Name: マイクロ波支援ポリの機能化（エチレングリコール）と連鎖重合で使用するためには樹脂ペプチドおよびヒドロゲル形成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-29T18:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: 学ぶマイクロ波支援によるポリエチレングリコールとペプチドのメタクリル酸化機能化法。プロトンNMRとMALDI-TOF質量分析で評価し、連鎖重合とヒドロゲル合成への応用を確認する。

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この作品は、ロチェスター大学や整形外科研究教育財団/筋骨格系移植財団（OREF /博士ダニエルブノワに提供スタートアップ資金によって、ハワード·ヒューズマックへ - グラッドフェローシップ（AVH）によって部分的に資金を供給されたMTF）。著者は彼の設備の使用のために博士ジェームズ·L·マクグラスに感謝したいと思います。

1。 PEGDMのマイクロ波支援合成<ol><li>水による汚染を防止するために、予め乾燥全てのガラス器具を1時間オーブン（&gt; 60℃）で使用されている。 注意：必要なガラス製品が含まれています：2 100ミリリットルのビーカー、250mlのビーカー、3へら、250mlのブフナーフラスコ、7 cmのブフナー漏斗、10cmの時計皿を。 </li><li>その後、ビーカーに注ぐ時計皿でビーカーをカバーし、氷で満たされた再結晶皿にビーカーを置くことによって、ステップ1.6で実行沈殿のための事前チル100〜150ミリリットルの無水ジエチルエーテル（74.12グラム/モル）。化学ヒュームフード内にマイクロ波とボルテックスを移動します。 注：ジエチルエーテル、化学冷凍庫にビーカーを置くことによって予備冷却されてもよい。冷凍庫で冷却することにより達成さ低級ジエチルエーテル温度は沈殿速度と効率を向上させるであろう。 </li><li>小さな量るボートに、molecuのポリ5グラム（エチレングリコール）（PEG）を秤量あなたの選択（1,000〜100,000 Da）でのLAR重量。 <ol><li>存在する場合には、シンチレーションバイアルの蓋からプラスチック片を取り除く。風袋バイアル、フードの式1バイアル当たり（MA、154.16グラム/モル）にメタクリル酸無水物の10モル過剰を分注する。シンチレーションバイアルにPEGを追加します。 <img alt="式（1）" fo:content-width="200px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.jpg" width="250px" /> （1） どこ<img alt="式1.1" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.1.jpg" width="30px" /> G中のPEGの質量は、 <img alt="式1.2" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.2.jpg" width="40px" /> PEGの分子量はg /モルであり、 <img alt="式1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="40px" /> PEG上の末端OH基の数であり、そして<img alt="式1.4" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.4.jpg" width="40px" /> molecuですg /モルでのMAのLAR重量。 </li></ol></li><li>ゆるくシンチレーションバイアルにキャップをねじる。最大電力で5分間マイクロ波を設定します。耐熱手袋を着用して、電子レンジで30秒毎にバイアルを取り外します。 <ol><li>完全に30秒間キャップと渦を締めます。ソリューションは、完全な5分間レンジ加熱されるまで繰り返します。キャップは割れによる手順の間に交換する必要があります。 </li></ol></li><li>キャップ付きPEGDMを室温まで冷却させ、緩め。ジクロロメタン（DCM、84.93グラム/モル）を少量（10〜15）中PEGDMを溶かす。 メモ：PEGDMが原因で余熱し、DCM（疑いのある物質）の沸騰を防ぐために、大幅に（約5分）前のDCMのほかに放冷することをお勧めします。 PEGDM、スパチュラを用いて小さなチャンクに分割し、溶解を助けるためにボルテックスされ得る。 </li><li> 20分間、10倍過剰の氷冷ジエチルエーテルにPEGDMを沈殿させる。 注意：これは、SCへの必要な場合があります低分子量のPEG（2500 DA）を沈殿させるために結晶形成を開始するためにスパチュラでビーカー側ラッチ起しますが、千ダ未満の分子量を有するPEGは、引っかき傷にもかかわらず、沈殿しない。 </li><li>ブフナー漏斗及びフラスコを用いて、真空濾過によりPEGDMを収集します。これはPEGDMに水の吸着を促進するように、乾燥を完了するためにフィルターをかけません。 注：使用中の特定の真空システムに必要な場合は、真空トラップは溶媒蒸気による損傷から真空ポンプを保護するために、濾過のセットアップと真空源との間に配置することができる。 </li><li>換気用のキャップを貫通大ゲージの針で50ミリリットルコニカルチューブにフィルターPEGDMを転送します。乾燥させるために、真空チャンバー内で一晩保管してください。 </li><li> DCMおよび再析出における再溶解PEGDM未反応のMAを除去するための最後のステップとして（ステップ1.5〜1.7のように）。ステップ1.8のように、再び乾燥させます。 </li></ol> 2。 PEGDM機能化のキャラクタリゼーション<ol><li>溶媒として重水素化クロロホルム（120.38グラム/モル）を使用して、1 H-NMRのためのサンプルを準備します。溶剤（≈1.0ミリリットル）を少量のシンチレーションバイアルにPEGDM（≈10 mg）を少量のサンプルを置きます。標的濃度は10 mg / mlである。 <ol><li>試料が溶解されると、きれいなNMR管に移す。サンプルは、NMR管の底4〜5センチメートルを埋める必要があります。 </li></ol></li><li>プロトンNMRスペクトルを収集します。我々のデータは、400MHz分光計を用いて収集される。十分なデータ分解能を得るために、少なくとも64スキャン室温でサンプルを実行する。 </li><li> NMR分析（ 図4）は PEGDM官能90％未満であることを示す場合には、メタクリル化手順が繰り返されるべきである。 MAの質量を調整することは非官能化PEGの減少量を考慮するために使用される。 </li></ol>注：ターミナルmethacrの理論比：PEGDMに官能化PEGの割合が観察さから計算することができますプロトンキシレート（a、b及びc）は、中央PEGプロトン（d）は（ 図4）である。線状PEGは、中央のPEGプロトンの理論数は、式2により算出される。 <img alt="式2" fo:content-width="150px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq2.jpg" width="200px" /> （2） どこ<img alt="式2.1" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq2.1.jpg" width="40px" /> PEGの分子量はg /モルであり、 <img alt="式2.2" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq2.2.jpg" width="70px" />単一のPEG反復（44 g /モル）の分子量である。非線形のPEGの場合、この式は、特定の分岐構造（ 図1）を反映するように変更する必要があります。パーセントの官能化は、方程式3を用いて計算することができる。 <img alt="式3" fo:content-width="150px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq3.jpg" width="300px" /> （3） どこ<img alt="式3.1" fo:content-width="30px" sRC = &quot;/ files/ftp_upload/50890/50890eq3.1.jpg&quot;幅= &quot;40pxに&quot; /&gt;は、ピークD（δ= 6.63 ppm）の下で観察した面積である<img alt="式3.2" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq3.2.jpg" width="40px" />メタクリル酸のプロトンピーク下の観察領域（δ= 1.94 ppmであり、b及びc、δ= 5.57および6.12 ppm）であり、そして<img alt="式3.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq3.3.jpg" width="40px" />メタクリル酸プロトンの理論数（= 3は* <img alt="式1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="60px" /> 、b = 1で* <img alt="式1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="60px" />そして、C = 1 * <img alt="式1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="60px" /> - 直鎖状PEGのために、それぞれ6,2および2）。 ％の官能化の計算は、a、bおよびcは別々のピークを使用して実施し、その後アベレージされるべきである全体的なパーセントの官能化を得るために、編。 注：十分に官能化PEGDM次いで（水に対して、水中で）透析し、残留無水メタクリル酸およびメタクリル酸を除去し、凍結乾燥によって回収することができる。最終生成物は、クエン酸またはビタミンCのような阻害剤の少量（0.01重量％）と混合し、使用するまで-20℃で乾燥剤と共に保存されるべきである。最終生成物はPEGDM Khetanとバーディック22によってJoveの資料に詳述されるように、ヒドロゲルを生成するために使用することができる。 3。オン樹脂ペプチドのマイクロ波支援機能化注：ここペプチドがUV監視で自動化ペプチド合成機を用いて、Fmoc-Gly-Wang樹脂を使用して合成され、N-メチルピロリドン（NMP 99.1 g /モル）中の0.2Mのアミノ酸溶液。ジメチルホルムアミド中5％ピペラジン（86.1グラム/モル）（DMF 73.1 g /モル）を0.5 M O-ベンゾトリアゾール-N、N、N &#39;、N&#39;-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ、脱保護のために使用されるDMF中uoro - ホスフェート（HBTU、379.3グラム/モル）を、活性化剤として使用し、NMP中の2Mジイソプロピルエチルアミン（DIEA、129.3グラム/モル）アクチベースとして使用される。ペプチドはまた、市販のペプチド供給業者から得ることができる。商業的供給源を使用する場合には、ペプチドは、標準的なように、無傷ではなく、完全に切断された保護基はアミノ酸側鎖とで樹脂調達することが重要である。 注：これは、反応性側鎖を有する任意のアミノ酸がそのアミド官能のみ配列のN-末端の第一級アミンで生じる保証するために保護されることが重要である。アミノ反応性側鎖基を有する酸、および一般的な保護基については、表1を参照してください。保護基を有するアミノ酸は、非保護アミノ酸と同様に、ペプチド合成の間に組み込まれた配列およびそのアミノ酸の製造業者から入手可能であることが多い。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="502"&gt; <colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;"> アミノ酸 </td><td style="width:163px;"> 反応基 </td><td style="width:196px;"> 保護基 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;">リジン</td><td style="width:163px;"> 1級アミン</td><td style="width:196px;"> tert-ブチルオキシカルボニル（Boc） </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;">セリン</td><td style="width:163px;">第一級アルコール</td><td style="width:196px;"> tert-ブチル（tBuで） </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;">スレオニン</td><td style="width:163px;">第2級アルコール</td><td style="width:196px;"> tBuの</td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;">チロシン</td><td style="width:163px;">フェノール</td><td style="width:196px;"> tBuの</td></tr></tbody></table> 表1：反応性アミノ酸は、典型的な保護基。 <ol><li>標準固相ペプチド合成を用いてペプチドを合成し、使用するまでDMF中で、4℃で樹脂上に格納する。 </li><li>濾紙および250mlのフラスコと7cmのブフナー漏斗を用いて濾過を介してDMFからペプチド樹脂を収集する。 </li><li>現在は、シンチレーションバイアルの蓋からプラスチックのピースを削除した場合。シンチレーションバイアルに樹脂を転送します。使い捨てピペットを用いて、シンチレーションバイアル中の樹脂をカバーするだけの十分なMAを追加します。 </li><li>ゆるくシンチレーションバイアルにキャップを配置します。最大電力での3分の電子レンジを設定します。耐熱手袋を着用して、電子レンジからのすべての15から20秒のバイアルを取り外します。 <ol><li>完全に15秒間キャップと渦を締めます。ソリューションはFUマイクロ波処理されるまで繰り返しLL 3分。 </li></ol></li><li>キャップが緩んで、室温にペプチド溶液を冷ます。少量のDMFと濾紙とフラスコとのブフナー漏斗を使用して、バイアルからペプチド樹脂を集める。 </li><li>新鮮なシンチレーションバイアルにペプチド樹脂を転送し、ペプチドを切断し、脱保護。 <ol><li>樹脂の0.25ミリモルあたり、我々は、0.5ミリリットルイソプロピルシランのそれぞれ（TIPS、158.36グラム/モル）18.5ミリリットルのトリフルオロ酢酸（TFA、114.02グラム/モル）の切断カクテルを使用して、回転させながら2時間の室温での反応を利用3,6 - ジオキサ-1,8 - オクタンジチオール（DODT、182.30グラム/モル）および脱イオン水（18.02グラム/モル）。 注：このカクテルは、ほとんどのペプチドのために十分であるが、2,2,4,6,7 - ペンタメチル - ジヒドロベンゾフラン-5 - スルホニル（一般にアルギニン側鎖を保護するために使用される）（にPbf）保護アミノ酸を脱保護しないであろう。シーケンスにPbfを保護されたグループが含まれている場合は、TFAを0.5ミリリットルを0.5ミリリットルチオアニソール（124に置き換える必要があります。は20g /モル）および切断時間は4時間に増加した。 注：切断カクテル中曇り、結晶性物質が形成した場合、ペプチドは、おそらく、溶液からクラッシュされ、切断カクテルの量を2倍にする必要があります。 </li></ol></li><li>時計皿で覆ったビーカーに氷の上で400ミリリットルの無水ジエチルエーテルを冷やす。 </li><li> 10倍過剰のジエチルエーテルにペプチドを沈殿させ、四の50mlコニカルチューブの中に均一に溶液を分割する。ペプチドを収集するための10分間3200×gで遠心します。 <ol><li>エーテルをデカントし、新鮮なジエチルエーテル二50メートルの円錐管に分け100mlにペプチドを再懸濁する。 4エーテル洗浄、計二回の新鮮なエーテル50mlに再懸濁、遠心分離プロセスを繰り返します。 注：これは、切断カクテルに使用される化学物質を除去し、固体のペプチドから保護基を切断した。 </li></ol></li><li>最後の遠心分離工程の後、廃棄物等をデカント彼女の、真空下で一晩ペプチドを乾燥させます。 </li></ol> 4。ペプチド機能化のキャラクタリゼーション<ol><li>ペプチドサンプルのMALDI-ToF型分析のための溶媒としてアセトニトリル（41.05グラム/モル）+ 0.1％TFA：50:50 H 2 Oを使用する。少量のサンプル置き - 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブ中のペプチドの（1,2 mg）をMALDIおよび溶媒1mlの試料を溶解する。 </li><li>マトリックス溶液を調製する。一般的に用いられるマトリックスは、マトリックスとしてα-シアノ-4 - ヒドロキシ桂皮酸（CHCA、189.2グラム/モル）である。ストック基質溶液を形成し、MALDI溶媒中の10 mg / mlのマトリックスを溶解する。 注意：マトリックスストック溶液は、追加の分析のために最大1週間室温で保存することができる。 </li><li> 1:1の比率で、ペプチドとマトリックス溶液を兼ね備えています。 1μL/スポットを追加し、MALDIサンプルプレート上の3つの別々の場所に、この統合ソリューションを見つける。 <ol><li>空気乾燥により、またはヒートガンを使用するか、スポットを乾燥する。 Respotとドライそれぞれサンプル。 注意：Respotting、より均一なペプチド/マトリックス試料を生成し、明確な信号を得るのに役立つ。標準的なペプチド混合物は、また1:1の比でマトリックス溶液と組み合わせることとMALDIプレート上に（一度だけ）スポッティングする必要があります。 </li></ol></li><li> MALDI-TOFデータを収集。によりペプチドのN末端にメタクリル基の付加に、ペプチド単独分子のそれ以上の分子量が68グラム/モルの増加があるはずです。 注：PEGDM合成とは異なり、反応性側鎖を有するアミノ酸上の保護基が除去されるように、切断時のペプチドは、refunctionalizedすることができず、N-末端の選択的官能化はもはや保証することができない。 <ol><li> MALDI分析（ 図5）は 、ペプチドが正しく官能化されたことを示し、全ての保護基が適切に切断された場合、ペプチドは、（水に対して、水中で）透析し、リムーバブル凍結乾燥によって回収することができるE残留汚染物（切断カクテル、エーテルなどの保護基切断される）。固体ペプチドは、小エッペンドルフチュー​​ブに移し、-20℃で使用するまで保存すべきである。 </li></ol></li></ol>

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<li>Hoffman, M. D., Benoit, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonism+of+Wnt-beta-catenin+signalling+promotes+mesenchymal+stem+cell+%28MSC%29+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue.+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Agonism of Wnt-beta-catenin signalling promotes mesenchymal stem cell (MSC) expansion.</a> J. Tissue. Eng. Regen. Med. , (2013).</li>
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<li>Methacrylic Anhydride [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=AAAL14357-18">https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=AAAL14357-18</a> (2013).</li>
<li>Acrylic Anhydride [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.polysciences.com/Catalog/Department/Product/98/productid--40/">http://www.polysciences.com/Catalog/Department/Product/98/productid--40/</a> (2013).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ポリ（エチレングリコール）（PEG）ヒドロゲルは、再生医療および薬物送達用途1-3で使用される一般的な生体材料である。これらのヒドロゲルは、他の生体材料上の重要な利点を提供します。 PEGヒドロゲルは、例えば、それらの天然の生体材料の対応物1と比較して弾性及び分解速度の係数として工学的特性に対する高度な制御を提供し、合成である。これらは合成的に誘導されるように、PEGは、天然由来の材料4に対して有意に少ないバッチ間のばらつきがあります。 PEGの化学的組成のために、これらのヒドロゲルは、高度に親水性のタンパク質吸着に耐性であり、3生体適合性である。タンパク質吸着に対するこの抵抗は、これらの事実上の特定の生物学的または化学的因子（薬物、生体分子、細胞接着ペプチド等 ）、特定の役割を問い合わせし、研究するための研究を可能にする、PEGヒドロゲルは、「白紙状態」として作用することを可能にするrsは、細胞および/または組織の挙動を制御する役割を果たす。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig1.jpg" width="600px" /> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 図1：。ポリ（エチレングリコール）（PEG）アーキテクチャとヘキサグリセロールコアD）8アームPEGペンタエリスリトールコアC）8アームPEGとA）リニアPEG B）4 -アームPEG の例トリペンタエリスリトールコア。 nはPEGの数は各アームに繰り返す。各繰り返しは、したがって、44 g /モルの分子量を有し、nは全体の分子量および構造/腕位から計算することができる。 PEG前駆体は、アーキテクチャや、種々の分子量（ 図1で利用できます<html> ）。アーキテクチャ（アーム＃）を変化させ、PEGのエチレングリコール反復（n）は、これらのマクロマーから形成されたハイドロゲルネットワークの特性を制御するために使用することができる。未修飾PEGはハイドロゲルネットワークの形成に先立って重合を介して共有結合性の架橋を促進するための別の機能に置き換えられる必要があり、末端ヒドロキシル基、PEGヒドロゲルのために最も一般的に用いられる架橋戦略を含有する。重合および架橋ネットワーク（アクリレート、メタクリレート、ビニルエーテル、ノルボルネンなど ） を容易にするためにPEGマクロマーに組み込むことができる化学基には様々なものがある。ステップ·アンド連鎖成長（または2、混合モードの混合物）：架橋を促進するために利用できるターミナル様々な機能にもかかわらず、重合が起こることのできる唯一の​​2つのメカニズムがあります。 g2.jpg &quot;幅=&quot; 600PX &quot;/&gt; <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 図2：地域やループ、未反応の前駆体、および恒久的なもつれなどの増加のネットワーク非理想架橋密度の高いポリ（メタクリル酸）を含む異種ネットワークにおける理論ハイドロゲルネットワークの回路図A）従来の連鎖成長重合の結果b）工程成長重合結果かなり多くの均質なネットワーク構造（原寸大ではありません）。 連鎖成長重合により架橋する機能が追加架橋剤の存在を必要としない。