Name: 多価不飽和脂肪酸の食事補給線虫（Caenorhabditis elegans） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学ぶ、Caenorhabditis elegansを用いた多価不飽和脂肪酸の食事補給法。細菌培養とガスクロマトグラフィー質量分析で脂質組成を解析し、線虫の発育や生理における脂肪酸機能を解明する。

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私たちは、原稿上の有益なコメント代表的な結果を図3とジェイソンワットとクリス·ウェブスターのような予備実験を行うためのクリス·ウェブスターに感謝します。この研究のための資金はJLWに国立衛生研究所（米国）（R01DK074114）からの助成金によって提供された。この研究で使用されている一部の線虫株は研究基盤プログラムのNIHのオフィス（P40のOD010440）によって資金を供給される線虫遺伝学センターから提供された。

多価不飽和脂肪酸は、熱、光および酸素に敏感である。脂肪酸補充板を製造する場合、したがって、注意を払わなければならない脂肪酸が過剰な熱および光にさらされないようにする。 0.1％タージトール（NP-40）を含有するNGM培地は、脂肪酸ナトリウム塩を一定に攪拌しながら添加した後、オートクレーブし、部分的に冷却される。プレートを暗所で乾燥させる。 C.による脂肪酸の取り込みこれらのプレート上で培養エレガンスは、次いでガスクロマトグラフィーによって監視することができる。 1。脂肪酸補充培地の調製<ol><li>適切なサイズのフラスコに培地成分を測定します。 1 Lあたり、17グラムバクト寒天2.5グラムトリプトン3のNaCl、エタノールに溶解し1ミリリットル5 mg / mlのコレステロール、及び水10ミリリットルに溶解した10％タージトールを加える。 </li><li>ミリポア水の最終所望の​​体積の80％を追加して、別の数と同じ（空のガラスびんと一緒にメディアをオートクレーブ脂肪酸濃度が試験される）、ならびに適切なのメスシリンダー。 </li><li> 55℃に設定した水浴中でクールなメディア媒体は、ガラスバイアルをこじ開け安全注意事項を使用し、ガラス粒子は、脂肪酸で混合しない保証することにより、脂肪酸ナトリウム塩作業ストック溶液を調製し、冷却される。 100 mMのワーキングストックを作るために十分な脂肪酸を量る。 </li><li>精製水で100 mMの最終濃度までの脂肪酸溶液をもたらす。完全に脂肪酸ナトリウム塩を溶解することは、典型的には約20〜30分を要する。不活性ガスとの接触は酸化を防ぐので、アルゴン又は窒素を有する脂肪酸の​​作業ストックをパージする。バイアルに蓋をし、メディアが冷却されるまで暗闇での作業の在庫を保管してください。 </li><li> （任意）メディアのRNAiが所望される場合、ここにアンピシリンおよびイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）の溶液を測定する。 </li><li>寒天は55℃に冷却したときは、1Lあたりの追加C：11 MのMgSO 4 mlの1 M CaCl 2を 1mlのリン酸緩衝液25mlの（1 Lあたり108.3グラムのKH 2 PO 4、35.6グラムのK 2 HPO 4は、オートクレーブ処理）。 RNAiのプレートを作った場合、アンピシリンおよびIPTGソリューション滅菌フィルタを追加します。プレートのすべてのタイプのために、1 Lに、最終的なメディアボリュームを持って来るために滅菌水を追加</li><li>火気の近くで、オートクレーブ処理にメディアを転送し、適切にメスシリンダーをサイズにし、目的のボリュームに暖かい滅菌水を加えます。戻って最初のフラスコにメディアを転送し、攪拌して混合します。 </li><li>メスシリンダーにオートクレーブ処理し、適切な大きさで測定して、試験される濃度の数に等しい数のボトルへの火炎、転写媒体近。脂肪酸作業ストックが完全に溶解するまで水浴を使用して液体として等分メディアを維持する。 </li><li>メディアが触ると暖かく、しかし熱くないまで撹拌プレートおよび撹拌に1瓶を置きます。十分な自分を残していることを確認してください脂肪酸原液を加えて混ぜるとメディアが固化し始める前に、プレートを注ぐための時間。撹拌プレートは、温度制御されている場合は、55℃に設定し</li><li>所望の最終濃度のために培地に100mMの脂肪酸作業ストックに希釈する。白色の沈殿が溶液（約1分）になるまで、メディアを攪拌する。メディアはまだ、その後、わずかに白濁することがあります。 </li><li> RNAiのメディアが必要な場合（オプション）2 mMの最終濃度に添加し、IPTGを0.1mg /アンピシリンを追加します。 </li><li>培地を60mmプレート又は媒体100ミリメートル当たりプレート当たり25mlの培地を8mlを添加し、自動化ピペットエイドおよび滅菌を25mlピペットを使用して注ぐ。残りのボトル用のステップを注ぐ脂肪酸に加え、プレートを繰り返します。 </li><li>寒天が固化した後、光酸化から守るために、よく通気引き出しの中に、室温でボックスまたはストアと脂肪酸補充プレートをカバーしています。 </li><li>シードE.プレートが乾燥してきた2日後にプレートに大腸菌 OP50。60ミリメートルプレート、ピペット（37℃で増殖）一晩OP50文化300μlのため。 RNAiのプレートを注入した場合には、プレートを4日間乾燥した後に、RNAi細菌300μlのシード。プレートの乾燥時間は、様々な実験室環境における湿度の差に調整される必要があり得る。 </li><li>細菌ローンが乾燥している間、室温で暗い環境での培養する。 </li></ol> 2。 