Name: 還元的にメチル化されたタンパク質上の13C-ジメチルN末端アミンのNMR共鳴を同定する方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: 学ぶ還元的メチル化とアミノペプチダーゼ処理を用いたリゾチームN末端リシン残基のα-およびε-ジメチルアミンNMR信号の同定法。pH選択性を活用し、タンパク質構造解析に応用可能です。

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この研究は、国立衛生研究所の国立研究センターからの賞番号R00RR024105によって支援されました。

1. リゾチームの還元的メチル化
<ol>
	<li>pH 7.5の50 mMリン酸ナトリウム緩衝液500 mLを調製します。室温で保存してください。</li>
	<li>完全標識サンプル(FLS)、低pH部分標識サンプル(LpH)、および高pH部分標識サンプル(HpH)用の3本の1 mL微量遠心チューブを標識します。</li>
	<li>リゾチーム10 mgを秤量し、リン酸ナトリウム緩衝液2 mlに溶解して、濃度5 mg / mlの水溶液を作成します。各チューブに500 μlのリゾチーム溶液を添加します。</li>
	<li>ジメチルアミンボラン錯体(DMAB)と13C-ホルムアルデヒドの新鮮な1.0 M溶液を調製します。0°Cで保存してください。</li>
	<li>完全に標識されたサンプルには1:10のモル比(反応性アミン:ホルムアルデヒド)を使用し、部分的に標識されたサンプルには1:5の比率を使用します。あるいは、比率を最適化することもできます。例えば、低 pH での α-13C-ジメチルアミンのピークの優位性を確認するためには、2:7 の比率が必要でした。</li>
	<li>FLSに6.1 μlの1.0 M DMABを添加し、1.0 M DMAB3.2 μlをLpHおよびHpHに添加し、穏やかにボルテックスします。次に、12.3 μlの1.0 M 13C-ホルムアルデヒドをFLSに加え、6.1 μlの1.0 M 13C-ホルムアルデヒドをLpHとHpHに加えます。反応混合物を4°Cで2時間振とうします。</li>
	<li>前のステップと同様に、1.0 M DMABと13C-ホルムアルデヒドの別のアリコートを加え、反応混合物を4°Cで一晩振とうし、合計18〜24時間の反応時間を確保します。</li>
	<li>サンプルのバッファーをpH 7.5のリン酸に交換し、遠心フィルター(分子量カットオフ値3 kDa)を使用して余分な試薬と副生成物を除去します。</li>
	<li>部分的に標識されたサンプルについては、pH 7.5でサンプルを天然存在量のホルムアルデヒドで還元的にメチル化して、均一に修飾されたタンパク質を作成します。DMABと天然存在量のホルムアルデヒドの新しい1.0 M溶液を調製します。</li>
	<li>サンプルチューブをホイルで覆い、6.1 μlのDMABをLpHとHpHに加え、穏やかにボルテックスします。次に、12.3μlの天然存在量ホルムアルデヒドを加えます。反応混合物を4°Cで2時間振とうします。</li>
	<li>前のステップと同様に、1.0 M DMABと天然存在量のホルムアルデヒドの別のアリコートを追加し、反応混合物を4°Cで一晩振とうし、合計18〜24時間の反応時間を確保します。次に、ステップ2.5-2.6を使用してバッファー交換を行い、MS用に50μgのサンプルを-20°Cで保存します。</li>
</ol>
2. NMR分析用の試料を調製します。
<ol>
	<li>H2OでpH 8.5の2.0 Mホウ酸ナトリウム緩衝液を調製します。</li>
	<li>375 μlの2.0 Mホウ酸ナトリウム緩衝液を4本の15 mLコニカルチューブに加えます。上部と突っ穴をパラフィルム化します。フラスコを凍結乾燥フラスコに入れ、サンプルを凍結します。</li>
	<li>凍結したサンプルを凍結乾燥機に置き、乾燥させます。乾いたら取り外します。</li>
	<li>ピペットを使用して、各チューブに15 mlのD2Oを加えて混合します。</li>
	<li>3 つの 4 ml 遠心フィルター (分子量カットオフ 3 kDa) に FLS、LpH、HpH を標識し、対応するサンプルをフィルターチューブ (~500 μl) に加えます。pH 8.5の50 mMホウ酸ナトリウム緩衝液3.0 mLを各チューブに加えます。3本目のチューブ用のバランスチューブを作製し、4°C、7,500 rcfの35°固定角ローターを備えた遠心分離機を使用して、サンプルを500 μlに濃縮します。</li>