しかしながら、鎖重合ヒドロゲルは、緻密な架橋領域（ 図2A）1 を含む異種ネットワーク構造を作り出す。一方、ステップ成長重合requiPEGマクロマーの末端官能基と反応性の架橋剤または共単量体の使用解像度。 PEG上の末端官能基のみと反応し得る架橋剤と架橋剤のみPEG上の末端官能基と反応することができるように、これは、より大きなネットワーク構造の均一性（ 図2B）をもたらす1。ステップ成長重合はまた、典型的には、可溶性、取り込まれなかったマクロマー1による免疫/炎症応答のための未反応の前駆体および電位の量を減らす、官能基の高い変換をもたらす。混合モードの重合方法はまた、（連鎖成長）、自己反応し、架橋剤（段階成長）の両方と反応することができるマクロマーの使用を介して両方のステップと連鎖成長重合を組み合わせることが開発されている。これは、各重合機構の特性にヒドロゲルを生成し、いずれかよりもより複雑な、多様なネットワーク構造を生成するために使用することができるステップ·単独連鎖成長ネットワーク1。 PEGの官能化およびハイドロゲル形成を促進するために使用することができる官能基の過多があるが、メタクリレート及びノルボルネンは、それぞれ、最も一般的な鎖と、ステップ成長重合部分の一部である。これらの機能はいずれも、ネットワークの重合に対して優れた時空間制御を提供し、細胞をカプセル化するために使用する場合、これらのネットワークは全体的に高い細胞生存5-7をサポートしています。連鎖重合によって官能化されたPEG（PEGDM）架橋をメタクリレートとアクリレート、メタクリレート、または同様に官能化生体分子5,6との共同重合して生体分子またはその他の要因の取り込みが可能になります。 PEGDMヒドロゲルは、アクリレート官能化PEG（PEGDA）のような代替の鎖成長重合システムに勝る大きな利点を有する。従来の方法を用いて、PEGDAはPEGDMよりも迅速に合成することができる。ホweverは、マイクロ波支援合成を用いて、PEGDM合成がより一層効率的である。 PEGDAは、しばしば、一晩8または24時間9反応で合成されるが、高温で4時間10で合成することができる。 PEGDMはまた、伝統的に4日〜12反応時間を延長するいくつかの方法で、一晩、11又は24時間5で反応させることによって合成される。ここで示すマイクロ波アシスト法を用いて、PEGDM 5分間反応で製造することができる。 PEGDMがPEGDA 13よりも遅い反応速度を有するが、PEGDMの架橋反応は数分で起こる、依然として迅速であり、およびメタクリレート基の疎水性の増加は、溶液中の官能基凝集を増加させるようにPEGDAを超えるマクロマー転化率を達成することにより、確率を増加させるラジカル移動およびメタクリレート換算14。 PEGDMハイドロゲルも、増加した細胞生存率および成長などに関連しているラジカル濃度および14に存在する未反応マクロマーを低減により、任意の時点で、反応速度の低下する可能性が高いPEGDAヒドロゲル、、と比較。このような段階成長重合によりノルボルネン官能化PEG（PEGN）フォームヒドロゲルを使用しているようなチオール - エン重合、およびPEGNの使用およびより大きい2の官能基の平均が含まれている架橋剤を必要とする。チイルラジカルノルボルネン炭素-炭素二重結合、マルチチオール含有架橋剤と反応するので、一般的にシステインアミノ酸官能7を有するペプチドの容易な組み込みを可能にする、PEGNヒドロゲルを架橋するために使用される。ステップ成長重合を経由して反応し、他の多くの化学的性質がありますが（例えば、チオール-アクリレート15とチオールビニルスルホン16として、マイケル付加反応は、このようなアルキン-アジド17 等の反応を「クリック」）、チオール-ノルボルネンヒドロゲルはあるからの株として、非常に一般的なノルボルネン環が著しく反応速度を増加させ、連鎖重合を受ける7ノルボルネンの二重結合の機会を減少させる。 ヒドロゲルの形成を容易にするメタクリレート、ノルボルネン、または代替官能間の決定は、主としてアプローチに基づいている。例えば、連鎖成長重合したPEGDMネットワークも同様に実証組織工学骨膜18,19の開発に細胞局在を制御するために適してきた。ステップ成長重合したPEGネットワークは、チオール（システイン）含有ペプチドを用いた酵素基質配列の組み込みを容易にするために、酵素的に応答性ヒドロゲルの分解を容易にするペプチド配列の組み込みに適しており、官能化マクロマー20ノルボルネン 。研究課題は、最高の段階成長ハイドロゲルを使用することによって対処される場合は、フェアバンクスら norborの詳細な説明を提供していますPEG 7のためのネネ機能化戦略。 PEGおよびペプチド配列は、連鎖重合反応のために（PEGためのメタクリル酸、およびペプチドのためのメタクリルで）機能化することができるか、この紙の意志のディテール。 伝統的に、PEGDMジクロロメタン中メタクリロイルクロライドおよびトリエチルアミンとPEGとを反応させることにより製造される。反応物を濾過し、ジエチルエーテルで沈殿し、収集の前に4日〜12反応時間を延長するいくつかの方法を用いて、室温で一晩で11または24時間、5進行させている。このアプローチの多くの変形が存在するが、全ては、時間がかかる化学合成装置の大きなアレイを必要とし、それらは、高純度の試薬及び溶媒の比較的大量の使用を伴うような、環境に優しいものではない。これらの制限を回避するために、リン-ギブソンらテにPEGを官能化するためのマイクロ波支援、溶媒を含まない方法を開発<html> rminalメタクリレート基（ 図3A）12。この反応において、PEGの末端アルコール基がカルボキシルを形成するために、メタクリル酸無水物のカルボニル原子の一つと反応する。これは、副生成物としてのメタクリル酸と、PEGDM生成物を生成する。この合成は、反応時間の短縮及び無溶媒合成法21を含むマイクロ波合成の特性の利点の多くを有する。マイクロ波合成は、それが大幅に高速であるように、前に説明した方法よりも好ましい少ない大規模な合成装置（ 例えばガラス製品、反応プレート）を必要とし、溶媒をのみ生成物の精製/収集としないために必要とされるように少なく、全体的な試薬、溶媒量を使用しています合成、それがより経済的で環境に優しい作り。 いただき &quot;/&gt; <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 図3：官能回路図A）ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレングリコール）メタクリレートBを生成するために10倍モル過剰のメタクリル酸無水物と反応させて）、この同じ方法は、成形、ペプチド配列のN末端 ​​を官能化するために使用することができる官能化されたペプチドをメタクリルアミド。従来、樹脂からペプチドを切断し、この手順を行うことにより、N-末端の選択的官能化は、アミノ酸側基が保護されたままであるように行うことができる。 nはPEGの数はマクロマーで繰り返す（2用のn = 45.5、227および455は、それぞれ、10および20kDaの線状PEGを用いる）。 RNへR1：アミノ酸側鎖。 PGNにPG1：側鎖保護基。 TFA：トリフルオロ酢酸。 TIPS：トリイソプロピルシラン。 DODT：3,6 - ジオキサ-1,8 - octanedithiol。 H 2 O：水。 マイクロ波アシストメタクリル化法は、最近のポリマーおよびポリマーネットワーク内に種々のペプチドの取り込みを促進するためにメタクリル基（ 図3B）を有するペプチドのN-末端を官能化する我々のグループによって適合されている。この反応において、ペプチドのN-末端の第一級アミンは、アミドを形成するメタクリル酸無水物上のカルボニル原子と反応する。これは、副生成物として生成したメタクリル酸と、メタクリル官能化ペプチドを生成する。ペプチド配列のN末端を官能化するためにこの手順を使用する場合は、反応性側鎖（第一級アミン（リジン）、アルコール（セリン、スレオニン）、フェノール類（チロシン））を含有するアミノ酸は、官能化中に保護されることが重要である、と保護基のみメタクリル取り込み後に切断されています。 この記事では、これらのマイクロWの両方を紹介します一般的な落とし穴を強調表示して、トラブルシューティングの方法を示唆し、PEGDMを合成し、樹脂上のペプチド配列を官能化するAVE支援方法。この記事では、製品の官能性を評価するために一般的に用いられる分析的化学技術を実行するための方法について詳細に説明する、より高度な修飾を行うための提案とリソース説明する。典型的な結果は、ハイドロゲルネットワークを形成するために合成PEGDMを使用してモデル薬物の放出を制御するために形成されたヒドロゲルを利用して、細胞 - ヒドロゲルの相互作用を容易にするために官能化されたペプチドを使用することを含み、これ実証される。特別な注意がヒドロゲルのメッシュサイズを特徴づける、ひいてはそのような剛性および薬物放出プロファイルのようなバルク材料特性を制御するこの基礎となる物理的特性に影響を与えるように調整することができる方法をヒドロゲル組成質問に支払われる。

