仮想現実環境をナビゲートマウスにおける二光子カルシウムイメージング

次の実験の全体的な目標は、マウスで慢性的な2光子イメージングの主要な側面を実行し、仮想現実環境を探索することです。これは、行動するマウスで高速かつ安定したイメージングのために2光子顕微鏡を改造することによって達成されます。次に、移動追跡が可能なエアサポートトレッドミルが設置されます。

次に、光漏れを最小限に抑えるために、顕微鏡に同期したLEDプロジェクターを使用した仮想現実環境を準備します。その結果、動きのアーチファクトの減少、光漏れの減少、フォトダメージエッジの最小化により、良好で安定した画像記録が得られます。この方法は、仮想現実環境でのナビゲーション中の神経活動を測定するために使用できますが、視覚刺激を必要とするさまざまな行動パラダイムにも簡単に適応できます。

すべての動物の手順は、カントンバジル駅の獣医学部のガイドラインに従って承認され、実施されました。これらの実験で使用した2光子顕微鏡は、8キロヘルツまたは12キロヘルツの共振スキャナーと標準的な検流計で構成されるスキャンヘッドで構成されています。これにより、400ピクセル×750で40ヘルツまたは60ヘルツのフレームレートが可能になり、脳の動きによる画像の歪み、光退色、光毒性が軽減されます。

圧電高速Zステッパーを使用して、複数の深さで時間インターリーブ画像を逐次取得します。メカニカルブランカーは、スキャンパスのターンアラウンドポイントで組織へのレーザー曝露を減らすために使用され、ブランカーの幅を設定するために調整可能でなければなりません。レゾナントスキャナーの振幅にもよりますが、トレッドミルのボールホルダーに内径10mm以上のエア供給チューブを接続し、メインエア供給とボールホルダーの間にBLE量のチューブを配置してノイズを低減します。

直径20cmの発泡スチロールボールを、カスタムデザインされた3Dプリントされたボールホルダーに入れます。行動パラダイムが前方と後方の移動のみを必要とする場合は、ボールの側面に19ゲージの皮下注射針などのピンを挿入します。水平軸でのボールの動きを制限するには、1つまたは2つの光学コンピュータマウスを使用して、それぞれ2つまたはすべての3つの軸を中心にボールの動きを追跡します。

バーチャルリアリティ環境を準備するには、ディスプレイにLEDプロジェクターまたはLEDバックライト付きコンピューター画面を使用します。イメージング中にLEDがすばやく点滅するためのゲート回路を統合します。24キロヘルツのちらつき周波数は、ちらつき融合の閾値を桁上回っており、それを超えると動物はちらつきを知覚できなくなります。

正確なちらつき周波数とデューティサイクルを調整して、プロジェクターの光出力を瞳孔追跡用の共振スキャナーのターンアラウンドポイントに同期させ、CMOベースのビデオカメラを使用します。カメラに赤外線遮断フィルターが含まれていないことを確認してください。遺伝的カルシウムインジケーターを注射し、頭蓋窓を埋め込んでから約2〜3週間後、落射蛍光照明を使用して、頭蓋窓インプラントの明瞭さと発現を確認します。.

はっきりと見え、はっきりと定義されています。表在血管の境界は、ウィンドウインプラントが1〜2日後のイメージングに適していることを示す良い指標です。2光子実験を行うには、サンプルでレーザー出力を測定し、50ミリワット未満の値に調整します。

次に、球形トレッドミルへのエアフローをオンにします。次に、動物を球形のトレッドミルに固定します。最初の数回はマウスが頭を固定しています。

このプロセスは、動物をイソフッ素で短時間鎮静させることで緩和できます。動物が手順に慣れると、通常、鎮静剤なしで取り付けを行うことができます。この手順では、動物へのストレスを最小限に抑えることが重要です。

次に、ビジュアルディスプレイシステムを動物にできるだけ近づけて配置し、動物にアクセスできるようにします。頭蓋窓インプラントに汚れがないことを確認し、必要に応じて水で洗浄し、頭蓋窓と水浸対物レンズの間に透明な超音波ジェルを浸漬媒体として塗布して光を遮蔽します。対物レンズとヘッドバーに黒いテープを巻き付けます。

仮想環境アリーナを最終位置に移動し、瞳孔追跡用にビデオカメラを調整します。最後に、レーザーブランカーを実験中に使用したスキャン振幅と一致するように設定し、実験が完了したらデータの記録を開始します。あなたの機関のガイドラインに従って動物を安楽死させてください。

遺伝的カルシウムインジケーターで標識された細胞集団の2光子カルシウムイメージングの画質は、ウイルス注射後の頭蓋窓の明瞭さを確認するときにここで示されるように、頭蓋窓インプラントの品質に大きく依存します。肉芽組織や骨の再成長は見えません。さらに、表在血管のパターンは変化せず、血管系の境界は明確に定義されるべきです。同時に、標識された細胞のBOIは、エピ蛍光顕微鏡ではっきりと見える必要があります。

理想的には、マウスの移動によって誘発される2つの光子画像の歪みがフレームレジストレーション後の画像に見えないように、準備が十分に安定しています。視覚刺激システムからの光漏れは、プロジェクターの光出力を共振スキャナーのターンアラウンドポイントに正しくタイミングを合わせることで完全になくすことができます。データを取得しない場合、光源のちらつき周波数はスキャン周波数の2倍にする必要があります。

この例では、視覚刺激中にオレンジ色のボックスに示されている光漏れの影響を示すために、ブランカーが取り外されています。このビデオを見た後、イメージング、マウスの行動、バーチャルリアリティ環境のナビゲートの2つの機能を実行する方法を十分に理解しているはずです。ここで説明したように、イメージングシステムとバーチャルリアリティシステムのセットアップに加えて、これらの実験で成功するための鍵は、頭蓋窓インプラント技術を習得することです。

クリーンなインプラントは、高品質の画像と安定した録音の前提条件です。