DGLAの補充によって生殖細胞破壊を誘発する<ol><li> C.が0.3mm DGLA（午後8時03分、N-6）を含むプレート上で成長した虫は、両方の幼虫期と成人線虫における生殖細胞の破壊に無菌になる。 <ol><li>アルカリ性次亜塩素酸溶液と妊娠雌雄同体を処理することにより、L1幼虫の同期化された人口を準備（10ミリリットルソリューションの：5MのNaOH、家庭用漂白剤を2.5ミリリットル、および7ミリリットルのH 2 Oを0.5ミリリットル）。優しく成虫まで、この溶液中の妊娠雌雄同体を揺するSが溶解する。卵は保持され、低速遠心分離によってペレット化することができる。 </li><li> （3グラムのKH 2 PO 4、6グラムHPO 4、5グラムのNaCl、1ミリリットルの1MのMgSO 4、H 2 O Lでオートクレーブ後のMgSO 4を追加する1〜2 Na）のM9バッファーに卵の準備を3回洗浄します。十分な酸素を提供するために、一晩振とう機上でM9バッファーやロックの5ミリリットルの最終容量に15ミリリットルのプラスチックチューブ内に卵を懸濁します。 </li><li>のL1幼虫は2日OP50、またはRNAi細菌をめっき後1日で播種後補足プレートに添加する必要があります。彼らは大人の段階に到達するまで3日間、20℃でワームをインキュベートか。 </li></ol></li><li>成虫は、子宮内発育する胚を可視化するために十分に高い倍率で解剖顕微鏡を使用して無菌性についてスコア化することができます。成功した生殖細胞の損失は、卵の明確な子宮無効として表示されます。 </li><li>ワームはまた、核酸aで固定し、染色によりスコア化することができますCID染料diamindinophenylindole（DAPI）、生殖細胞および発生中の胚中の核の可視化を容易にする。迅速なDAPI染色は時計皿9にM9バッファーの低下にワームを選ぶことによって達成される。 <ol><li> 0.2 ngの/ mで1ミリリットルと洪水ウォッチガラス。 DAPI 95％エタノール溶液中で、約5分間放置します。 </li><li>スライド上のベクタシールドのドロップにワームを選び、その後、カバーガラスでカバーしています。 </li><li>最適な染色のため、暗い一晩中4℃で密封カバーガラスとストアは、しかし、スライドは直ちに表示することができます。 UVランプとフィルターを備えた蛍光顕微鏡を用いて生殖細胞核の存在または非存在についてスコア。 </li></ol></li></ol> 3。ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸摂取を確認する C.全体の脂肪酸組成線虫を分離し、ガスのchrを使用して定量化される脂肪酸メチルエステル（FAME）を製造することによって決定することができるomatography 4。 <ol><li>水でプレートからそれらを洗浄し、シラン化された13ミリメートルX 100ミリメートルガラススクリュートップチューブに移すことによって、500〜1,000成虫を集める。 </li><li>ワームは、重力によって沈降してみましょう、その後、ガラスパスツールピペットを用いて、できるだけ多くの水を除去する。 </li><li>水で一度ワームを洗ってから、再度、できるだけ多くの水を除去する。 </li><li> FAMEを、水浴中で1時間、70℃で1〜2.5％のH 2 mlのメタノール中のSO 4、次いで加熱を加えることによって形成されている。 </li><li>水浴からチューブを外し、1分間冷やす。 </li><li> 1.5ミリリットルの水とヘキサンの0.25ミリリットルを追加することにより、脂肪酸メチルエステルを抽出します。 </li><li>要約チューブ、激しく振る。 </li><li>水系溶媒からヘキサンを分離するために最高速度で1分間卓上臨床遠心分離機中で遠心管。 </li><li> GCバイアルにヘキサン（最上層）を転送する水相のいずれかを転送しないように注意して、GC用バイアル内に挿入します。 GCのAのnalysis、ヘキサン中のFAMEの1-2μlのFAMEの分析に適した極性のキャピラリーガスクロマトグラフィーカラムに注入する。アジレント7890 GCインジェクタ1.4 ml /分の流速で、250℃に設定し、GCオーブン内で1分間保持され、130℃の初期温度にプログラムされている。その後、温度を190℃まで10℃/分の傾斜した後、210℃まで5℃/分で再び上昇させ、さらに1分間保持した。 </li><li> DGLAの取り込みが発生している保証するために、C.の同定のための真正標準物質を使用し、水素炎イオン化検出器（FID）または質量分析（MS）検出によって脂肪酸メチルエステルの分析脂肪酸のエレガンス 。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここでは、C.の補充方法を記載食事性の不飽和脂肪酸との虫 。前述したようなPUFAの二重結合の反応性の性質はこれらの脂肪酸は、熱と光11によって酸化に敏感であることが原因となるので、お手入れは、PUFAを補足プレートの準備に注意する必要があります。酸化を避けるために、メディアが暗い環境下で55℃を記憶プレートに冷却した後に液体寒天培地にPUFAを添加することが重要である。 他の人は、Cに遊離脂肪酸を導入しているエレガンス DMSOまたはエタノール担体を用いて、あるいは直接、外陰部12-14へのマイクロインジェクションにより脂肪酸を添加することにより。変異体の表現型の部分的な救済は、タージトール（NP40）14-15を使用することなく成長板の脂肪酸補充することによって達成された。 C.内に脂肪酸を導入するのに有効な様々な方法が明らかに存在する虫 、それはディですがほとんどの実験では、線虫における脂肪酸の​​取り込...