<table><tbody><tr><td>3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジオール</td><td>東京化学工業株式会社</td><td>D2649</td><td>CAS 14970-87-7</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>J.T.ベーカー</td><td>UN1648</td><td>CAS 75-05-8</td></tr><tr><td>アミノ酸</td><td>AAPPTech</td><td>グリシン:AFG101</td><td>CAS 29022-11-5</td></tr><tr><td> </td><td></td><td>アルゼンチン:AFR105</td><td>CAS 154445-77-9</td></tr><tr><td> </td><td></td><td>アスパラギン:AFD105</td><td>CAS 71989-14-5</td></tr><tr><td> </td><td></td><td>セリン:AFS105</td><td>CAS 71989-33-8</td></tr>無<tr><td>水ジエチルエーテル</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>UN1155</td><td>CAS 60-29-7</td></tr>ク<tr><td>エン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>C1857</td><td>CAS 77-92-9</td></tr>重<tr><td>水素化クロロホルム</td><td>ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ株式会社</td><td>DLM-7-100</td><td>CAS 865-49-6</td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>UN1593</td><td>CAS 75-09-2</td></tr><tr><td>ジイソプロピルエチルアミン</td><td>アルファ エーザー</td><td>A1181</td><td>CAS 7087-68-5</td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>D119-4</td><td>CAS 68-12-2</td></tr><tr><td>Fmoc-Gly-Wang 樹脂</td><td>ペプチド 国際</td><td>RGF-1301-PI</td><td>100-200 メッシュ サイズ</td></tr><tr><td>メタクリル無水物</td><td>Alfa Aesar</td><td>L14357</td><td>CAS 760-93-0</td></tr><tr><td>N-メチルピロリドン</td><td>VWR</td><td>BDH1141-4LG</td><td>CAS 872-80-4</td></tr><tr><td>オンレジンペプチド</td><td>社内</td><td></td>で合成された<td>オンレジンペプチドは、ペプチドインターナショナル、ジェンスクリプト、AAPPTec、etc.</td></tr><tr><td>O-ベンゾトリアゾール-N、N、N'、N'、N'-テトラメチル-ウロニウム-ヘキサフルオロリン酸</td><td>からも購入できます。AnaSpec Inc</td><td>510/791-9560</td><td>CAS 94790-37-1</td></tr><tr><td>ペプチド校正 標準</td><td>ケア</td><td>206195</td><td></td></tr><tr><td>ピペラジン</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15019</td><td>CAS 11-85-0</td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコール) 2 kDa リニア</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22181</td><td>CAS 25322-68-3</td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコール) 10 kDa リニア</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21955</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコール) 20kDaの線形</td><td>シグマAldrich</td><td>81300</td><td>JenKemの技術米国は線形およびmultiarm PEG</td></tr><tr><td>のチオアニソール</td>の代わりとなる製造者です <td>Alfa Aesar</td><td>L5464</td><td>CAS 100-68-5</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic酸</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12198</td><td>CAS 76-05-1</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Alfa Aesar</td><td>L09585</td><td>CAS 6485-79-6</td></tr><tr><td>&alpha;-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸</td><td>東京化学工業株式会社</td><td>C1768</td><td>CAS 28166-41-8</td></tr></tbody></table>

マイクロ波支援ポリの機能化（エチレングリコール）と連鎖重合で使用するためには樹脂ペプチドおよびヒドロゲル形成

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

ヒドロゲル形成にポリ（エチレングリコール）（PEG）マクロマーを使用する主な利点の1つは、合成汎用性である。 PEGの分子量及び構成の多種多様から描く能力（アーム数が、長アームと、分枝パターン）がヒドロゲル構造とヤング率とメッシュサイズを含む特性を得られる上に研究者が厳密な制御を与える。このビデオは、ポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート（PEGDM）中にPEG前駆メタクリレートための迅速、効率的、無溶媒の、マイクロ波支援方法を示すであろう。この合成法は、薬物送達や再生医療への応用のための非常に必要な出発材料を提供しています。それが試薬および溶媒より少量を使用して、大幅に高速で簡単なだけでなく、より経済的かつ環境にやさしいことが実証メタクリル化方法は、従来法よりも優れている。また、樹脂上methacrためこの技術の適応を紹介しますペプチドのイルアミド機能化。この樹脂上の方法は、ペプチドのN末端が前の樹脂からの脱保護および開裂メタクリルアミド基で官能化することができる。反応性側基（リジンの例えば第一級アミン、セリンの第一級アルコール、スレオニンの第二級アルコール、およびチロシンのフェノール）を有するアミノ酸が官能化を防止し、保護されたままで、これは、ペプチドのN末端 ​​にメタクリル基の選択的付加を可能にする複数のサイトで。この資料を詳述一般的な分析方法、官能化の効率を評価するために（プロトン核磁気共鳴分光法（H-NMR）およびマトリックスは飛行型質量分析レーザー脱離イオン化時間（MALDI-TOF）をアシスト）。一般的な落とし穴やトラブルシューティング方法を提案し、さらに調整するマクロ機能に使用することができる技術および得られたヒドロゲルの意志の変更として、解決される予定の物理的および化学プロパティ。薬物送達のためのヒドロゲルの形成のために合成された製品の使用および細胞 - 材料相互作用の研究は、ヒドロゲル剛性と薬物放出を制御する、メッシュのサイズに影響を与えるために、ヒドロゲル組成物を修飾に着目特に注意して、実証される。