	<li>各フィルターの下のトラップを空にします。さらに3.0 mLのバッファーをサンプルに加え、サンプルを再び500 μlに濃縮します。手順2.5を4回繰り返します。</li>
	<li>ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイ36を用いて、各試料の濃度を決定する。リゾチームサンプルを50 mMホウ酸ナトリウムバッファーで希釈して、150 μMサンプルを作製します。</li>
	<li>530 μlを5 mm NMRチューブに、または250 μMを5 mm磁化率適合チューブに移します。</li>
	<li>1,2-ジクロロエタン-13C2 in D2Oの80 mMストック溶液を調製し、このストック溶液を-80°Cで保存し、80 μlで24 mMに希釈し、同軸インサートチューブに移してNMR分析のリファレンスとして使用します。NMRでサンプルを分析します。注:1D 1 H-13C HSQC を解析し、各共振のピーク面積を積分します。ピーク面積は、完全に標識されたサンプルで同じである必要があります。</li>
</ol>
3. リゾチームのアミノペプチダーゼ分解
<ol>
	<li>超純水に5 mg / mlのリゾチーム溶液を調製します。.</li>
	<li>250 μlのリゾチーム溶液を清潔な1 mLの遠心分離チューブに加えます。</li>
	<li>0.1 Mトリシン溶液(pH 8.0)25 μl、2.16 μg/mL Aeromonas proteolytica aminopeptidase溶液6 μlを添加します。</li>
	<li>37°Cで6時間インキュベートします。</li>
	<li>2.16 μg/mlのアミノペプチダーゼ溶液を6 μl追加してサンプルに加え、アミノペプチダーゼとリゾチームのモル比を1:50にします。37°Cで20時間インキュベー</li>トします。
	<li>C18スピンカラムを使用してサンプル30 μlを脱塩します(メーカーのプロトコルに従います)。MALDI MS分析のために-20°Cで保存してください。</li>
	<li>残りのタンパク質サンプルをNMR用に調製します(プロトコル2)に記載)。</li>
</ol>
4. 質量分析用のサンプルを準備する
<ol>
	<li>ステップ 2.3 でリザーブした 50 μg のサンプルを使用して、バッファーを 100 mM 重炭酸アンモニウム (pH 8.0) に交換し、1 mL の遠心フィルター (分子量カットオフ値 3 kDa) を使用して約 50 μl に濃縮します。サンプルを1 mLの遠心分離チューブに移し、アルミホイルで包みます。</li>
	<li>2.0 μlの500 mMジチオスレイトールを添加して、ジスルフィド結合を減らします。溶液を60°Cで1時間インキュベートします。</li>
	<li>調製したばかりの500 mMヨードアセトアミド2 μlを加えて、チオール基をアルキル化します。室温で20分間インキュベートします。</li>
	<li>ホイルをはがし、500 mMのジチオスレイトール溶液1.0 μlを加えて反応をクエンチします。</li>
	<li>2.0 μgのシーケンシンググレードのトリプシンを添加して、タンパク質を消化します。混合物を37°Cで16〜24時間インキュベートします。</li>
	<li>pHが2未満になるまでTFAを添加して、消化を急冷します。(ギ酸、酢酸も使用可能)</li>
	<li>C18スピンカラムでサンプルを脱塩し、タンパク質を80%アセトニトリル/0.1%TFAで溶出します。真空濃縮器を使用してサンプルを乾燥させます。</li>
	<li>MALDI MS分析のために、5.0 μLの50%アセトニトリル/0.1% TFAにサンプルを再構成します。等量の再構成したサンプルと2,5-ジヒドロキシ安息香酸マトリックス溶液の飽和溶液をMALDIターゲットプレート上で混合します。MALDI MSでサンプルを分析します。注:タンデムMSを使用して、ペプチドピークの同一性を確認してください。マススペクトルを平滑化して分析します。各ジメチルアミン含有ペプチドについて、プロファイル内の各同位体のピーク強度とピーク面積を決定します。前述の34のように、13C-incorporationの割合を計算します。</li>
</ol>