脂肪酸は膜の必須構造成分、ならびに効率的なエネルギー貯蔵分子である。さらに、脂肪酸は、リパーゼにより細胞膜から切断することができ、酵素的にシグナル伝達エフェクター1を産生するように改変することができる。天然に存在する多価不飽和脂肪酸（PUFA）は、二つまたはそれ以上のシス二重結合を含有する。オメガ-3脂肪酸とオメガ-6脂肪酸は、脂肪酸のメチル末端に対する二重結合の位置に基づいて互いに区別される。健康な食事は、ω-6およびω-3脂肪酸の両方を必要とする。しかし、西洋の食事はオメガ-6脂肪酸とオメガ-3脂肪酸に劣るが特に豊富である。高オメガ6オメガ-3脂肪酸比は、心血管疾患および炎症性疾患のリスクの増加、しかし、特定の脂肪酸の正確な有益と有害な機能はウェル2に理解されていないと関連している。回虫線虫elegaそれはω-3デサチュラーゼ、ほとんどの動物3,4には存在しない活性を含むオメガ-6およびオメガ-3脂肪酸の範囲を生成するために必要な酵素の全てを合成するため、ナノ秒は、脂肪酸の機能を研究するのに有用である。脂肪酸不飽和化酵素を欠いた変異体が発達し、神経学的欠陥4-6の範囲につながる、特定のPUFAを生産することができない。 食事性脂肪酸の生理的効果を研究するために、我々はCの両方の変異体およびRNAiノックダウン技術を使用して、遺伝子解析と互換性の生化学的ア ​​ッセイを開発してきた虫 。特定のPUFA補充の前注ぐ寒天培地への脂肪酸のナトリウム塩溶液を添加することによって達成される。これはEで、PUFA摂取になりそれは細菌膜に蓄積大腸菌食料源、。C.虫は、PUFAを含む細菌を摂取し、この栄養補給は、欠陥品を救出するのに十分であるPUFA欠損変異体のTS。ほとんどの脂肪酸の補給は、野生型動物に有害な影響が、特定のオメガ-6脂肪酸、特に、ジホモ-γ-リノレン酸（DGLA、20:3のn-6）C.の永久的な破壊を引き起こすことがありませんエレガンス生殖細胞7,8。 ガスクロマトグラフィーは、細菌の食料源（OP50又はHT115のいずれか）ならびに線虫に補充脂肪酸の取り込みを監視するために使用される。培地中の界面活性剤タージトール（NP-40）の添加は、全体のプレートとE.による脂肪酸のより効率的な取り込みを介して脂肪酸の均一な分布を可能にする大腸菌や線虫。我々は、不飽和脂肪酸が容易に細菌およびC.によって取り込まれることを見出した虫が、飽和脂肪酸の取り込みはあまり効率的である。この記事では、脂肪酸と寒天培地を補足する方法、ならびに第における脂肪酸の​​取り込みを監視する方法を段階的に説明するガスクロマトグラフィーを使用して電子線虫。

