シロイヌナズナ根重力屈性反応の高分解能時間経過画像を収集するためにフラットベッドスキャナを使用して
2014年1月25日
このプロトコルは、市販のフラットベッドスキャナを使用して、重力刺激に応答するシロイヌナズナ実生の画像を迅速に収集するためのプロセスを説明します。この方法は、下流の分析アルゴリズムのために適した高解像度画像の安価な大容量の捕捉を可能にする。
このビデオの全体的な目標は、モデル植物のオプシスにおける根の熱帯反応の高解像度画像キャプチャのスキャナーベースの方法を説明することです。このプロトコルを開始するために、指定された種子ストックからの種子を透明な培地を含むペトリ皿に植える種子が指定された期間発芽した後、ペトリ皿を成長チャンバーから取り出し、スキャンのために準備し、次いで垂直向きのフラットベッドスキャナーに入れる。その後、プレートを90度回転させ、指定された時間だけスキャンします。
画像はコンピューターまたはデータストレージデバイスに保存され、後で画像処理に使用されます。画像取得の前に、Bスキャンした2つの植物組織を含むagaプレートを準備します。まず、AGAプレートの蓋と側面に溜まった結露をキムワイプで吸収します。
次に、Triton X 100をたっぷりと塗って、将来の結露を防ぎます。最後に、プレートをマイクロポアテープで包んで蓋を固定し、換気が画像取得を開始できるようにして、このプロセスを終了します。画像を目的の場所に保存するためのフォルダを設定します。
各フォルダ名は、スキャンする情報に関連するメタデータのコンパイルで構成されます。この例では、一意の ID の年齢、サイズ、およびシード ストックがフォルダー名に含まれるデータです。このメタデータは、コピーしてフォルダ名に貼り付けることができます。
このプロトコルは、複数のスキャナーを使用して画像を収集することを前提としており、複数のスキャナーを 1 台のコンピューターに接続する手順を提供します。そのため、画像を保存するためのフォルダが3つ設定されています。次のステップは、指定された収集時間にタイマーを設定することです。
この時点ではまだかなりの準備が必要ですので、タイマーを少し余裕を持ってセットしてください。次に、最初のスキャナーの電源を入れ、ビュースキャンプログラムを開きます。[入力]タブで、ソースを正しいスキャナーに設定し、[切り抜き]タブの下の[自動繰り返し]ドロップダウンボックスを[なし]に設定します。
プレビュー領域を最大に設定し、プレビューを押します。関心領域をキャプチャするクロップボックスを選択し、プレビュー領域をクロップボックスに設定します。その後、画像を再度プレビューします。
収集したデータを目的の場所に保存するには、出力タブを押して、各スキャナーに対応する以前に作成したフォルダー名を見つけます。次のスキャナーの電源を入れ、 view スキャン。他の 2 つのスキャナーの指示を設定し、データを保存する正しいフォルダーを選択していることを確認します。
また、各タブを調べて、すべてのスキャナー設定が希望どおりであることを確認することも重要です。私たちのラボでは、次の設定が行われている画像収集のタイプに最適であることがわかりました。ただし、画像コレクションの種類が異なれば、他の設定が必要になる場合があります。
すべての設定にチェックを入れたら、入力タブを選択し、3つのスキャナーすべてで自動繰り返しドロップダウンボックスを連続に設定します。準備したプレートを苗を水平に向け、背景のフェルト側をプレートに一時的に配置して、スキャナーの安定性を確保します。パートナーと一緒にこのプロトコルを実行する場合、1人がプレートを90度回転させ、すぐにフェルトの視覚背景、次に他の人がスキャンボタンを押し、両方がバンジーコードでスキャナーに背景を固定します。
スキャナー 2 と 3 に対してこのプロセスを繰り返します。各画像を完全にスキャンするには、約2〜3分かかりますが、最終的な画像は図のように表示されます。画像が保存されているフォルダをチェックして、すべてが適切に保存されていることを確認することをお勧めします。
指定された時間スキャンの間、スキャナーを邪魔のない領域に保管するのが理想的です。また、理想的な表現型応答を確保するために、スキャン領域の環境条件を考慮することも賢明です。次の画像は、このビデオで説明されている方法を使用して収集されたものの例です。
パネルAとB、CとDは、1回のスキャン期間の最初と最後の画像です。AとBは、スキャンされた領域全体を示しています。CとDはスキャンされた領域のトリミングされた領域であり、1つのプレートを示していますが、いくつかの不整合が観察される可能性があります。
図Aは、発芽と成長軌道の変動を示しています。画像Bはプレートが結露を蓄積する可能性があることを示しており、画像CとDは、苗の堅調な成長と実行全体の画像品質により、良好な結果であると考えられています。このホワイトペーパーで概説されている手順は、比較的手頃な価格でありながら、ハイスループットと高解像度であるという点で、ルートイメージングの世界における独自のニッチに適合します。
このアプローチのさらなる利点は、特定の研究グループのイメージングニーズに合わせて簡単にカスタマイズできることです。この方法は、他のイメージング用にもカスタマイズされています。
概要
このプロトコルでは、フラットベッドスキャナーを用いて、重力に応答するArabidopsis幼苗の高解像度画像をキャプチャする方法について説明します。この手法はコスト効率が高く、その後の解析に適した大量の画像収集が可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 植物生物学
- 画像解析
- 根の屈性反応
背景
- Arabidopsis（シロイヌナズナ）は、植物研究におけるモデル生物として利用されています。
- 重力に対する根の応答を理解することは、植物の発達研究において極めて重要です。
- 高解像度イメージング技術により、表現型解析のためのデータ収集が効率化されます。
- フラットベッドスキャナーは、ハイスループットイメージングのための低コストなソリューションを提供します。
研究の目的
- 根の屈性反応をキャプチャするためのスキャナーベースの手法を実証すること。
- その後の解析に向けた画像収集を容易にすること。
- 研究グループ向けにカスタマイズ可能なイメージングプロトコルを提供すること。
使用方法