<ol><li>Bax, A., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+Advances+in+Protein+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological Advances in Protein NMR.</a> Accounts of Chemical Research. 26 (4), 131-138 (1993).</li>
<li>Shimba, N., Yamada, N., Yokoyama, K., Suzuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Labeling+of+Arbitrary+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Labeling of Arbitrary Proteins.</a> Analytical Biochemistry. 301 (1), 123-127 (2002).</li>
<li>Palomares, L., Estrada-Moncada, S., Ramírez, O. Production of Recombinant Proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalomares%2C+L+%22Recombinant+Gene+Expression%22">Recombinant Gene Expression</a>. Balbás, P., Lorence, A. 267, Humana Press. New York City, New York, USA. 15-51 (2004).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Production+and+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein Production and Purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Terwilliger, T. C., Stuart, D., Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+Structural+Genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Lessons from Structural Genomics.</a> Annual Review of Biophysics. 38, 371-383 (2009).</li>
<li>Goto, N. K., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Developments+in+Isotope+Labeling+Strategies+for+Protein+Solution+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">New Developments in Isotope Labeling Strategies for Protein Solution NMR Spectroscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10 (5), 585-592 (2000).</li>
<li>Lian, L., Middleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelling+Approaches+for+Protein+Structural+Studies+by+Solution-State+and+Solid-State+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Nuclear+Magn.+Reson.+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Labelling Approaches for Protein Structural Studies by Solution-State and Solid-State NMR.</a> Progress in Nuclear Magn. Reson. Spectroscopy. 39 (3), 171-190 (2001).</li>
<li>Mason, A., Siarheyeva, A., Haase, W., Lorch, M., van Veen, H., Glaubitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+Acid+Type+Selective+Isotope+Labelling+of+the+Multidrug+ABC+Transporter+LmrA+for+Solid-State+NMR+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Lett%22%5BJournal%5D)">Amino Acid Type Selective Isotope Labelling of the Multidrug ABC Transporter LmrA for Solid-State NMR Studies.</a> Febs Lett. 568 (1-3), 117-121 (2004).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Amino-Acid-Type+Selective+Isotope+Labeling+of+Protein+Expressed+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%3AStructure+Function+and+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Preparation of Amino-Acid-Type Selective Isotope Labeling of Protein Expressed in Pichia pastoris.</a> Proteins:Structure Function and Bioinformatics. 62 (1), 279-287 (2006).</li>
<li>Means, G., Feeney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+Alkylation+of+Amino+Groups+in+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Reductive Alkylation of Amino Groups in Proteins.</a> Biochem. 7 (6), 2192 (1968).</li>
<li>Jentoft, J. E., Jentoft, N., Gerken, T. A., Dearborn , D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13+NMR-Studies+of+Ribonuclease-A+Methylated+With+Formaldehyde-C-13.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">C-13 NMR-Studies of Ribonuclease-A Methylated With Formaldehyde-C-13.</a> J. Biol. Chem. 254 (11), 4366-4370 (1979).</li>
<li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+alkylation+of+lysine+residues+to+alter+crystallization+properties+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Crystallography%2C+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Reductive alkylation of lysine residues to alter crystallization properties of proteins.</a> Macromolecular Crystallography, Pt A. 276 (97), 171-179 (1997).</li>
<li>French, D., Edsall, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Reactions+of+Formaldehyde+with+Amino+Acids+and+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">The Reactions of Formaldehyde with Amino Acids and Proteins.</a> Adv. Protein Chem. 2, 277-335 (1945).</li>
<li>Jentoft, N., Dearborn, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+Proteins+by+Reductive+Methylation+Using+Sodium+Cyanoborohydride%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Labeling of Proteins by Reductive Methylation Using Sodium Cyanoborohydride.</a> J. Biol. Chem. 254 (11), 4359-4365 (1979).</li>
<li>Walter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+Methylation+as+a+Routine+Rescue+Strategy+for+Protein+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Struct%22%5BJournal%5D)">Lysine Methylation as a Routine Rescue Strategy for Protein Crystallization.</a> Struct. 14 (11), 1617-1622 (2006).</li>