<table><tbody><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Difco</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S-500mL</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>Σ</td><td>C8667-25G</td><td>(エタノール中5mg/mL)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>2504-01</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3254-05</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3246-05</td><td></td></tr><tr><td>リノレン酸ジホモガンマナトリウム</td><td>NuCHEK</td><td>S-1143</td><td></td></tr><tr><td>ミリポア水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ワーム</td><td></td><td></td><td></td>収集用滅菌水</tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー DGLAストック溶液用水</td><td>アンビオン</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1760-25</td><td>100 mg/ml 水溶液 (RNAi プレート用)</td></tr><tr><td>イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>ゴールドバイオテクノロジー</td><td>12481C100</td><td>1 M 水中 (RNAi プレート用)</td></tr><tr><td>HSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>9681-03</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>・フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>ジアミンジノフェニルインドール (DAPI)</td><td>シグマ</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>ベクタシールド</td><td>ベクター・ラボラトリーズ</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>ガラスフラスコ</td><td>コーニング</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>攪拌子が付いているautoclaveableガラスびん</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-800</td><td></td></tr><tr><td>Autoclaveable ガラスはシリンダー</td><td>Fisherbrand</td><td>08-557</td><td></td></tr><tr><td>55+の攪拌板</td><td>VWR</td><td>97042-642</td><td></td></tr><tr><td>Waterbathで55+およびdeg;C</td><td>プレシジョンサイエンティフィック株式会社</td><td>66551</td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップブラウンガラスバイアル</td><td>サンSRI</td><td>200 494</td><td></td></tr><tr><td>アルゴンガスタンク</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>自動ピペットエイド</td><td>ピペットエイド</td><td>P-90297</td><td></td></tr><tr><td>滅菌血清ピペット(25 ml)</td><td>コーニング</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>ブンゼンバー</td><td></td><td>ナーVWR89038-534</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td></td>TLB3000</tr><tr><td>シラン化ガラス管</td><td>Thermo Scientific</td><td>STT-13100-S</td><td>for FAMEs derivitization</td></tr><tr><td>PTFE スクリューキャップ</td><td>Kimble-Chase</td><td>1493015D</td><td></td></tr><tr><td>臨床卓上遠心分離機</td><td>IEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC クリンプバイアル</td><td>SUN SRi</td><td>200 000</td><td></td></tr><tr><td>GC バイアルインサート</td><td>SUN SRi</td><td>200 232</td><td></td></tr><tr><td>GC バイアルキャップ</td><td>SUN SRi</td><td>200 100</td><td></td></tr><tr><td>ガスクロマトグラフ</td><td>Agilent</td><td>7890A</td><td></td></tr><tr><td>質量分析検出器</td><td>Agilent</td><td>5975C</td><td></td></tr><tr><td>ガスクロマトグラフィー用カラム</td><td>Suppelco</td><td>SP 2380</td><td>30 m x 0.25 mm 溶融シリカキャピラリーカラム</td></tr></tbody></table>

