February 13th, 2014
NF-κB依存性の成人の海馬の神経新生の操作および分析するための方法が説明されています。詳細なプロトコルは、マウスでの認知転帰の調査のための歯状回依存行動試験(空間パターン分離バーンズ迷路と呼ばれる)のために提示されている。この技術は、他の実験設定での調査を可能に役立ちます。
この手順の全体的な目標は、成人の脳における転写因子NFκBの機能を調査することです。これは、ニューロンのNFκB活性を特異的に阻害するトランスジェニックマウスを最初に育種することによって達成されます。手順の2番目のステップは、空間パターン、分離または納屋、迷路を使用して、NFκB阻害の行動結果をテストすることです。
3番目のステップは、動物を慎重に豊富に育て、脳を取り除き、その適切な切片化です。最後のステップは、免疫染色による苔状線維の突起の視覚化など、組織学的および構造的影響の解析です。最終的には、行動テストとそれに続く組織学を使用することで、歯状回依存性学習の変化と関連組織の構造変化を関連付けることができます。
火星の花瓶のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、空間パターン分離結合MAが、この脳領域における反子供依存学習プロセスや神経変性および再生を具体的に測定する機会を提供することです。この方法は、特別なパターン分離としての学習など、成人のニューロン新生の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。迷路のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるAngela Kulaが行います。
灌流は、研究員のピーター・ハイマンが発表します。その後、脳の切片化がウルリッヒKA技術者によって示されます。そして最後に、共焦点走査型顕微鏡は、私の研究室の博士課程の学生であるJeanine Muahによって発表されます。
バーンズ迷路国際および地域のガイドラインに従った行動テスト。このアッセイでは、生後6か月以上の雄マウスのみを使用することが重要です。各試験シリーズでは、動物は生後4日以内である必要があり、同じオペレーターが試験前にすべての試験を実施する必要があります。
マウスには標準的な食事を与えて、甘い食べ物にやる気を起こさせる必要があります。最初にテストを設定するには、硬質プラスチックで作られた直径120センチメートルの白いプレートを入手します。追加の迷路の手がかりは、さまざまな素材で作成でき、さまざまな形状を持つことができます。
重要なのは、動物の走行輪がはっきりと認識するためには、コントラストが高くなければならないということです。はしごやトンネルはすべて良い手がかりです。適度に強いいくつかのネオン蛍光灯の下にプレートを配置して、マウスが光から逃れるように動機付けます。
部屋は湿度が管理され、摂氏22度に一定でなければなりません。次に、ビデオ追跡システムを設定します。カメラをプレートの中心から115センチ上に配置します。
次に、プレートに合う白い色の布に、色とりどりの追加の迷路の手がかりを取り付けます。動物が見やすいように、布の中央近くに配置します。次に、実験セットアップから臭いを取り除くことができる迅速な消毒剤でプレートを慎重に清掃します。
白い皿に7つの同一の黄色のフードハウスを配置します。それらの位置は、テストを開始する1日前に明確にマークされ、各マウスをディスクに慣れさせる必要があります。居住試験のために、7つの食料の家のそれぞれに四分の一の果物のループのような甘い食べ物のペレットの報酬を配置します。
各マウスをプレートの始点に置き、10分間探索します。この探索をマウス間で記録します。円形のプレートとフードハウスを迅速な消毒剤で清掃します。
また、食べ物の報酬を補充します。次の 7 日間連続して、テストのテスト試行を実行します。実験全体を通して、1軒を除くすべての家は透明なテープで閉じられています。
いつも同じ家です。各家にはまだ報酬がロードされており、テストは慣れ試行のように実行されます。概日リズムの変動を避けるために、各動物について同じ時間にテストを実行します。
後で、適切な統計を使用して、遅延、カバーされる距離、およびエラーを分析します。ソフトウェアは、エラーを間違った食品ハウスに近づくか、適切なボックスに接触したが、入って報酬を取り戻さなかったと定義しています。グループを比較するには、二元配置分散分析とボンファー事後検定を使用します。
ベルチンの腹腔間注射で動物に麻酔をかけた後、ヘパリンとプロパンを含むPBSで慎重に経的に灌流します。.26ゲージの針を使用して左心室に穴を開けます。また、右心房に切り込みを入れて、血液と灌流8が流れ出るようにします。
灌流針を穴の左心室にまっすぐな角度で、1〜2ミリメートルの深さまで挿入します。1.2〜1.4メートルの静水圧を使用し、マウスを2〜4分間灌流します。ヘパリンとプロパンをPBS中の4%パラアルデヒドで10〜15分間追跡します。
灌流は毎分15ミリリットルの速度であるべきです。次に、脳を解剖します。それは目に見える赤い血管がない淡い白でなければなりません。
採取したすべての脳を4%パラホルムアルデヒドに摂氏4度で24時間固定します。翌日。クライオは、PBSの30%スクロースで脳を保護し、少なくとも24時間後に摂氏4度で保存します。
脳はクライオトーンステージで凍結され、厚さ40ミクロンの水平セクションにスライスされます。切片をニューロフィラメントMの抗体で染色した後、蛍光抗体に適した波長の共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して、苔状線維の突起を視覚化できます。低倍率でスキャンを開始し、海馬と苔状繊維の突起に向き