<li>Rypniewski, W., Holden, H., Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Consequences+of+Reductive+Methylation+of+Lysine+Residues+in+Hen+Egg-White+Lysozyme+-+An+X-ray+Analysis+at+1.8-Angstrom+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Structural Consequences of Reductive Methylation of Lysine Residues in Hen Egg-White Lysozyme - An X-ray Analysis at 1.8-Angstrom Resolution.</a> Biochem. 32 (37), 9851-9858 (1993).</li>
<li>Bokoch, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-specific+regulation+of+the+extracellular+surface+of+a+G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Ligand-specific regulation of the extracellular surface of a G-protein-coupled receptor.</a> Nat. 463 (7277), (2010).</li>
<li>Jentoft, J., Gerken, T., Jentoft, N., Dearborn, D. C-13] Methylated Ribonuclease-A - C-13 NMR Studies of the Interaction of Lysine 41 with Active Site. 256 (1), 231-236 (1981).</li>
<li>Sherry, A., Teherani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+Studies+of+C-13-Methylated+Concanavalin+A+-+pH+and+Co2%2B-Induced+Nuclear+Magn.+Reson.+Shifts.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Physical Studies of C-13-Methylated Concanavalin A - pH and Co2+-Induced Nuclear Magn. Reson. Shifts.</a> J. Biol. Chem. 258 (14), 8663-8669 (1983).</li>
<li>Dick, L., Sherry, A., Newkirk, M., Gray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+Methylation+and+C-13+NMR+Studies+of+the+Lysyl+Residues+of+fd+Gene+5+Protein+-+Lysines+24%2C+46%2C+and+69+May+be+Involved+in+Nucleic+Acid+Binding.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reductive Methylation and C-13 NMR Studies of the Lysyl Residues of fd Gene 5 Protein - Lysines 24, 46, and 69 May be Involved in Nucleic Acid Binding.</a> J. Biol. Chem. 263 (35), 18864-18872 Forthcoming.</li>
<li>Moore, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-epsilon%2CN-epsilon-dimethyl-lysine+cytochrome+c+as+an+NMR+probe+for+lysine+involvement+in+protein-protein+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">N-epsilon,N-epsilon-dimethyl-lysine cytochrome c as an NMR probe for lysine involvement in protein-protein complex formation.</a> Biochem. J. 332, 439-449 (1998).</li>
<li>Jentoft, J. E., Gerken, T. A., Jentoft, N., Dearborn, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+Active-Site+Lysine+of+Ribonuclease-A+By+C-13+NMR.%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Studies of the Active-Site Lysine of Ribonuclease-A By C-13 NMR.</a> Biophys. J. 25 (2), 56 (1979).</li>
<li>Gerken, T., Jentoft, J., Jentoft, N., Dearborn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+Interactions+of+Amino+Groups+in+C-13+Reductively+Methylated+Hen+Egg-White+Lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intramolecular Interactions of Amino Groups in C-13 Reductively Methylated Hen Egg-White Lysozyme.</a> J. Biol. Chem. 257 (6), 2894-2900 (1982).</li>
<li>Dick, L. R., Geraldes, C., Sherry, A. D., Gray, C. W., Gray, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13+NMR+of+Methylated+Lysines+of+fd+Gene-5+Protein+-+Evidence+for+A+Conformational+Change+Involving+Lysine-24+Upon+Binding+of+A+Negatively+Charged+Lanthanide+Chelate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">C-13 NMR of Methylated Lysines of fd Gene-5 Protein - Evidence for A Conformational Change Involving Lysine-24 Upon Binding of A Negatively Charged Lanthanide Chelate.</a> Biochem. 28 (19), 7896-7904 (1989).</li>
<li>Gluck, M., Sweeney, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13-NMR+of+Clostridium-Pasteurianum+Ferredoxin+After+Reductive+Methylation+of+the+Amines+Using+C-13+Formaldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">C-13-NMR of Clostridium-Pasteurianum Ferredoxin After Reductive Methylation of the Amines Using C-13 Formaldehyde.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1038 (2), 146-151 (1990).</li>
<li>Jentoft, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+Methylation+and+C-13+Nuclear-Magnetic-Resonance+in+Structure-Function+Studies+of+Fc+Fragment+and+Its+Subfragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reductive Methylation and C-13 Nuclear-Magnetic-Resonance in Structure-Function Studies of Fc Fragment and Its Subfragments.</a> Methods in Enzymology. 203, 261-295 (1991).</li>
<li>Sparks, D., Phillips, M., Lundkatz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Conformation+of+Apolipoprotein+A-I+in+Discoidal+and+Spherical+Recombinant+High+Density+Lipoprotein+Particles+-+C-13+NMR+Studies+of+Lysine+Ionization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Conformation of Apolipoprotein A-I in Discoidal and Spherical Recombinant High Density Lipoprotein Particles - C-13 NMR Studies of Lysine Ionization.</a> J. Biol. Chem. 267 (36), 25830-25838 (1992).</li>
