部ニューロン新生の機能的な尋問

神経芽細胞の遊走は、出生後の神経新生に重要なステップです。プロトコルは、ここに記載DNA /低分子ヘアピンRNA（shRNAは）ヌクレオおよびげっ歯類生後吻側遊走性流から単離された神経芽細胞を用いた3次元遊走アッセイを用いることにより、神経芽細胞遊走の候補調節因子の役割を調査するために使用することができる。...

神経芽細胞の移行を検討するために、げっ歯類神経芽細胞のクレオ<em&gt;インビトロ</em

このビデオ記事は、同じ組織切片内の成体海馬ニューロン新生のすべての段階を検出し定量化するための包括的なプロトコルを示しています。私たちは、異なる宿主種からの適切な抗体が利用できない場合に生じる間接的な多重免疫蛍光の限界を克服する方法を詳しく説明しました。...

大人の海馬神経新生を研究するために、同じホスト種由来の抗体による免疫組織化学および複数のラベル

我々は、神経発達の起源の認知障害によって特徴づけられるマウスモデルにおける空間学習課題への曝露後の海馬ニューロンの活性化のプロファイルを研究するために免疫組織化学プロトコルを記述します。このプロトコルは、認知障害によって特徴付けられる遺伝的または薬理学的両方のマウスモデルに適用することができます。...

神経発達障害のマウスモデルにおける空間学習した後、海馬ニューロン活動の免疫組織化学的可視化

ここでは、神経幹細胞および/またはそれらに隣接する上衣細胞の長期的な遺伝子改変のためのレンチウイルス粒子の使用に基づく手順を、成体の心室-心室下神経原性ニッチにおける長期的な遺伝子組み換えのために説明すると、神経幹細胞に対する細胞の自律的および非自律的な、ニッチ依存性の影響を別々に分析することができます。...

神経の分析のための成体マウスのV-SVZにおける細胞の安定的かつ効率的な遺伝子改変幹細胞自律と非自律効果

このプロトコルはマウスで信頼性の高い HFS メソッドを設定する方法を示しています。を通じて海馬歯状回の神経細胞は、HFS を直接および間接的に生体内で電気刺激します。神経活動と分子シグナリング、 c-fosと notch1 遺伝子の免疫蛍光染色でそれぞれチェックします。神経新生は、アッセイをラベリング...

高周波刺激によるマウスの海馬歯状回の活性化のための侵襲的な方法

このプロトコルの目的は、特定の局所神経回路の化学的操作に応答して成人神経幹細胞/前駆細胞の挙動を分析するアプローチを記述することである。...

成人海馬神経前駆細胞のアッセイ回路特異的調節

誘導性トランスジェニック系統トレースマウス系統を用いて幹細胞およびその子孫を蛍光色素で恒久的にマーキングする能力は、...

成体マウス脳における誘導性蛍光標識幹細胞の系統追跡

ここでは、マウス歯状回から単離された単一の核を配列決定する方法を紹介し、蛍光活性化核(FAN)ソーティングによってほとんどのニューロンを除外します。このアプローチは、高品質の発現プロファイルを生成し、神経幹細胞などの希少な集団を含む、ニッチに代表される他のほとんどの細胞タイプの研究を容易にします。...

海馬神経原性ニッチを研究するための単一核RNAシーケンシングと組み合わせたニューロンの蛍光活性化核ネガティブソーティング

ここでは、成体マウス脳室下ゾーンから単離された拡大神経幹細胞(NSC)における遺伝子導入効率を高めるように設計されたヌクレオフェクションシステムについて説明します。この知見は、この方法が神経幹細胞における遺伝子摂動を大幅に改善し、従来のトランスフェクションプロトコルの有効性を上回り、細胞の生存率を向上させることを示しています。...

成体マウス脳室下領域からの神経幹細胞の単離、増殖、およびヌクレオフェクション

学ぶNF-κB依存性神経新生の調節法。マウスを用いた空間パターン分離Barnes迷路行動テストと組織学的解析により、歯状回依存性学習と構造変化の相関を解明する手法を紹介します。

NF-κB依存性神経新生の調節および分析のための方法

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