各スペクトルのピークの下の面積は、製品及び反応物の比率の決定を可能にする、試料中のプロトンの相対的なレベルに比例するように、プロトン核磁気共鳴は、化学反応の効率を評価するための最も一般的な分析技術の一つであるサンプル中に。末端メタクリレートプロトンの理論比（a、b及びc）（d）の中央のPEGプロトンた：この反応のために、1 H-NMR分析（ 図4）から観察％の官能化を計算するために使用することができる。 図4に示すPEGDMは、従来官能2,000 Daであったのではn = 2,000 Daの/（44ダ/ PEGリピート）= 45.5、これはd = 4 *（n-1）個= 178、プロトンを製造する：NMRユニット比178 / 102.16 = 1.74。試料中の水の存在は人為的にピーク下の面積を増加させるように、この場合、％の官能評価に使用することができないピーク。ピークbを用い、％の官能化は1.00 * 1.74 / 2 * 100％= 87.1％であり;ボイジャーグラムピークcは、％の官能化は94.1％= 1.08 * 1.74 / 2 * 100％である。したがって、全体の％の官能化は91％であり、これは十分にPEGDMハイドロゲル合成における使用のために官能化される。一般的には、約90％の官能化はメタクリル化の単一のラウンド後に達成される。 によるペプチドの1 H-NMR分析で発生するプロトンピークの多数のために、ペプチドの官能化はより容易にMALDI-ToF型質量分析法を用いて調べた。これは、ペプチドを合成しGKRGDSG官能化メタクリルアミドに供した図5に示されている。ペプチドの小部分は、ペプチド配列の正確な合成を示す、ペプチドの予想される分子量676 g /モルで発生する観察された分子量のピークを示したprefunctionalization分子量の評価（ 図5A）、のために切断した。ペプチドの残りの部分は、メタクリル機能受け前切断にブリダイゼーション。このペプチドはPbfでは、Rの保護アミノ酸を含んでいるので、切断は、4時間チオアニソールを含有するカクテルで行った。メタクリルアミド官能化した後、観察された分子量ピーク744 g /モル（ 図5B）で起こる、メタクリル官能化ペプチド（676 68グラム/モル）との予想される量は、官能化されていないペプチドの予想分子量で、正しい示していない機能化。 PEGおよびメタクリル官能化ペプチドの両方の機能性を実証するために、PEGDMハイドロゲルはmmとし、0.5なしで生産されたGKRGDSG（ 図6）官能基化メタクリル。ヒドロゲルは光開始剤として0.05​​重量％のリチウムフェニル-2,4,6 - trimethylbenzoylphosphinate（LAP）と、PBS中の10重量％の直鎖10kDaのPEGDMで製造した。ヒドロゲル前駆体溶液をスライドガラススペーサーによって分離され、バインダークリップで一緒に保持2枚のスライドガラスの間に注入した。前駆体溶液は、その後、8mm直径ゲルを円筒形のパンチを用いて収集した後、架橋を誘導するために10分間、2ミリワット/ cmで365nmのUV光に露光した。ゲルをPBSでリンスし、平衡膨潤条件が達成された16,20を確実にするために2日間膨潤させた。ヒトMSC（継代3）を80％コンフルエントまで増殖させ、15,000細胞/ cm 2でのヒドロゲルに播種した。細胞は、使用して10倍の倍率で0.5μL/ mlのカルセインAMおよび2μL/ mlのエチホモ二量体（Invitrogen社からの生/死生存率キット）を含む新鮮な培地に移して、位相コントラストおよび蛍光の下で画像化される前に48時間付着させたニコンエクリプスTiの2000。 MSCは、官能化されていないのPEGヒドロゲル（ 図6A）に付着することができませんでしたが、細胞接着ペプチドRGDを含める際に、彼らはに付着し、ハイドロゲルの表面（ 図6B）上に展開することができました。生/死のイメージMSCは、死亡時のゲル表面から剥離し、播種し、細胞生存率の人工的な膨張を生じ、メディア転送プロセスの間に除去される接着依存性細胞であるように、播種されたMSC集団の生存度を表すものではない提示。むしろ、蛍光画像を単独で位相コントラスト下では困難であることができるヒドロゲルトポロジで接着細胞との間の小さな変動画定することを意図している。興味深いことに、nonspread細胞は、細胞が撮影時に死んでされたことを示す、カルセインAMおよびエチジウムホモ両方に陽性に染色PEG専用ゲル上に播種。 PEGヒドロゲルの多くの利点の1つは、高度に調整可能な性質である。 PEGヒドロゲルの具体的な構成を変更すると、研究者にこのような弾性率などの特性を高度に制御を与える。 図7に示すように、PEG分子量（ 図7A）および重量百分率（両<stron得&gt;図7B）は、ヒドロゲルのメッシュサイズ（ξ）と、得られたヒドロゲルの剛性を制御し、カプセル化された薬物の放出速度が知られている。これは、様々な分子量のPEGDMでヒドロゲルを製造し、得られたヒドロゲルの弾性率およびメッシュサイズ（ 図8）を調べることにより実証された。すべてのヒドロゲルは光開始剤として0.05​​重量％のLAPで、PBS中の10重量％の直鎖PEGDMで製造した。ヒドロゲル前駆体溶液40μlを、円筒状の幾何学的形状、直径約5mm、高さ2mmの製造、ヒドロゲルを形成するためのヒント遮断し、10分間、2ミリワット/ cm 2で少なくとも365nmのUV光に暴露で1mlシリンジにあっ。ゲルは、機械的試験の前に2日間、PBS中で膨潤させた。ヒドロゲルの弾性率は、0.1 [mm] /秒の速度で初期のヒドロゲルの高さの5〜10％を圧縮しながら5 Nロードセルを備えMTS QT / 5を用いて決定した。機械的試験が完了した後、メッシュサイズは、ヒドロゲルMASを測定することによって決定したS前（M S）と後（M D）MATLABで実行される計算で、議論のセクションで説明するようフローリー·Rehner方程式を経由して、凍結乾燥の24時間。仮説として、ヒドロゲルのメッシュサイズの増大（ 図8A）およびヒドロゲル剛性の低下（ 図8B）を起しPEGマクロマーの分子量を増加させる。ヒドロゲルのメッシュサイズおよび得られたゲルの剛性はまた、重量百分率PEGを変えることによって制御することができる。ヒドロゲルは、直鎖状の10kDaのPEGDM重量％、ヒドロゲル剛性とメッシュの大きさを、以前に記載（ 図9）のように決定された変化させて作製した。 図7Bに示されたように、増加する重量％PEGはメッシュサイズの有意な減少（ 図9A）を引き起こし、ハイドロゲル剛性（ 図9B）の増加。 カプセル化されたウシ血清アルブミン（BSA）を含有するヒドロゲルを変えるmoleculaを用いて形成したrは、重量PEG（2,10、および20）を有する。 図6について記載したように、すべてのヒドロゲルは、50μg/ mlのBSAを含有するPBS中の10重量％PEGDMで製造した。ゲルを37℃で1 mlのPBS中でインキュベートし、各時点で新鮮なPBSに移した。リリースBSAは、サーモサイエンティフィックのブラッドフォードアッセイを用いて定量化した。ヒドロゲルのメッシュサイズは、 図8について記載したように決定した。 図7（a）に示すように、BSA放出はヒドロゲル内の大きなメッシュサイズ（ 図10）の結果として、より高い分子量のPEGDMを用いて形成されたヒドロゲルからより急速に起こる。 <img alt="図4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig4.jpg" width="500px" /> 図4。 