<li>Ashfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Modification+of+a+Variant+of+Human+MIP-1+Alpha%2C+Implications+for+Dimer+Structure.%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Chemical Modification of a Variant of Human MIP-1 Alpha, Implications for Dimer Structure.</a> Protein Science. 9 (10), 2047-2053 (2000).</li>
<li>Goux, W., Teherani, J., Sherry, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+Inversion+in+Proteins+-+A+C-13-NMR+Study+of+Proton+Exchange+and+Nitrogen+Inversion+Rates+in+N-Epsilon%2CN-Epsilon%2CN-Alpha%2CN-Alpha-%5BC-13%5DTetramethyllysine%2C+N-Epsilon%2CN-Epsilon%2CN-Alpha%2CN-Alpha%5BC-13%5DTetramethyllysine+Methyl-Ester%2C+and+Reductively+Methylated+Concanavalin-A.%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amine Inversion in Proteins - A C-13-NMR Study of Proton Exchange and Nitrogen Inversion Rates in N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha-[C-13]Tetramethyllysine, N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha[C-13]Tetramethyllysine Methyl-Ester, and Reductively Methylated Concanavalin-A.</a> Biophysical Chemistry. 19 (4), 363-373 (1984).</li>
<li>Sherry, A. D., Keepers, J., James, T. L., Teherani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl+Motions+in+C-13+Methylated+Concanavalin-as+Studied+by+C-13+Magnetic-Resonance+Relaxation+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Methyl Motions in C-13 Methylated Concanavalin-as Studied by C-13 Magnetic-Resonance Relaxation Techniques.</a> Biochemistry. 23 (14), 3181-3185 (1984).</li>
<li>Huque, M., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13+NMR+Studies+of+the+Lysine+Side+Chains+of+Calmodulin+and+Its+Proteolytic+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">C-13 NMR Studies of the Lysine Side Chains of Calmodulin and Its Proteolytic Fragments.</a> Journal of Protein Chemistry. 12 (6), 695-707 (1993).</li>
<li>Brown, L., Bradbury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-Magnetic-Resonance+Studies+of+Lysine+Residues+of+Ribonuclease-A%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proton-Magnetic-Resonance Studies of Lysine Residues of Ribonuclease-A.</a> Eur. J. Biochem. 54 (1), 219-227 (1975).</li>
<li>Zhang, M., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+Side+Chain+pKa+Values+of+the+Lysine+Residues+in+Calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of the Side Chain pKa Values of the Lysine Residues in Calmodulin.</a> J. Biol. Chem. 268 (30), 22420-22428 (1993).</li>
<li>Macnaughtan, M., Kane, A., Mass Prestegard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrometry+Assisted+Assignment+of+NMR+Resonances+in+Reductively+C-13-Methylated+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Spectrometry Assisted Assignment of NMR Resonances in Reductively C-13-Methylated Proteins.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (50), 17626-17627 (2005).</li>
<li>Cordova, E., Gao, J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncovalent+Polycationic+Coatings+for+Capillaries+in+Capillary+Electrophoresis+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Noncovalent Polycationic Coatings for Capillaries in Capillary Electrophoresis of Proteins.</a> Anal. Chem. 69 (7), 1370-1379 (1997).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Protein+Using+Bicinchoninic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Larda, S. T., Bokoch, M. P., Evanics, F., Prosser, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methylation+strategies+for+characterizing+protein+conformations+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomolec.+NMR%22%5BJournal%5D)">Lysine methylation strategies for characterizing protein conformations by NMR.</a> J. Biomolec. NMR. 54 (2), 199-209 (2012).</li>
<li>Bradbury, J. H., Brown, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Dissociation+Constants+of+Lysine+Residues+of+Lysozyme+by+Proton-Magnetic-Resonance+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of Dissociation Constants of Lysine Residues of Lysozyme by Proton-Magnetic-Resonance Spectroscopy.</a> Eur. J. Biochem. 40 (2), 565-576 (1973).</li>
<li>Frey, S. T., Guilmet, S. L., Egan, R. G., Bennett, A., Soltau, S. R., Holz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+the+Aminopeptidase+from+Aeromonas+proteolytica+on+Mg2%2B%2FAl3%2B+Layered+Double+Hydroxide+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Appl.+Mater.%2C+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Immobilization of the Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica on Mg2+/Al3+ Layered Double Hydroxide Particles.</a> Acs Appl. Mater., & Interfaces. 2 (10), 2828-2832 (2010).</li>
<li>Poncz, L., Dearborn, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Resistance+to+Tryptic+Hydrolysis+of+Peptide-Bonds+Adjacent+to+N-epsilon%2CN-Dimethyllysyl+Residues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Resistance to Tryptic Hydrolysis of Peptide-Bonds Adjacent to N-epsilon,N-Dimethyllysyl Residues.</a> J. Biol. Chem. 258 (3), 1844-1850 (1983).</li>
</ol>