多価不飽和脂肪酸の食事補給<em&gt;線虫（caenorhabditis elegans）</em

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

脂肪酸は、非常に多くの細胞機能に必須である。それらは、膜の疎水性コアを構成し、効率的なエネルギー貯蔵分子を提供し、種々のシグナル伝達経路に関与する。 線虫（Caenorhabditis elegans）は、オメガ-6及びオメガ-3脂肪酸の範囲を生成するのに必要な酵素の全てを合成する。これは、簡単な解剖学および利用可能な遺伝的手段の範囲と組み合わせると、脂肪酸の機能を研究するための魅力的なモデルにする。食餌性脂肪酸の生理学的効果を媒介する遺伝的経路を調べるために、我々はC.を補足する方法を開発した不飽和脂肪酸とエレガンスダイエット。補充は、ワームの脂肪酸組成を変化させる有効な手段であり、また、脂肪酸欠損変異体における欠損をレスキューするために使用することができる。我々の方法は、脂肪acidsodium塩を補充した線虫の増殖培地寒天（NGM）を使用しています。 incorporaなっ補足プレート中の脂肪酸次いで、C.によって取り込まれる細菌の食物源の膜へテッド補足細菌を餌虫 。また、補充ワームで発生する脂肪酸組成の変化を監視するために、ガスクロマトグラフィープロトコルを記載している。これはCの大小の集団の食生活を補完する効率的な方法です虫 、このメソッドの応用範囲を可能にする。

Cの補充食虫 、細菌膜への脂肪酸取り込みおよび組み込む細菌の食物源の能力によって制限される。 Eの能力を決定するその膜内に様々な脂肪酸資化大腸菌 OP50は、OP50はノーサプリメント、0.1 mMおよびステアリン酸（午前18時00分）、オレイン酸ナトリウム（18:1のn-9）およびナトリウムDGLA（20 0.3mMの濃度で培地上にプレーティングした：3nは-6）。プレートを暗所で2日間室温で乾燥させ、3日間20℃でインキュベートした。細菌叢を穏やかに火炎滅菌したスパチュラで水に芝生を掻き取って回収した。細菌を遠心分離によってペレット化し、2.5％のH 2で処理したSO手順に記載されている方法は、ステップ3次のGC / MSにより分析した脂肪酸メチルエステルを製造するメタノール中4。結果は、不飽和脂肪酸（オレイン酸およびDGLA）がtよりも高い量でOP50に組み込むことを実証<html>彼は、脂肪酸、ステアリン酸（ 図1A）を飽和させた。 <p class="jove_cont...

の&lt;em&gt;線虫のエレガンは&lt;/ em&gt;は、開発と生理学で多価不飽和脂肪酸の機能を探求するための有用なモデルである。このプロトコルは、の&lt;em&gt; Cを補充する効率的な方法を説明します虫&lt;/ em&gt;の多価不飽和脂肪酸とダイエット。