2 kDaの線形PEGDMの代表的な1 H-NMRは、マイクロ波支援の方法を使用して官能基化。パーセント機能化は、CA可能観察に基づくlculated：中央のPEG陽子（d）の末端メタクリレートプロトン（a、b及びc）の理論比<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig4highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig5.jpg" width="500px" /> 図5。マイクロ波アシスト法を用いて代表的なペプチドGKRGDSG（A）のMALDI-ToF型の前および（B）官能化後 、官能化後の観察された分子量ピーク744 g /モルで起こることメタクリル官能化ペプチドの予想される量を注（676 68グラム/ mol）としない非官能ペプチド（676グラム/モル）の予想される分子量で。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig5highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 図6。代表位相コントラスト（左）と（緑/赤）DEAD /一人暮らしとB、A）、PEGゲル上で培養MSCの蛍光像（右））0.5ミリ含有するPEGゲルは官能化GKRGDSGをメタクリルアミド。MSCはに付着することができないと上に広げ、一人でPEGDAジェルが、細胞接着ペプチドRGDの取り込みの際に付着し、ハイドロゲルの表面上に広げすることができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig6highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig7.jpg" width="500px" /> 図7。 A）PEGは、ヒドロゲルのネットワークを形成するために使用されるPEGの分子量及びB）の重量百分率は、ヒドロゲルのメッシュサイズに影響を与える（_8 ;)得られたヒドロゲル剛性と封入された薬物の放出速度。A）、一定の重量百分率が増加するヒドロゲルのメッシュサイズで左から右にPEG分子量（）の増加ヒドロゲルの剛性を減少させ、薬物放出速度を増加させる。B）の重量を減らす（左から右）PEGの割合はハイドロゲルを形成するために使用され、同様に（正確な縮尺ではない）ハイドロゲルの剛性を減少させ、薬物放出の速度を高め、ハイドロゲルのメッシュサイズが大きくなります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig7highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig8.jpg" width="500px" /> 図8。 A）メッシュの大きさが増加し、B）ヒドロゲル剛性がPEGマクロマーの分子量の増加とともに減少する。はn = 10、エラーバー= SEM、*** P＆＃60;、一方向ANOVAによって0.001 TukeyのHSD事後テストで。すべての統計分析は、プリズム5を用いて行った。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig8highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig9.jpg" width="500px" /> 図9。 A）増大重量％のPEGを含む）ヒドロゲルの剛性が増加するサイズは減少し、Bメッシュあり、n = 9-10、エラーバー= SEM、**はp &lt;0.01、***はp &lt;0.001テューキーのHSDを有する、一方向ANOVAによる後処理ホックテスト。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig9highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図10" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig10.jpg" width="500px" /> 図10。 encaのリリース2 kDaの、10kDaの、20kDaの分子量のPEGを用いて形成されたヒドロゲルからpsulatedモデル薬物ウシ血清アルブミン（BSA）BSAの放出は、ヒドロゲル内の大きなメッシュサイズの結果として、より高い分子量PEGDMを用いて形成されたヒドロゲルからより迅速に起こる。 N = 6、エラーバー= SEM。 2および10 kDaのゲルからの放出は、双方向反復対策ボンフェローニでANOVAにより、同等であるときに放出％のBSAは、T = 1および2.5時間を除く全ての時点で全ての3つの群の間に（p &lt;0.0001）有意に異なる事後テスト。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig10highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

このビデオは、連鎖重合ヒドロゲル合成を可能にする、ポリ（エチレングリコール）メタクリレートするための迅速、効率的な方法を説明します。それは同様に、機能化効率を評価、トラブルシューティングや高度な修正のための提案を提供し、典型的なハイドロゲルの特性評価技術を実証するために、ペプチド、詳細一般的な分析方法にメタクリルの機能を導入する方法を紹介します。

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

この手順の全体的な目標は、ポリエチレングリコールとペプチドをメタアクリレート基で官能基化し、その後の連鎖重合とヒドロゲル合成を行うことです。これは、まず無水メタアクリルと国連官能基化前駆体をシンチレーションバイアルで組み合わせることによって達成されます。2番目のステップは、マイクロ波エネルギーを使用してペグまたはペプチドを官能基化することです。次に、PEG DMをクロロメタンに溶解するか、ペプチドを樹脂から切断します。また、すべての側鎖保護基は、酸ベースのカクテルで除去されます。最後のステップは、エーテル中のPEG DMまたはメタアクリルアミド官能化ペプチドを沈殿させることです。最終的には、プロトンNMRまたはマルディ飛行時間型質量分析を使用して、PEGまたはペプチドマクロの機能化が成功したことを示します。こんにちは、私の名前はエイミー・ヴァン・ホーブです。私はロチェスター大学の医用生体工学科の博士課程の学生です。この手法は、PEGをメタアクリルフッ化物と反応させるなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、反応が大幅に速く、より環境に優しいことです。こんにちは、私の名前はブランドン・ウィルソンです。私はロチェスター大学の化学工学の学部生です。この方法は、PEGジメチルを使用してハイドロゲルがどのように生成し、分子内の治療細胞の送達を制御できるかなど、生体材料分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。こんにちは、私はロチェスター大学の医用生体工学科の助教授であるダニエル・ブノワです。この技術の意味は、合成された化合物を細胞および薬物送達アプリケーションに使用できるため、さまざまな疾患の治療法を開発するためのものです。この手順を開始する前に、大きなホエイボートの水による汚染を防ぐために、必要なガラス器具をオーブンで1時間乾燥させました。1000 から 100, 000 ダルトンの間の分子量のペグの 5 グラムをウェイアウトします。プラスチック片がある場合は、ケミカルフード内のシンチレーションバイアルの蓋からプラスチック片を取り出します。10モルの過剰な無水メタアクリルを破れたシンチレーションバイアルに分注します。.次に、バイアルにPEGを追加します。次に、キャップをバイアルにゆるくねじり、バイアルを電子レンジに入れます。耐熱手袋を着用して、電子レンジを最大出力で5分に設定します。バイアルを電子レンジから30秒ごとに取り出します。次に、キャップを完全に締め、サンプルを30秒間ボルテックスします。バイアルを電子レンジに戻す前に、キャップを緩めてください。溶液が電子レンジで5分間加熱されるまで、これらの手順を繰り返します。