開示するものは何もありません。

この同位体標識法を十分に利用するには、還元的に13のC-メチル化タンパク質のNMRシグナルを割り当てる必要があります。MS を使用して、部分的な 13C 取り込みデータの相関を通じて NMR 信号の割り当てを支援することは、有望な手法です。他の割り当て方法に対するこの手法の利点は、一次アミノ酸配列のみが必要であることです。α-ジメチルアミンとε-ジメチルアミンでの13C-取り込みはMSで別々に測定できないため、N末端アミノ酸がリジンの場合、MS支援割り当て法は制限されます。滴定実験では通常、α-ジメチルアミンの化学シフトのpH依存性が示されますが、塩橋やその他の構造的寄与により、化学シフトは信頼性の低い割り当て方法になります。提示された方法を使用すると、この問題を解決するだけでなく、MSでα-およびε-ジメチルアミノペプチドの個々の13C-%取り込みを測定するという問題も回避できます。1つの部位が標識されているため、13°C%の取り込み量をMSで直接測定できます。Lys1 α-およびε-ジメチルアミンの以前の割...

核磁気共鳴(NMR)分光法は、タンパク質1の構造解明に有用なツールです。NMR分光法は、天然状態のタンパク質の溶液構造を決定するために使用できます。安定磁気同位体の天然存在量の低さを克服するためには、目的のタンパク質に13Cと15Nを組み込む必要があります。採用される最も一般的な方法は、細菌宿主2-3における組換え発現である。しかし、細菌宿主の過剰発現の2つの欠点は、翻訳後修飾を生じさせることができないことと、すべてのタンパク質に対して機能するわけではないことです3-4。細菌の発現がタンパク質産生の実行可能な経路ではない場合、非細菌性宿主での過剰発現を使用できますが、同位体標識は困難で高価です5。NMR分析のために13Cおよび15N同位体をタンパク質に組み込むための代替発現方法には、メチル標識6および単一13C、15Nアミノ酸7-9のための代謝前駆体を用いたスパース標識技術が含まれます。本明細書で使用されるスパース標識への化学的アプローチは、確立された還元的13C-メチル化反応(図1)であり、タンパク質上の主要なアミノ基 - N末端α-アミンおよびリジン、側鎖ε-アミン - がメチル化される。モノメチルアミンが形成されると、アミンはpKa値が高いため、再びメチル化され、ジメチルアミンを形成します。
還元的メチル化は、MeansとFeeney10によってタンパク質を化学的に修飾する方法として最初に導入されました。この反応の利点は、その広範な適用性と、緩衝された生理学的pHおよび低温での穏やかな反応条件です11,12。ホルムアルデヒドとジメチルアミンボラン錯体(DMAB)などの還元剤の存在下では、リジンε-アミノ基とN末端α-アミノ基が選択的にメチル化されてジメチル化アミンが生成されます。ホルムアルデヒドはメチレン架橋の形成を通じてタンパク質を架橋することが知られているが、このプロセスは還元剤13,14によってブロックされる。
還元的メチル化は、NMRとX線結晶構造解析の両方でタンパク質を研究するために成功裏に使用されています。還元的メチル化は、他の方法では難治性タンパク質の結晶化を促進するために使用される15。鶏卵白リゾチームは、ジメチル化の形で結晶化した最初のタンパク質でした。メチル化リゾチーム構造と非メチル化リゾチーム構造の重原子間の二乗平均平方根差は0.40 Å16です。この比較は、還元的メチル化後もタンパク質構造を維持できることを示しており、反応は構造解明のための実行可能な標識ツールになります。
還元的メチル化反応に13個のC標識ホルムアルデヒドを用いることにより、13個のC-ジメチル化アミンが生成されます。13種類のC-ジメチルアミンは、タンパク質のダイナミクス、構造、および機能の研究に広く使用されているNMR検出可能なプローブです。NMRおよび還元的13C-メチル化は、β2アドレナリン受容体17、リボヌクレアーゼA18、リゾチーム19、fd遺伝子5タンパク質20、およびシトクロムc21のタンパク質-リガンドおよびタンパク質-タンパク質相互作用の研究に使用されています。同様に、構造的および機能的特性は、還元的に13C−メチル化リボヌクレアーゼA22、リゾチーム23、fd遺伝子5タンパク質24、Clostridium pasteurianum ferredoxin25、IgG26のFcフラグメント、アポリポタンパク質A−I27、およびMIP−1α28の13C−ジメチルアミノ基の動態が、コンカナバリンA29−30およびカルモジュリン31で研究されてきた。
還元的13C-メチル化がNMRによるタンパク質の研究に広く使用されてきたにもかかわらず、NMR共鳴26を割り当てることの難しさにより、標識方法は常に制限されてきました。還元的に13C-メチル化タンパク質のためのほとんどの割り当て戦略は、少数の部位に依存してきました、20,28既知の構造特性11,19,23,26,31,32。または広範な遺伝子改変33。これらの研究のいずれも、各リジン33の部位特異的突然変異誘発によってピークが割り当てられたカルモジュリン研究を除いて、13のC-ジメチルアミンピークすべてを成功裏に割り当てたわけではありませんでした。MIP-1αダイマー形成の研究では、還元的に13個のC-メチル化アミンのNMR割り当てを支援するための質量分析(MS)の使用が最初に報告されました28。 マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型(MALDI-TOF)MS を使用して、ダイマーの界面におけるリジンを同定しました。ヒトMIP-1αトリプシンペプチドの部分メチル化リジンをMSで同定し、2D 1 H-13C HSQC NMRスペクトル28で観察されたインタクトタンパク質のモノメチルアミンシグナルおよびジメチルアミンシグナルの出現と相関しました。私たちのグループは、MSの使用を拡大し、アミノ酸配列34以外のタンパク質の構造や特性に関する予備知識を必要としない割り当て方法を提示しました。この方法は、ほとんどのタンパク質に適用できます。1つの例外は、N末端リジンαおよびε-13C-ジメチルアミンのMS同位体プロファイルを独立して測定できないため、タンパク質がN末端リジンを有する場合です。
ここでは、N末端リジン残基のN末端α-ジメチルアミンと側鎖ε-ジメチルアミン部位を同定するための、化学的方法と酵素的方法の2つを紹介します。最初の方法は、Córdovaらに触発されました。タンパク質アセチル化の選択性を制御するためにpHを使用した人35。この反応は、低pHではN末端のα-アミン、高pHでは側鎖のε-アミンに有利であり、彼らの研究では、キャピラリー電気泳動によりタンパク質α-アミノ基とε-アミノ基を区別することができる。還元的 13C-メチル化反応を使用してタンパク質アミノ基の標識を変更し、MS 支援割り当て戦略の適用を可能にするために、高 pH と低 pH がどのように使用されるかを示します。N末端α-およびε-13C-ジメチルアミンをアサインする2番目の方法は、組換えAeromonas proteolytica aminopeptidaseを用いてN末端残基を選択的に除去する方法を利用します。