多価不飽和脂肪酸の食事補給<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

次の実験の全体的な目標は、脂肪酸の機能と調節を研究するために、食事療法を使用してシーエレガンスの脂肪酸組成を変更することです。これは、不飽和脂肪酸の存在下で線虫の食物源を培養することによって達成されます。次に、シーエレガンスにサプリメントを補給したバクテリアが供給され、脂肪酸の取り込みとワームへの取り込みが可能になります。その後、脂質は海の優雅さに変わります。脂肪酸組成は、ガスクロマトグラフィー質量分析によって確認されます。最後に、不飽和脂肪酸を食べた後、ワームの無菌性がスコアリングされます。脂肪酸組成の変化による発生挙動による生理学的影響、および遺伝子発現の変化を示す結果が得られました。この方法は、遺伝子操作と食事の寄与の両方を使用して脂肪酸組成を変更し、その結果を監視できるため、海のエレガンス開発と生理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。一般に、この方法に不慣れな個人は、不飽和脂肪酸が酸素や高温に敏感であるため、一貫した結果を得ることが難しいため、慎重かつ慎重に行う必要があります。脂肪酸を添加した培地を1リットル調製するには、フラスコに次の成分を量ります。最大800ミリリットルのミリポア水を追加し、培地をオートクレーブで、試験する各脂肪酸濃度用の空のガラス瓶と適切なメスシリンダーとともに、培地を55°Cで冷却します。ガラス粒子が粉末に入らないようにガラスバイアルを慎重に割って開き、100ミリモルの原液が必要な量の精製水を加えるのに十分な重さを量ることにより、脂肪酸ナトリウム塩の作業用原液を準備します。次に、アルゴンガスまたは窒素ガスを使用して溶液をパージし、脂肪酸の酸化を防ぎます。次に、バイアルにキャップをし、脂肪酸、ナトリウム塩が溶解している間、バイアルを暗闇に保管します。アグリが次の55°Cに冷却されたら、次に炎の近くで、溶液を滅菌メスシリンダーに移しました。滅菌水を1リットルまで加える前に、培地をフラスコに戻し、混合を続けます。滅菌メスシリンダーを使用して、試験する脂肪酸濃度ごとに培地のアリコートを1つのオートクレーブボトルに移します。次に、攪拌プレートの上でボトルを保温します。滅菌済みの25ミリリットルピペットを使用してプレートを注ぐ前に、適切な濃度の脂肪酸ストック溶液で攪拌し、プレートが固まった後、プレートを注ぎ、室温で暗くてよく吟味された場所に保管します。2日後、大腸菌OP50を使用してプレートに播種し、細菌の芝生が乾燥している間に室温の暗い環境でプレートをインキュベートします。L.1匹の幼虫の同期個体群を調製するには、Ravi雌雄同体をアルカリ性次亜塩素酸塩溶液で処理します。この溶液でGR雌雄同体を、成虫が溶けるまで穏やかに揺さぶります。次に、低速で遠心分離して卵をペレット化します。M nineバッファーを使用して卵を3回洗います。次に、15ミリリットルのチューブに、5ミリリットルのMナインバッファーとロックに再懸濁して一晩待ちます。0.3ミリモルジホモガンマリン酸またはDGLAを添加したOP 50播種プレートにL one幼虫を加え、摂氏20度で3日間、または幼虫が成虫になるまでインキュベートします。解剖顕微鏡を使用して、成虫の不妊性をスコアリングします。成功した細菌の喪失は、卵子のない透明な子宮として現れます。あるいは、時計のガラスにM9バッファーのドロップにワームを拾い上げてスコアを付けます。次に、1ミリリットルあたり0.2ナノグラムのダッピー溶液を1ミリリットル使用して時計のガラスを浸し、約5分間インキュベートします。インキュベーション後、カバースリップで覆う前にスライド上の封入剤に線虫をピッキングし、カバースリップを密封し、暗所で摂氏4度で一晩保存するか、蛍光顕微鏡ですぐに観察して脂肪酸メチルエステルまたは名声を生成します。脂肪酸の取り込みを定量化するには、500〜1000匹の成虫を水で採取し、プレートから洗い流し、シリコン処理に移します。13 x 100 mm ガラス製スクリュートップチューブ。ワームが重力によって落ち着くのを待ってから、ガラスのパストピペットを使用してできるだけ多くの水分を取り除きます。