バイアルを電子レンジから取り出した後、キャップを緩め、PEG DMを室温まで冷まします。次に、PEG DMを10〜15ミリリットルのジクロロメタンに溶解します。PEG DMを10倍を超えるプレダチルエーテルに20分間沈殿させます。7センチのバックナーファンネルと500ミリリットルのフラスコを使用。真空ろ過によりPEG DMを回収します。次に、ろ過したPEG DMを50ミリリットルの円錐管に移し、キャップに大型ゲージの針を通して換気します。チューブを真空チャンバーに入れ、PEG DMを一晩乾燥させます。真空チャンバーからチューブを取り外した後、赤はPEG DMを氷冷ダチルエーテルでDIクロロメタン沈殿物に溶解します。ろ過および回収後に非反応性無水メタアクリルを除去するには、以前と同じ方法でPEG DMを真空チャンバーで乾燥させます。プロトンNMR分析では、シンチレーションバイアルに約10ミリグラムのPEG DMを入れ、約1ミリリットルの重水素化クロロホルムを添加します。サンプルが溶解したら、きれいなNMRチューブに移します。次に、プロトンNMRスペクトルを収集し、サンプルを室温で少なくとも64回のスキャンで分析して、十分なデータ分解能を取得します。目的のペプチドを固相合成で合成した後、DMF中のレジン上に4°Cで保存します。次に、濾紙と250ミリリットルのフラスコを備えた7センチメートルのバックナー漏斗を使用して、ろ過によりペプチド樹脂を回収します。シンチレーションバイアルの蓋からプラスチック片を取り出し、レジンをバイアルに移します。使い捨てピペットを使用して、樹脂を覆うのに十分な量のメタアクリル無水物を追加しますキャップをバイアルにゆるくねじった後、電子レンジに入れ、タイマーを3分に設定します。耐熱手袋を着用して最大電力で、15〜20秒ごとにバイアルを電子レンジから取り出します。キャップを完全に締めた後、サンプルを15秒間ボルテックスします。バイアルを電子レンジに戻す前に、キャップを緩めてください。溶液が電子レンジで3分間完全に加熱されるまで、これらを繰り返します。バイアルキャップを緩めた状態で、少量のDMFと7cmのバックナーファンネルを使用してペプチド溶液を室温まで冷却します。濾紙と250ミリリットルのフラスコ付き。バイアルからペプチド樹脂を回収し、切断と深い保護を行います。ペプチド樹脂を新しいシンチレーションバイアルに移し、0.25ミリモルのアルギニン含有ペプチドを充填します。トリISOプロピレン3個、二酸化水素6個、チオール脱イオン水1個、TFA1個、それぞれ0.25ミリリットルを加えます。次に、反応混合物を実験室の地震回転子で室温で4時間回転させます。終了したら、ペプチドを10 x pre chill ethyl ether に沈殿させます。4つの50ミリリットルの円錐管の間で溶液を均等に分け、4つのサンプルを3、200 Gで10分間遠心分離し、遠心分離後のペプチドを収集し、エーテルをオフにデカントして、2つの50ミリリットルの円錐管の間で分割された新鮮なエチルエーテルの100ミリリットルでペプチドを再懸濁します。遠心分離プロセスを繰り返します。Resusは、ペプチドを50ミリリットルの新鮮なエーテルに2回懸濁し、合計4回のエーテル洗浄を行い、最後の遠心分離ステップの後、廃エーテルをデカントし、ペプチドを真空下で一晩乾燥させます。マルジ飛行時間分析用のサンプルを調製するには、1.5ミリリットルのアイノールチューブに1〜2ミリグラムのペプチドを入れ、サンプルを1ミリリットルのマルジ溶媒に溶解します。これに続いて、マルチ溶媒中のアルファサノ4ヒドロキシセラミック酸の1ミリグラム/ミリリットルのマトリックス溶液を調製します。ペプチド溶液とマトリックス溶液を1対1の比率で組み合わせ、結合した溶液の1マイクロリットルをMALDIサンプルプレート上の3つの別々の場所にスポットします。ヒートガンを使用してスポットを乾燥させます。次に、各サンプルを再スポットして乾燥させます。最後に、MALDIの飛行時間データを収集し、ペプチドの末端にメタアクリルアミド基を添加することで分子量が1モルあたり68g増加することを確認します。ここに示されているのは、この反応に対してマイクロ波支援法を用いて官能基化された2キロダルトンの線形PEG DMのNMRスペクトルです。プロトンNMR分析は、末端メタクリレートプロトンと中央PEGプロトンの観測比と理論比から官能化率を計算するために使用できます。全体の官能基化率は91%であり、このPEG DMはハイドロゲル合成に使用するために適切に官能化されています。PEPペプチドのプロトンNMR分析で生じる多数のプロトンピークによる官能基化率の計算の詳細については、テキストプロトコールを参照してください。ペプチドの機能化は、マルディ飛行時間型質量分析法を用いてより簡単に調べることができます。これは、ペプチドG-K-R-G-D-S-Gを合成し、メタアクリルアミド機能化を行ったところで、ペプチドのごく一部を機能化前分子量評価のために切断し、観察された分子量ピークが676グラム/モルで発生し、ペプチドの予想される分子量、ペプチドの残りの部分は、メタアクリルアミド機能化後の切断前にメタアクリルアミド機能化を受けたことを示しました。観察された分子量のピークは、メタアクリルアミド官能化ペプチドの予想重量である744グラム/モルで発生します。PEG DMとメタアクリルアミド官能化ペプチドの両方の機能性を実証するために、PEGハイドロゲルを0.5ミリモルメスの有無にかかわらず製造しました。ここに示されているアクリルアミド修飾GK R-G-D-S-Gは、pegゲル単独およびmeth官能化ペプチドを含むpegゲル上のMSCの代表的な位相コントラストおよび生死蛍光画像です。MSCは、国連官能基化PEGハイドロゲルに接着できませんでしたが、細胞接着ペプチドRGDを包含すると、ハイドロゲル表面に接着して広がることができました。生死者の画像は、播種されたMSC集団の生存率を表していません。むしろ、蛍光画像は、接着細胞とハイドロゲルトポロジーの小さな変動とを区別することを目的としていますが、これは位相コントラストだけでは困難です。興味深いことに、PEGのみのゲルに播種された非拡散細胞は、カルシウムAMとAUMホモダイマーの両方に陽性で染色され、イメージング時に細胞が死にかけていたことを示しています。PEGハイドロゲルの多くの利点の1つは、ペグの特定の構成を変更する高度に調整可能な性質です。ハイドロゲルは、ここに示すように、研究者が弾性率などの特性を高度に制御することを可能にします。PEGの分子量と重量の割合はどちらも、ハイドロゲルのメッシュサイズ、結果として生じるヒドロゲル、剛性、およびカプセル化された薬物の放出速度を制御することが知られています。これは、さまざまな分子量を持つハイドロゲルPEG dmを作製し、PEGの分子量を増加させるという仮説として得られるヒドロゲル弾性率とメッシュサイズを調査することによって実証されました。Macerは、ハイドロゲルメッシュサイズの増加とハイドロゲル剛性の減少を引き起こし、ハイドロゲルメッシュサイズと結果として生じるゲル剛性も、重量を変更することによって制御できます。PEGハイドロゲルの割合は、さまざまな重量で製造されました。線形10キロダルトンのPEG DMおよびヒドロゲルの剛性および網のサイズの割合はここに示すように決定され、PEGの重量のパーセントを増加させることは網のサイズの顕著な減少およびハイドロゲルの剛さの増加を引き起こす。カプセル化されたウシ血清アルブミンを含むヒドロゲルは、ここに示すようにさまざまな分子量ペグを使用して形成されました。ウシ血清アルブミンの放出は、ハイドロゲル内のメッシュサイズが大きいため、高分子量のPEG DMを使用して形成されたハイドロゲルからより迅速に発生します。このビデオを見れば、マイクロ波支援法を使用してPEG DMEの栄誉を合成する方法と、プロトンNMRを使用して官能基を評価する方法についてよく理解できるはずです。この手順を習得すると、ヒドロゲル分解が細胞機能にどのように影響するかについての追加の質問に答えるために、加水分解性分解性基の開環を利用することもできます。また、この手法を使用してメタアクリルアミドの官能基を末端ペプチド配列に選択的に組み込む方法や、マルチタイムオブフライト質量分析を使用してこの機能化を評価する方法についても十分に理解しておく必要があります。ご覧いただきありがとうございます。

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