<table><tbody><tr><td>アセトニトリル</td><td>シグマ</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>アミコンウルトラ 4 ml 遠心フィルター (3k MWCO)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>UFC800308 (8pk)</td><td></td></tr><tr><td>アミノペプチダーゼ</td><td>クリエイティブ バイオマート</td><td>アミノペプチダーゼ-86A</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>ΣA6141</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td></td><td>ΣA5132</td><td></td></tr><tr><td>ボラン-ジメチルアミン錯体</td><td>シグマ</td><td>180238</td><td>使用前に新鮮な1 M溶液を作ります。</td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td></td><td>Sigma B6768</td><td></td></tr><tr><td>ウシ膵臓インスリン</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>C18 スピンカラム</td><td>Thermo Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>酸化重水素</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-4-100</td><td></td></tr><tr><td>1,2-ジクロロエタン-13C2</td><td>Sigma</td><td>714321</td><td>-80°Cで保存された80 mMのストック溶液は、24 mMのNMRスペクトルで参照として使用されます。</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド(36.5%wt/wt)</td><td>シグマ</td><td>33220</td><td>使用前に新鮮な1 M溶液を作ります。</td></tr><tr><td>13C-ホルムアルデヒド(99%)</td><td>ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ</td><td>CLM-806-1</td>使用<td>前に新鮮な1M溶液を作ります。</td></tr><tr><td>リゾチーム(鶏卵白)</td><td>Sigma</td><td>L6376</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム(二塩基性七水和物)</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム(一塩基性)</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>トリシン</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>700 MHz Varian VNMRS と 5 mm HCN 5922 プローブ</td><td>Agilentテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

還元的にメチル化されたタンパク質上の13c-ジメチルn末端アミンのnmr共鳴を同定する方法

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

核磁気共鳴(NMR)分光法は、タンパク質の構造と動的研究のための実証済みの技術です。NMRでタンパク質を研究するには、通常、安定な磁気同位体を代謝的に取り込むことで感度を向上させ、逐次的な共鳴割り当てを可能にします。還元的13C-メチル化は、同位体取り込みの最も一般的な方法である細菌宿主の過剰発現に適さないタンパク質の代替標識法です。還元的13C-メチル化は、タンパク質の主要なアミノ基(リジンε-アミノ基とN末端α-アミノ基)を13のC-ジメチルアミノ基に修飾する穏やかな条件下で行われる化学反応です。ほとんどのタンパク質の構造と機能は、修飾によって変化しないため、代謝標識の実行可能な代替手段となっています。還元的な13C-メチル化はスパースな同位体標識を付加するため、NMRシグナルを割り当てる従来の方法は適用できません。タンパク質13C-ジメチルアミンNMRシグナルの割り当てを支援するための質量分析(MS)を使用した代替割り当て方法が開発されました。この分析法は、各一次アミノ基における13C標識の部分的および異なる量に依存しています。この方法の1つの制限は、タンパク質のN末端残基がリジンである場合、Lys1のα-およびε-ジメチルアミノ基をMSで個別に測定できないためです。この制限を回避するために、N末端のα-アミンと側鎖のε-アミンの両方に関連する13のC-ジメチルアミンのNMR共鳴を同定するための2つの方法が説明されています。ニワトリ卵白リゾチームLys1のN末端α-ジメチルアミンと側鎖ε-ジメチルアミンのNMRシグナルは、1 H-13Cヘテロ核単量子コヒーレンススペクトルで同定されます。

還元的メチル化とpH
リゾチームにおいて、pH誘導による化学選択的な還元的な13C-メチル化反応が実証されています。低pHでは、反応は側鎖のε-アミンよりもN末端のα-アミンを優先し、高pHではその逆となります。溶液中では、タンパク質のアミノ基は遊離アミンと共役酸の間で平衡状態にあり、これはpHによって調整可能です。この反応の最適pH範囲は、使用する還元剤によって異なります。本例では、ジメチルアミンボランの最適pHは7.0-9.0です。還元剤の最適範囲外で操作すると反応効率が低下しますが、今回のケースではそれが利点となります。還元的なメチル化反応では、α-アミンの酸解離定数（pKa）が約723であり、ε-アミンの約1032よりも低いため、pH 6.0では優先的にN末端のα-アミンが修飾されます。pH 6.0では、平衡が共役酸側に劇的にシフトしますが、還元的なメチル化反応における反応形態である遊離アミンの濃度は、α-アミンにおいて最も高くなります。pH 10.0では、...

還元的に13C-メチル化N末端リジンのα-およびε-ジメチルアミン核磁気共鳴信号を割り当てるための2つの方法が説明されています。1つの方法は、還元的メチル化反応のpH誘導選択性を利用し、もう1つの方法はアミノペプチダーゼを使用してN末端リジンを選択的に除去します。

