大人の齧歯類の脳の従来の従来にない地域から神経幹細胞を増殖させる

次の実験の全体的な目標は、成体のげっ歯類の脳のさまざまな領域から神経幹細胞培養物を生成することです。これは、神経幹細胞の存在と可能性を調べるために、関心領域から組織を採取することによって達成されます。第2のステップとして、組織を細胞懸濁液に加工し、単層培養としてプレーティングします。

次に、定義された培養条件を使用して神経幹細胞を選択的に増殖させ、神経幹細胞の自己複製能を検証します。In vitroの結果は、神経幹細胞が分化能に基づいて多能性であること、およびさまざまな要因が神経幹細胞の自己複製と運命にどのように影響するかを示しています。この方法は、内因性神経幹細胞がどこに存在し、どのように操作するかなど、神経科学および再生医療分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

この手法を最初に考えたのは、シグナル削減経路を発見したときです。これにより、推定される内因性神経幹細胞を特定し、その数を制御することができました。そこで、この知識を応用して、脳のさまざまな領域からこれらの細胞の堅牢な培養を確立しました。

それらの特性を研究し、それらは本当に幹細胞なのかという疑問を投げかけてください。適切な培養皿の準備は、予定された解剖の2日前に、75マイクログラム/ミリリットルのポリLオルニチンで皿をコーティングすることが重要です。次に、翌日プレートを一晩インキュベートし、ポリLオルニチンを吸引し、各ウェルを3ミリリットルのPBSで1回の洗浄につき5分間2回洗浄します。

その後、プレートはインキュベーターで最大3週間保存できます 最終洗浄液を取り除いた後、PBSで1〜250に希釈した繊維ninを穏やかなピペッティングで加えます。溶液を過度に攪拌しないように注意してください。次に、解剖の日にプレートを一晩インキュベートします。

フィブロネクチンを吸引し、PBSで皿を2回洗います。最終的なPBS洗浄でプレートをインキュベーターに戻し、解離した組織を待ちます。未使用のプレートはインキュベーターに最大1週間保存できますが、乾燥させたり攪拌したりしないでください。

このプロトコルのデモンストレーションは、3匹の成体ラットにスケーリングされます。まず、最初のラットを安楽死させる前に、氷の上で脳切片ブロックを冷やしてください。次に、5ミリリットルのN、2、中、および基本的なFGFを含む15ミリリットルの円錐管を氷上に準備します。

安楽死させたラットから脳を取り出した後、氷冷PBSが入った10センチメートルのシャーレに脳を入れます。次に、脳を髪の毛や血液が残っていないPBSの2番目の皿に移します。次に、脳を冷やした切片ブロックに入れ、新しいきれいなカミソリの刃をブロックに1枚挿入し、細胞を生成する関心領域の近くに

次に、2枚目のきれいなカミソリの刃を挿入します。最初のカミソリの刃まで3ミリメートルのコドル。ブレードをブロックから慎重に持ち上げ、関心のあるセクションを一緒に取ります。

PBSに浸して、ブレードからセクションを浮かせます。次に、5番の鉗子を使用して関心のある領域を収穫します。この例では、セクションには前交連が含まれています。もちろん。

セクションを、基本的なFGFを含む5ミリリットルのN、2媒体を含む15ミリリットルの円錐管に集めます。次に、溶液の量を1〜2ミリリットルに減らします。次に、細胞培養フードに1ミリリットルのピペットチップを円錐形の底に沈め、約20回の流れの溶液を使用して組織を機械的に解離させます。

溶液が均一になったらイオンを停止し、数分間放置して、より大きな非関連組織が底に沈殿するようにします。次に、組織の塊を含まない均質な上清を、8.5ミリリットルのサプリメントと2つの培地を含む円錐形のチューブに移します。チューブの中身を混ぜ合わせて、6個用意しました。

ウェルプレート。PBSをウェルから取り出し、次の10〜14日間の培養で、ウェルごとに3ミリリットルの細胞混合物を3つのウェルに加えます。一日おきにメッキの24時間後から、一日おきに新鮮なサプリメントN 2と培地を交換し、N 2に新鮮な量のサプリメントを追加します。

培地からすでに細胞上にある培地へ。培地条件への細心の注意は、細胞を未分化に保ち、その増殖を可能にするために不可欠です。最初の培地交換後、大量の細胞破片が血管とともに残りました。

しかし、その後数日間で、増殖する幹細胞のコロニーが見えてきました。また、より細長い紡錘体様の細胞集団も存在していました。これらは神経幹細胞ではなく、神経幹細胞が増殖するにつれて最終的に追い越されました。

その後の2週間で、神経幹細胞はより密度が高くなり、合流点に達しました。これらの培養物は、SOX 2、hesi、nestを含む多くの幹細胞マーカーに対して陽性で染色されました。これにより、選択および増殖した細胞集団が実際に神経幹細胞であるという確信を得ることができます。

さらに確認されたのは、培地からFGFを回収した後で、細胞がニューロン、アストロサイト、およびすべてのセンドラサイトに10日間分化することを可能にしました。差別化を誘発するため。補充されたN 2培地をunsu補充N 2と交換し、培地と10日間この方法で細胞を培養し、10日後に48時間ごとにN 2を交換し、培地を吸引し、ウェルあたり2ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドで細胞を20分間固定します。

固定剤を3ミリリットルのPBSで2回、1回の洗浄につき5分間洗い流します。2回目の洗浄を吸引した後、5%正常ロバ血清と0.1%トリットンX 100を含むPBSを2ミリリットル加えて細胞を透過し、ブロックし、細胞を室温で20分間インキュベートします。5%NDSを含むPBS中の一次抗体ミックスを調製します。

この例では、抗T UJ one抗体を適用してニューロンを同定し、GFAP抗体とCPA抗体を使用してアストロサイトとオリゴデンドロサイトをそれぞれ可視化しています。20分後、ブロッキング溶液を吸引し、それぞれに1.5ミリリットルの一次抗体混合物を加えます。細胞をよくインキュベートします。

90分後に室温で90分間加え、細胞を2つのPBS浴で洗浄し、続いて5%NDSを含むPBSを1回塗布し、3ミリリットルの溶液と5分間の浴を使用します。最終洗浄液を取り除いた後、5%NDSを含むPBS中の1.5ミリリットルの二次抗体をそれぞれに塗布します。その後、プレートを暗所に置き、室温で40分待ちます。

40分後、セカンダリーを2ミリリットルの新しく準備したDPIステインと交換し、3分間待ちます。DPI溶液を吸引した後、細胞を3ミリリットルのPBSで3回、洗浄ごとに5分間洗浄します。その後、この手順に従って細胞を顕微鏡検査する準備が整います。

ウェスタンブロットなどの他の方法を使用して、薬理学的処理または細胞分化の過程で生じるタンパク質発現とリン酸化の変化を調べることができます。この技術の開発後、それは実際に神経科学の分野の研究者が、マウス、ラット、さらには霊長類を含むいくつかの異なる種で研究に実装した新しい方法をテストする道を開きました。