マイクロ波支援ポリの機能化（エチレングリコール）と連鎖重合で使用するためには樹脂ペプチドおよびヒドロゲル形成

この手順の全体的な目標は、ポリエチレングリコールとペプチドをメタアクリレート基で官能基化し、その後の連鎖重合とヒドロゲル合成を行うことです。これは、まず無水メタアクリルと国連官能基化前駆体をシンチレーションバイアルで組み合わせることによって達成されます。2番目のステップは、マイクロ波エネルギーを使用してペグまたはペプチドを官能基化することです。

次に、PEG DMをクロロメタンに溶解するか、ペプチドを樹脂から切断します。また、すべての側鎖保護基は、酸ベースのカクテルで除去されます。最後のステップは、エーテル中のPEG DMまたはメタアクリルアミド官能化ペプチドを沈殿させることです。

最終的には、プロトンNMRまたはマルディ飛行時間型質量分析を使用して、PEGまたはペプチドマクロの機能化が成功したことを示します。こんにちは、私の名前はエイミー・ヴァン・ホーブです。私はロチェスター大学の医用生体工学科の博士課程の学生です。

この手法は、PEGをメタアクリルフッ化物と反応させるなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、反応が大幅に速く、より環境に優しいことです。こんにちは、私の名前はブランドン・ウィルソンです。私はロチェスター大学の化学工学の学部生です。

この方法は、PEGジメチルを使用してハイドロゲルがどのように生成し、分子内の治療細胞の送達を制御できるかなど、生体材料分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。こんにちは、私はロチェスター大学の医用生体工学科の助教授であるダニエル・ブノワです。この技術の意味は、合成された化合物を細胞および薬物送達アプリケーションに使用できるため、さまざまな疾患の治療法を開発するためのものです。

この手順を開始する前に、大きなホエイボートの水による汚染を防ぐために、必要なガラス器具をオーブンで1時間乾燥させました。1000 から 100, 000 ダルトンの間の分子量のペグの 5 グラムをウェイアウトします。プラスチック片がある場合は、ケミカルフード内のシンチレーションバイアルの蓋からプラスチック片を取り出します。

10モルの過剰な無水メタアクリルを破れたシンチレーションバイアルに分注します。.次に、バイアルにPEGを追加します。次に、キャップをバイアルにゆるくねじり、バイアルを電子レンジに入れます。

耐熱手袋を着用して、電子レンジを最大出力で5分に設定します。バイアルを電子レンジから30秒ごとに取り出します。次に、キャップを完全に締め、サンプルを30秒間ボルテックスします。

バイアルを電子レンジに戻す前に、キャップを緩めてください。溶液が電子レンジで5分間加熱されるまで、これらの手順を繰り返します。バイアルを電子レンジから取り出した後、キャップを緩め、PEG DMを室温まで冷まします。

次に、PEG DMを10〜15ミリリットルのジクロロメタンに溶解します。PEG DMを10倍を超えるプレダチルエーテルに20分間沈殿させます。7センチのバックナーファンネルと500ミリリットルのフラスコを使用。

真空ろ過によりPEG DMを回収します。次に、ろ過したPEG DMを50ミリリットルの円錐管に移し、キャップに大型ゲージの針を通して換気します。チューブを真空チャンバーに入れ、PEG DMを一晩乾燥させます。

真空チャンバーからチューブを取り外した後、赤はPEG DMを氷冷ダチルエーテルでDIクロロメタン沈殿物に溶解します。ろ過および回収後に非反応性無水メタアクリルを除去するには、以前と同じ方法でPEG DMを真空チャンバーで乾燥させます。プロトンNMR分析では、シンチレーションバイアルに約10ミリグラムのPEG DMを入れ、約1ミリリットルの重水素化クロロホルムを添加します。

サンプルが溶解したら、きれいなNMRチューブに移します。次に、プロトンNMRスペクトルを収集し、サンプルを室温で少なくとも64回のスキャンで分析して、十分なデータ分解能を取得します。目的のペプチドを固相合成で合成した後、DMF中のレジン上に4°Cで保存します。

次に、濾紙と250ミリリットルのフラスコを備えた7センチメートルのバックナー漏斗を使用して、ろ過によりペプチド樹脂を回収します。シンチレーションバイアルの蓋からプラスチック片を取り出し、レジンをバイアルに移します。使い捨てピペットを使用して、樹脂を覆うのに十分な量のメタアクリル無水物を追加しますキャップをバイアルにゆるくねじった後、電子レンジに入れ、タイマーを3分に設定します。

耐熱手袋を着用して最大電力で、15〜20秒ごとにバイアルを電子レンジから取り出します。キャップを完全に締めた後、サンプルを15秒間ボルテックスします。バイアルを電子レンジに戻す前に、キャップを緩めてください。

溶液が電子レンジで3分間完全に加熱されるまで、これらを繰り返します。バイアルキャップを緩めた状態で、少量のDMFと7cmのバックナーファンネルを使用してペプチド溶液を室温まで冷却します。濾紙と250ミリリットルのフラスコ付き。

バイアルからペプチド樹脂を回収し、切断と深い保護を行います。ペプチド樹脂を新しいシンチレーションバイアルに移し、0.25ミリモルのアルギニン含有ペプチドを充填します。トリISOプロピレン3個、二酸化水素6個、チオール脱イオン水1個、TFA1個、それぞれ0.25ミリリットルを加えます。