還元的にメチル化されたタンパク質上の13C-ジメチルN末端アミンのNMR共鳴を同定する方法

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

この手順の全体的な目標は、アルファおよびイプシロン炭素を割り当てることです。13 ジメチルアミン末端リジンのNMR共鳴、リゾチームの残基。これは、最初に低pHおよび高pHでリゾチームを還元的にメチル化し、炭素13ホルムアルデヒドをサブ幾何学的量にすることで達成されます。2番目のステップは、ホルムアルデヒドがメチル化を完了するために、過剰な天然存在量を持つ低pHサンプルと高pHサンプルを還元的にメチル化することです。最後のステップは、還元的にメチル化されたサンプルをNMR分析用のD two Oバッファーにバッファー交換することです。2 番目の方法では、リゾチームサンプルのアミノペプチダーゼ分解によって目標が達成されます。第2のステップは、切断されたタンパク質サンプルを過剰な炭素13ホルムアルデヒドで還元的にメチル化し、続いてNMR分析のためのバッファー交換を行うことです。最終的に、NMR分光法は、炭素13メチル共鳴の欠如を示すために使用され、割り当てを行います。この技術が既存の方法よりも優れている点は、αとSSONの両方のジメチルラミンとML共鳴のタンパク質の内部リジンの共鳴を明確に割り当てることができることです。F-L-S-L-P-HとHPHを備えた3つの1ミリリットルマイクロ遠心チューブをラベル付けして、リゾチームの3つのサンプルを事前に調製した緩衝液にpH6で溶解します。 7.5、および10は、ミリリットルあたり5ミリグラムの最終濃度を与えます。チューブをアルミホイルで覆い、光への暴露による劣化から保護します。これに続いて、事前に調製した1モルジメチルアミンボーリング錯体溶液の6.1マイクロリットルをFLSチューブに加え、同じ溶液の3.2マイクロリットルをLPHチューブとHPHチューブに加えます。混合物を穏やかにボルテックスした後、FLSサンプルに12.3マイクロリットルの1モル炭素13ホルムアルデヒド溶液を加え、6.1マイクロリットルの同じ溶液をL-P-H-N-H-P-Hサンプルに加えます。反応混合物を摂氏4度で2時間振とうします。対応するチューブにDMABとカーボン13ホルムアルデヒドの同じアリコートを追加して、前の手順を繰り返します。各サンプルの緩衝液をpH 7.5の3ミリリットルのリン酸緩衝液と交換し、余分な試薬と副生成物を除去するためにpH 7.5で各サンプルの緩衝液を交換した後、摂氏4度で摂氏4度で一晩で反応混合物を振とうし、35度の固定角ローターを備えた遠心分離機を使用してサンプルを500マイクロリットルに濃縮し、摂氏4度と7で、 500 RCFです。その後、前の手順を 2 回繰り返します。部分的にラベル付けされたサンプルチューブをアルミホイルで覆い、新たに調製した1モルDMAB溶液の6.1マイクロリットルをそれらに加えます。サンプルをボル

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還元ジメチル化（REDIラベリング）によるペプチドの安定同位体標識は、正確な質量分析に基づく定量的プロテオミクスのための迅速、安価な戦略である。ここでは、ほぼすべてのサンプルタイプに適用することができるのRediアプローチを使用してタンパク質混合物の調製および分析のためのロバストな方法を示す。...

安定同位体標識するための還元ジメチル化を用いた定量的プロテオミクス

哺乳類の脳の神経化学は、多くの神経疾患や全身疾患で変化しています。脳代謝産物の特徴的なプロファイルは、脳組織の粗抽出物に基づいて効率的に取得できます。そのために、高分解能NMR分光法を採用し、代謝物濃度の詳細な定量分析(メタボロミクス)を可能にしています。...

組織抽出物の高分解能核磁気共鳴分光法によるラット脳のメタボローム解析

&gt;jove_content&lt;ここでは、タウタンパク質をケーススタディとして、核磁気共鳴分光法(NMR)によって天然変性タンパク質の複数のリン酸化を特定する方法について説明します。組換えタウは、データ取得および解析の前に、キナーゼによって同位体的に濃縮および修飾されます。...

本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法

原子分解能で分子タンパク質複合体の構造は、多様な生命現象で重要な役割のため関連性が高いです。ここで、マジック角回転固体核磁気共鳴分光法 (MAS SSNMR) による不溶性と非晶質高分子タンパク質複合体の高分解能構造解析を実行するためのプロトコルを提案する.

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タンパク質アルギニン(R)-メチル化は、複数の生物学的経路を調節する広範な翻訳後修飾です。質量分析は、修飾ペプチド濃縮のための生化学的アプローチと組み合わせると、R-メチルプロテオームをグローバルにプロファイリングするための最良の技術です。ここでは、ヒト細胞における全体的なR-メチル化を高信頼で同定するために設計されたワークフローについて説明します。...

質量分析に基づくプロテオミクスアプローチによるグローバルで信頼性の高いタンパク質R-メチル化分析

この記事では、熱不活性化に基づくサンプル調製方法を、後分析による分解を回避する内因性ペプチドを保存し、続いて同位体標識とLC-MSを使用した相対定量を行う方法について説明します。...

ペプチド学研究におけるアミンの還元メチル化を用いたサンプル調製と相対定量

天然変性タンパク質の弱く一過性の分子間および分子内相互作用を検出するための常磁性緩和増強NMR分光法の適用のためのプロトコルが提示されています。...

天然的に無秩序なタンパク質の自己会合の検出と特性評価のための常磁性緩和増強

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核磁気共鳴分光法によるアルギニンメチロームの探索

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糖鎖-タンパク質相互作用の解きほぐし:核磁気共鳴(NMR)による解決

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