メタノールに2.5%硫酸の1ミリリットルを追加し、ボンネットの下で1分間冷却した後、70°Cの水浴で1時間チューブを加熱し、1.5ミリリットルの水と0.25ミリリットルのヘキサンを追加してフレームを抽出します。チューブをキャップし、激しく振ってください。次に、卓上型臨床遠心分離機でチューブを1分間遠心分離し、ヘキサンを水性溶媒から分離します。上部のヘキサン層をGCバイアル内のガスクロマトグラフィーまたはGCバイアルインサートに移します。gcで分析するには、1〜2マイクロリットルの名声を、名声分析に適した極性キャピラリーガスクロマトグラフィーカラムに注入します。インジェクターを摂氏250度に設定、流量は毎分1.4ミリリットルです。オーブンを摂氏130度の初期温度にプログラムし、1分間保持します。次に、温度が摂氏190度に達するまで毎分摂氏10度で上昇させ、次に再び摂氏5度で摂氏210度まで上昇させ、さらに1分間保持してDGLAの取り込みが行われたことを確認します。フレームを水素炎イオン化検出、質量分析、または真正な標準物質を使用したMS検出により、海のエレガンスを同定します。海のエレガンスダイエットの脂肪酸の補給は、細菌の食物源が脂肪酸を取り込み、細菌の膜に脂肪酸を取り込み、その膜に様々な脂肪酸を同化する大腸菌OP 50の能力を決定する能力によって制限されます。OP50は、この図に見られるように、0.1ミリモルおよび0.3ミリモルの濃度の立体酸、ナトリウムアテ、およびDGLAナトリウムを添加せずに培地に播種した。GCMSによる名声分析は、オレイン酸およびDGLAを含む不飽和脂肪酸が飽和脂肪酸ステリック酸よりも高いレベルでOP50に組み込まれることを実証している。また、成虫期の線虫の脂肪酸量を測定したところ、飽和脂肪酸の補給は線虫組織の飽和脂肪酸の相対量に影響を与えないことがわかりました。しかし、不飽和脂肪酸を補給すると、これらの脂肪を一緒に摂取する相対量が増加しました。これらのデータは、サプリメントを摂取した脂肪酸の相対的な蓄積が、食事性大腸菌の脂肪酸の相対的な蓄積と直接相関していることを示しています。前に示したように、このグラフは、シーエレガンスにおけるDGLAの不妊誘導の線量反応を示しています。人口の50%が不妊になる線虫脂質中のDGLAの濃度は約12%であり、興味深いことに、DGLAに対する応答は線虫の遺伝子変異によって変化する可能性があります。インスリン成長因子依存性ストレス経路がDGLA誘発性生殖細胞破壊に影響を与える可能性があるという最近の発見に基づいています。我々は、DAF 2インスリンIGF受容体またはDAF 16 FOXO転写因子のいずれかに有害な変異を含む線虫の食事を補充しました DGLAを使用すると、各株の不妊性のスコアリングは、DAF 2変異体が肥沃であり、両方のDGLA濃度で野生型の線虫と比較して、誘発された生殖細胞の損失がほとんどまたはまったくないことを示しました。対照的に、不活性なvox Oを添加したDGLAの寄生虫は、0.15ミリモルの脂肪酸を含むプレートに給餌した場合、野生型と比較して不妊寄生虫の割合が高かった。この手順に従うと、研究者は、遺伝子発現研究、行動アッセイ、発生または生殖分析など、補足された海の優雅さで多数のアッセイを実行できます。これらのアッセイにより、これらのプロセスにおける特定の脂肪酸の役割が明らかになります。このビデオを見た後、海のエレガンスの脂肪酸組成を変更するために使用できる脂肪酸サプリメント培地を一貫して調製する方法をよく理解しているはずです。

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Biology

生物学

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刺激されたラマン散乱顕微鏡を用いた カエノラム型エレガンス における脂質蓄積ダイナミクスの無標識イメージング

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細菌クリアランスの測定による 線虫 の食物摂取量の定量化

学ぶ、Caenorhabditis elegansを用いた多価不飽和脂肪酸の食事補給法。細菌培養とガスクロマトグラフィー質量分析で脂質組成を解析し、線虫の発育や生理における脂肪酸機能を解明する。

多価不飽和脂肪酸の食事補給

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