マイクロ流体のPicoinjectionは金属電極がなければ削除します

本手順の総合的な目的は、水中油滴（water in oil droplets）に対して試薬を精密かつ制御可能に注入できる、ピコインジェクション（pico injection）として知られるプロセスが可能なマイクロ流体チップを設計、作製、および利用することです。これは、まず、球状の液滴の直径よりも小さい直径に絞られたエマルションチャネルを持ち、不活性なキャリアオイル内で液滴を均等に間隔配置させるデバイスを設計することで実現します。第2のステップとして、水滴と油滴をデバイスに導入し、注入部位まで流します。

注入される試薬を含む垂直チャネルです。次に、液滴が注入部位を通過する際に注入液に高電圧を印加し、液滴と注入液を合一させます。その結果、印加電圧の大きさを調整することで、注入される試薬の量をピコリットル分解能で精密に制御できることが示されました。本手法は、金属電極の必要性を排除することでデバイスの作製を簡略化したいというニーズから開発されました。

既存の手法に対する利点として、デバイスの設計、作製、および使用の容易さと簡便さが挙げられます。従来の手法で使用されていた金属電極は、破損しやすく、作製中の流路内のほこりや不純物の影響を受けやすいという課題がありました。電極を排除することで、デバイスの堅牢性を高め、作製効率を向上させました。最初のステップは、実験のニーズに基づいてマイクロ流体チップを設計することです。

後でフォトリソグラフィー技術を利用できるように、これにはコンピューター支援設計（CAD）ソフトウェアを使用します。このチップ設計では、より効果的なピコインジェクションを可能にするため、使用する球状液滴よりも小さいエマルションチャネルを備えています。ピコインジェクション部位は、文献にある設計から金属電極を取り除いたものをベースにしています。

追加のチャネルはファラデー溝として機能し、上流の液滴を電界から遮蔽します。設計完了後、ソフトフォトリソグラフィ技術を用いてデバイスを作製し、ガラス製顕微鏡スライドに接合すれば、デバイスの使用準備が整います。次に、流体リザーバーを加圧するための空気圧制御ポンプを準備します。

ポンプの出力を変更し、加圧された空気が内径2.7 mmのポリエチレンチューブを通過して排出されるようにします。チューブの末端をシリンジチップ後方のニップルに装着して固定します。シリンジとチューブの間の隙間をエポキシ樹脂で密封した後、実験に適した試薬を用いて27.5 Gの針を取り付けます。

キャリアオイルに水滴を懸濁させ、均一なエマルションを調製します。このエマルションを27.5ゲージの針を装着した1 mLシリンジに充填します。次に、シリンジをシリンジポンプに固定し、針が上を向くように配置します。

次のステップは、マイクロ流体デバイスへの導入用試薬およびそのリザーバーを準備することです。まず、15 mL遠心チューブとキャップを用意します。バイオプシーパンチまたはその他の便利なツールを使用して、キャップに0.5 mmの穴を3つ開けます。

直径0.5 mm、長さが遠心チューブより数センチメートル長いワイヤー電極を用意します。この電極をキャップの穴の一つに挿入します。電極がチューブの底まで届き、上端から数センチメートル突き出ていることを確認してください。

次に、約20 cmのポリエチレンチューブを用意します。これを2つ目の穴に挿入してください。ここでも同様に、残りの穴にあるチューブの底部まで届くようにします。

ポリエチレンチューブを約2.5 centimeters切り出し、ネジのように巻き付けます。このチューブは液面より上に配置します。キャップ上部の隙間を密封するために、UV硬化エポキシ樹脂を塗布します。

硬化が完了したら、ここに目的のピコ注入液（100 millimolar sodium chloride）を満たし、キャップを締め付けます。空気圧制御ポンプからの出力を、キャップにある短い方のチューブに接続します。針をルーメンに挿入すると、針がぴったりと収まるはずです。

遠心管をホルダーにセットします。次に、1 M の塩化ナトリウム溶液を 1 mL シリンジに充填します。ファラデー・モート液として使用するため、27.5G の針を接続し、シリンジをシリンジポンプに固定します。

別の1 mLシリンジにキャリアスペーサーオイルを満たします。27.5ゲージの針を接続し、シリンジポンプに固定します。この時点で、マイクロ流体チップへの接続が可能です。

まず、チップが平らな面に固定されていることを確認します。次に、注入液容器から伸びる長いチューブの開放端をチップまで持っていきます。このチューブを、マイクロ流体チップ上のpico注入液のインレットポートに接続します。

次に、塩化ナトリウムを含むシリンジにポリエチレンチューブを取り付け、チップまで伸ばします。これをファラデー堀（Faraday moat）の入口ポートに接続します。同様に、チューブを使用して、キャリアオイルを含むシリンジをデバイス上の対応する入口ポートに接続します。

エマルション出口ポートから回収容器へと至るチューブを接続します。最後に、チューブを用いてファラデー堀（Faraday moat）の出口ポートを、導電性のない電気的に絶縁された容器に接続します。最終的に、マイクロ流体チップはこのようになります。

次に、高電圧アンプのグランドからワイヤーを取り出し、塩化ナトリウムが入ったシリンジの針まで伸ばします。ワニ口クリップを使用して、ワイヤーを針に固定してください。さらに、アンプの高電圧出力から別のワイヤーを伸ばし、ピコインジェクション液に浸した電極に接続します。

ワニ口クリップを使用して、アンプへの入力接続を行います。ソフトウェア制御の波形発生器のコンピュータ出力を利用してください。1 Mの塩化ナトリウムファラデーモート液を100 µL/hで装置に導入し、システムの注入を開始します。

その後、液滴、エマルション、およびキャリアオイルを流し、キャリアオイルのギャップで区切られた液滴が一定の間隔でピコインジェクターを通過するようにします。ピコ注入孔の流体が液滴チャネル側に膨らみ、かつそれ自体が液滴として切り離されないように、ピコ注入液に印加する圧力を調整します。波形発生器を用いて、振幅0〜10Vの10kHz AC信号を生成し、高電圧アンプで1,000倍に増幅させます。

ピコ注入を行うには、液滴が注入オリフィスを通過する際にこの信号を印加し、振幅をパラメータとして使用します。この動画では、蛍光色素の有無に応じた液滴の選択的注入を示しています。

この例では、インジェクターを通過する液滴は毎秒200滴でしたが、適切な液滴検出メカニズムを用いれば毎秒最大10,000滴まで可能です。これらの図は、異なるモル濃度の注入液における、印加電圧の関数としての注入体積分率を示しています。高電圧を印加すると、合一の開始が早まり、その結果、注入時間と注入量が増加すると考えられています。

この2次元ヒートマップは、イオン溶液のモル濃度と、注入量を実現するために必要な電圧との関係を示しています。低モル濃度溶液は、注入部位における電場をより減少させやすいため、より高い電圧が必要となります。このビデオを視聴することで、液滴への試薬の精密かつ制御可能な注入を可能にするマイクロ流体デバイスを、迅速かつ堅牢に設計・作製する方法について十分に理解できるはずです。

高電圧での作業は極めて危険であるため、適切な接地（アース）、個人用保護具の使用、および組み込みのフェイルセーフなどの予防策を常に講じてください。