次に、反応混合物を実験室の地震回転子で室温で4時間回転させます。終了したら、ペプチドを10 x pre chill ethyl ether に沈殿させます。4つの50ミリリットルの円錐管の間で溶液を均等に分け、4つのサンプルを3、200 Gで10分間遠心分離し、遠心分離後のペプチドを収集し、エーテルをオフにデカントして、2つの50ミリリットルの円錐管の間で分割された新鮮なエチルエーテルの100ミリリットルでペプチドを再懸濁します。

遠心分離プロセスを繰り返します。Resusは、ペプチドを50ミリリットルの新鮮なエーテルに2回懸濁し、合計4回のエーテル洗浄を行い、最後の遠心分離ステップの後、廃エーテルをデカントし、ペプチドを真空下で一晩乾燥させます。マルジ飛行時間分析用のサンプルを調製するには、1.5ミリリットルのアイノールチューブに1〜2ミリグラムのペプチドを入れ、サンプルを1ミリリットルのマルジ溶媒に溶解します。

これに続いて、マルチ溶媒中のアルファサノ4ヒドロキシセラミック酸の1ミリグラム/ミリリットルのマトリックス溶液を調製します。ペプチド溶液とマトリックス溶液を1対1の比率で組み合わせ、結合した溶液の1マイクロリットルをMALDIサンプルプレート上の3つの別々の場所にスポットします。ヒートガンを使用してスポットを乾燥させます。

次に、各サンプルを再スポットして乾燥させます。最後に、MALDIの飛行時間データを収集し、ペプチドの末端にメタアクリルアミド基を添加することで分子量が1モルあたり68g増加することを確認します。ここに示されているのは、この反応に対してマイクロ波支援法を用いて官能基化された2キロダルトンの線形PEG DMのNMRスペクトルです。

プロトンNMR分析は、末端メタクリレートプロトンと中央PEGプロトンの観測比と理論比から官能化率を計算するために使用できます。全体の官能基化率は91%であり、このPEG DMはハイドロゲル合成に使用するために適切に官能化されています。PEPペプチドのプロトンNMR分析で生じる多数のプロトンピークによる官能基化率の計算の詳細については、テキストプロトコールを参照してください。

ペプチドの機能化は、マルディ飛行時間型質量分析法を用いてより簡単に調べることができます。これは、ペプチドG-K-R-G-D-S-Gを合成し、メタアクリルアミド機能化を行ったところで、ペプチドのごく一部を機能化前分子量評価のために切断し、観察された分子量ピークが676グラム/モルで発生し、ペプチドの予想される分子量、ペプチドの残りの部分は、メタアクリルアミド機能化後の切断前にメタアクリルアミド機能化を受けたことを示しました。観察された分子量のピークは、メタアクリルアミド官能化ペプチドの予想重量である744グラム/モルで発生します。

PEG DMとメタアクリルアミド官能化ペプチドの両方の機能性を実証するために、PEGハイドロゲルを0.5ミリモルメスの有無にかかわらず製造しました。ここに示されているアクリルアミド修飾GK R-G-D-S-Gは、pegゲル単独およびmeth官能化ペプチドを含むpegゲル上のMSCの代表的な位相コントラストおよび生死蛍光画像です。MSCは、国連官能基化PEGハイドロゲルに接着できませんでしたが、細胞接着ペプチドRGDを包含すると、ハイドロゲル表面に接着して広がることができました。

生死者の画像は、播種されたMSC集団の生存率を表していません。むしろ、蛍光画像は、接着細胞とハイドロゲルトポロジーの小さな変動とを区別することを目的としていますが、これは位相コントラストだけでは困難です。興味深いことに、PEGのみのゲルに播種された非拡散細胞は、カルシウムAMとAUMホモダイマーの両方に陽性で染色され、イメージング時に細胞が死にかけていたことを示しています。

PEGハイドロゲルの多くの利点の1つは、ペグの特定の構成を変更する高度に調整可能な性質です。ハイドロゲルは、ここに示すように、研究者が弾性率などの特性を高度に制御することを可能にします。PEGの分子量と重量の割合はどちらも、ハイドロゲルのメッシュサイズ、結果として生じるヒドロゲル、剛性、およびカプセル化された薬物の放出速度を制御することが知られています。

これは、さまざまな分子量を持つハイドロゲルPEG dmを作製し、PEGの分子量を増加させるという仮説として得られるヒドロゲル弾性率とメッシュサイズを調査することによって実証されました。Macerは、ハイドロゲルメッシュサイズの増加とハイドロゲル剛性の減少を引き起こし、ハイドロゲルメッシュサイズと結果として生じるゲル剛性も、重量を変更することによって制御できます。PEGハイドロゲルの割合は、さまざまな重量で製造されました。

線形10キロダルトンのPEG DMおよびヒドロゲルの剛性および網のサイズの割合はここに示すように決定され、PEGの重量のパーセントを増加させることは網のサイズの顕著な減少およびハイドロゲルの剛さの増加を引き起こす。カプセル化されたウシ血清アルブミンを含むヒドロゲルは、ここに示すようにさまざまな分子量ペグを使用して形成されました。ウシ血清アルブミンの放出は、ハイドロゲル内のメッシュサイズが大きいため、高分子量のPEG DMを使用して形成されたハイドロゲルからより迅速に発生します。

このビデオを見れば、マイクロ波支援法を使用してPEG DMEの栄誉を合成する方法と、プロトンNMRを使用して官能基を評価する方法についてよく理解できるはずです。この手順を習得すると、ヒドロゲル分解が細胞機能にどのように影響するかについての追加の質問に答えるために、加水分解性分解性基の開環を利用することもできます。また、この手法を使用してメタアクリルアミドの官能基を末端ペプチド配列に選択的に組み込む方法や、マルチタイムオブフライト質量分析を使用してこの機能化を評価する方法についても十分に理解しておく必要があります。

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