- 種子はペトリ皿内の透明培地で発芽させます。
- プレートを垂直方向のフラットベッドスキャナーでスキャンします。
- 効率化のため、1台のコンピュータに複数のスキャナーを接続することが可能です。
- 最適な結果を得るために、画像取得設定を調整します。
主な結果
- 撮影された画像から、発芽および成長軌跡にばらつきがあることが示されました。
- プレート上の結露の問題が認められ、画像品質に影響を与えました。
- 高品質な画像が得られ、苗の力強い成長が実証されました。
- この手法により、ハイスループットでカスタマイズ可能なイメージングが可能になります。
結論
- 本プロトコルは、根の応答をイメージングするための有効な手段を提供します。
- 研究環境におけるさまざまなイメージングニーズに適応可能です。
- この手法は、データ収集におけるコストと効率のバランスを最適化しています。
よくある質問
産業界への適用性と重要性
根の重力屈性応答の高解像度表現型イメージングにより、植物ベースの治療薬探索における初期段階のターゲット検証でのメカニズム的なリスク低減が可能になります。この低コストでハイスループットなイメージング手法は、ダウンストリームの画像解析パイプラインに適した定量的なタイムラプスデータを生成することで、遺伝子機能研究における予測の信頼性を向上させます。本手法は、トランスレーショナルな連続性のためのデータ整合性を維持しつつ、探索生物学におけるスケーラビリティの課題を解決します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 遺伝子機能の表現型読み取りとして根の成長軌跡を定量的に測定することにより、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： 4,800 dpiの解像度で1日あたり216個の個別の応答をハイスループットに取得することで、生物学的リスクの低減を実現する。
- 予測的価値： 成長軌跡の変動を明確にする画像解析アプリケーション向けの高品質な画像データを十分に生成し、ポートフォリオの優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： 標準化され再現性のある化合物または遺伝子スクリーニングワークフローに向けて、検証済みの生物学的システム（透明培地上のシロイヌナズナ幼苗）を調製します。
- 運用上の価値： 安価なフラットベッドスキャナーを用いて数分ごとに自動タイムラプス画像取得を行うことで、アッセイの準備状態を管理します。
- 拡張性の価値： カスタマイズ可能なプロトコル設計および1台のコンピュータへの複数スキャナー接続により、プラットフォームの再利用やグループ間での適応を可能にします。
翻訳および前臨床研究
- トランスレーショナルバリュー： モデル生物において保存されたメカニズムである根の屈性反応の表現型定量化まで、発見から疾患関連システムの連続性を維持します。
- メカニズム的なリスク低減： 独立変数（重力ベクトルの変位）を分離し、従属変数（矯正成長）を高時間分解能で測定することで、ターゲットバリデーションにおける曖昧さを低減します。
- 予測の信頼性： 発芽および成長軌道の変動に関する統計的分析を可能にする定量的出力を提供し、リスク調整後の進展決定をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、標準化された定量的なフェノタイプデータを提供することで、初期段階のターゲットバリデーションにおけるGO/NO-GO判断の根拠となり、仮説検証からリード化合物同定に至る創薬の連続的なプロセスへと統合されます。
- 探索生物学：重力ベクトル方向からずれた苗の根における矯正成長の観察を可能にすることで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：制御されたプレート調製（Triton X-100およびマイクロポアテープによる結露防止）と一貫した画像保存プロトコルにより、アッセイの標準化と再現性を実現します。
- 分析：成長軌跡および発芽の整合性の定量測定に適した、4,800 dpiの高解像度タイムラプス画像データセットを生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：遺伝学的および薬理学的な摂動が可能なモデルシステムにおいて、疾患に関連する表現型のリードアウトを提供し、前臨床の連続性と結びつけます。
- エンタープライズ再利用：低コスト、高スループット、および研究グループ間でのカスタマイズが容易であるため、単発の手法ではなく、再利用可能なイメージング能力として機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 重力応答のフェノタイピングにおけるメカニズムの曖昧さを排除することで、ターゲットバリデーションの予測信頼性を向上させる。
- 運用上の価値： 自動スキャニングプロトコルと、データ整理のためのメタデータ駆動型のフォルダ命名法により、標準化、再現性、および拡張性を実現する。
- 戦略的価値： 大容量かつ高解像度のイメージングを用いた早期のフェノタイプによるリスク低減を通じて、より適切なgo/no-go判断、資本効率の向上、および後期の生物学的リスクの軽減を可能にする。
- ポートフォリオへの影響： 画像解析アプリケーションをサポートする十分な品質の画像データにより、リスク調整後の優先順位付けおよび推進決定が可能になる。
実施上の考慮事項
- 植物生物学およびArabidopsisの根のイメージングのための画像取得プロトコルに関する専門的な科学的知識が必要です。
- 装置としては、4,800 dpiの解像度を持つ垂直方向のフラットベッドスキャナーと、複数のスキャナーを操作するための単一のコンピュータへの接続が必要です。
- チーム間での標準化には、一貫したプレート作成（Triton X-100およびマイクロポアテープによる結露制御）と、再現可能なデータ保存のためのメタデータに基づいたフォルダ命名規則が必要です。
- モデルシステム間の適応については、異なる苗のサイズや成長条件に合わせて、スキャナーの向きやプレートの準備を調整する必要があります。
- 実用上の制限として、プレート上の結露の管理や、重力屈性反応を誘導するための90度回転時に苗の向きを安定させることが挙げられます。