を変えます。次に、高倍率で、苔状線維の高解像度C切片スキャンを収集して分析し、I kappa B alpha AA one導入遺伝子の発現を調査します。ダブルトランスジェニックマウスの脳を単離し、クライオ切片化し、GFP共焦点レーザースキャンに対する抗体を用いて染色した。顕微鏡検査により、CA 1領域、CA 3領域、およびDGで導入遺伝子の高発現が明らかになり、海馬神経原性領域でCAMK 2 α drivenI、kappa B、alpha AA oneを発現する最も初期の細胞タイプが特定されました。
I Kappa BTTAのカバカンピのクライオセクション。動物をダブルコートチンで染色し、導入遺伝子共焦点分析により、CAMK 2α活性による導入遺伝子の発現の誘導を示す矢印で示された若いDCX陽性顆粒細胞におけるGFPシグナルが明らかになりました。i kappa BTTAマウスとi Kappa Bマウスの海馬の冠状切片をニューロフィラメントMで染色し、苔状線維の突起を可視化し、I kappa BTTAマウスの複雑で水疱性の組織を明らかにしました。
苔むした繊維の突起はひどく損なわれていました。さらに、NF κ B 阻害により、スペラルブレードの厚さが大幅に減少し、DG 体積が小さくなり、劇的な構造欠陥の潜在的な理由が研究されました。コントロールマウスとI kappa BTTAマウスからの新鮮な未固定の海馬スライスをフルオロジェイドCで染色し、ニューロン細胞死の特異的検出を可能にしました。
劇的に増加した変性神経突起の数は、単一のトランスジェニックコントロールと比較して、ダブルトランスジェニック動物で観察されました。さらに、3つの陽性細胞の切断されたcapaceの有意な増加がI kappa BTTAマウスで検出されました。対照的に、DCXに対する免疫組織化学的染色では、I kappa BTマウスの脳内のDCX陽性細胞の量が有意に増加していることが明らかになりました。
さらに、I kappa B TTA hippo Campiのd CX陽性細胞は、亜顆粒帯のみに配列されたのではなく、dgのより深い領域にも見られました。一方、対照動物のD CX陽性前駆細胞は、ほぼ独占的に亜顆粒帯内に局在していました。DCX発現細胞の増加量を試験することは、初期の前駆細胞の成熟の結果であるか、または直接的にDCX陽性細胞の増殖によるものであった。
BRDUをi kappa BTTAとコントロールマウスの腹腔内注射し、その後、増殖の分析のためにDCXとBRDUで凍結切片化および染色しました。BRDU は 1 回注入され、24 時間後に分析が行われました。分化の解析のために、毎日3回の注射を行い、続いてBRDUの1回の注射から7日後に解析を行いました。
I kappa BTTA陰性動物と対照動物との間のBRDU陽性細胞の総数に有意差は観察されなかった。対照的に、3回の連続注射アプローチでは、I capaのDG、BTTAにおけるB-R-D-U-D-C-X陽性細胞の量が明らかに増加していることが明らかになりました。DCX発現細胞の分化または統合を阻害されたマウスは、細胞数が増加し、ダブルトランスジェニックマウスの挙動を特異的に試験するために3型細胞が関与した可能性がある。
DG依存タスクでは、S-P-S-B-Mが採用されました。IカッパB対照動物は、実験初日に連続してフードハウスを探索しました。7日間の訓練の後、動物たちは直接オープンフードハウスを見つけることができました。
それに対して、IA BTTAの動物たちは、トレーニング後もエサハウスを連続して探索し続けます。i kappa B対照動物と比較して、i kappa BTTA動物では、カバーされる距離の有意な増加、およびより高い遅延およびエラー率の観察は、これらの動物が深刻な学習障害を持っていたことを示唆しています。一度確立されると、この技術は、開発後に適切に実行されれば、動物あたり30分で行うことができます。
この技術は、マウスの成体ニューロン新生、変性、再生など、デイドジャイロ依存のタスクに関心のある他の神経科学者への道を開く可能性があります。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
この記事では、NF-κB依存性成体海馬神経新生を操作し分析する方法について説明します。マウスの認知機能を調査するための歯状回依存性の行動テストである空間パターン分離-バーンズ迷路の詳細なプロトコルが提示されています。
Understanding NF-κB's role in adult hippocampal neurogenesis provides mechanistic insights into learning and memory pathways relevant to cognitive disorder target validation. The spatial pattern separation-Barnes maze enables quantitative assessment of dentate gyrus-dependent cognition, supporting phenotypic screening of genetic or pharmacological modulators. This integrated behavioral-histological approach facilitates preclinical model validation and translational biomarker alignment for neurogenic pathways.
This method bridges early target validation (NF-κB modulation) to phenotypic screening (behavioral testing) and preclinical analysis (histological quantification), enabling iterative de-risking of neurogenic targets.