Name: 根粒とマメ科植物の成長のための単一の植物、滅菌マイクロコズムウマゴヤシtruncatula根粒共生とシノリゾビウム根粒 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-01T09:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 1 s
Description: 学ぶ単一植物滅菌マイクロコズムを用いたMedicago truncatulaとSinorhizobium melilotiの根粒共生の定量分析法。種子の酸処理から接種までの技術を習得し、植物微生物相互作用の研究に応用できる。

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私たちは、原稿の批判的検討のためにブライアン·K·ウォッシュバーンに感謝KMJに20582 - この作品は、米国農務省国立食糧農業研究所、農業·食品産業技術総合研究イニシアティブ助成金2010から65108によって賄われていた。

ステップを実行することは、1、2、4、および無菌層流フード6が推奨される。 1。 Mの準備truncatula A17苗注：M. truncatulaこれらの研究で使用A17種子は約22℃で、または〜150〜400ミリモル/ mは22〜26℃に維持し、植物生育室で冷却し、温室条件下で生産され-2 s -1の光。 <ol><li>種子の発芽プレートを注ぐ：100ミリメートルの正方形プレート（深い15ミリメートル）を使用し、3〜5 mmの深さまで10寒天を精製w / vのオートクレーブ処理1.1から1.2パーセントを注ぐ。各プレートは（63から125個/プレートに相当）の種子〜0.25〜0.5グラムを発芽するために使用されます。 注：このプロトコルで説明されているすべてのプレートのための植物細胞培養テスト済み、精製された寒天を使用することが重要です。寒天のベンダーとカタログ番号の情報は、特定の試薬および装置の表に記載されています。 </li><li>表面を傷つける/ Mを殺菌truncatula A17シードS：苗、所望の数のための十分な種子を計量する。 （;これは〜63から125の種である0.25〜0.5グラムシード/フラスコ）ピペット濃厚の20ミリリットル（96％）、滅菌ホイルカバー付きの滅菌125ミリリットルのフラスコに種を置きます（M.は A17種子が〜4mgのそれぞれtruncatula） H 2 SO 4をフラスコの側面に沿っ。 注意：酸乱切種子を殺菌します。また、フラスコの側面に沿っ酸ピペッティングすることによって、それが未滅菌種子に接触したフラスコ内に再滅菌するであろう。 </li><li>滅菌ガラスピペットを用いて種子の塊を壊す。 10月12日分頻繁に各フラスコを旋回。小さな茶色のピットが、種子に見えるようになります。これらは、種皮11の小さな穴である。 注意：濃H 2 SO 4を操作する場合、目の保護と手袋を着用してください。 </li><li> 4の H 2 SO を削除し、種子をすすぐ：種子の少なくとも10％は、小さな茶色のピットを持っているか、12分が経過すると、どちらか最初に来る、滅菌ガラスピペットを用いてフラスコからすべての酸を除去する。 （少なくとも300ミリリットルの水道水を入れた1〜2リットルのビーカーに置き、廃酸が、これは、酸を希釈し、過熱を防ぐことができますが。）をフラスコの曲線の残りの酸を収集し、小さなガラスピペットを使用するために、フラスコを傾けて残りのすべての酸を除去。残留酸が残っている場合、それは、すすぎ水と反応し、種子を加熱して、それらを殺します。 <ol><li>すぐに各フラスコに滅菌超純水100mlを注ぐことによって、種子を洗浄します。水の過剰量は、酸を希釈し、水と酸との反応の間に過熱し、種子の損傷を防ぐことができます。水を捨て、フラスコのリップを火炎滅菌する。 </li><li>滅菌超純水50mlでシード8-10Xを洗浄します。各すすぎ中にフラスコを旋回。フラスコは、この時点で無菌考慮されるべきで、フラスコのリップは、各すすぎの前に燃え上がっする必要があります。 </li></ol></li><li>種子は一晩を吸収しましょう​​：アフター最後のすすぎは、暗い一晩中4℃で各フラスコや場所に無菌ホイルカバーを交換して、各フラスコに50ミリリットル滅菌超純水を注ぐ。 </li><li>発芽プレートの上に置いて、種子：せる種子は一晩吸収した後、種子を再懸濁してから1.1から1.2パーセント寒天発芽プレート上にそれらを注ぐために20ミリリットル滅菌超純水、渦を追加し、約25mL超純水で2回すすぎ、水を注ぐステップ1.1。種子はフラスコ内に残っ​​ている場合は、より多くの水を追加してから注ぐ。 1プレート（63から125個/プレート）に各フラスコからの種子を配布します。 <ol><li>種を配布するために、プレートを旋回。種子は、プレートの一端で4〜5センチメートル帯域に均等に分布されるべきである。これは、プレートの「トップ」になります。 「底」5〜6センチメートルは種子（ 図2A）の自由に保つ必要があります。 </li><li>滅菌ピペットで水を引く。プレートの底に残った水の流出をさせるために45°の角度でプレートを傾けます。ゴマに蓋を交換してくださいテッドプレート、光から保護します。プレートを10〜20分を排出するために許可する必要があります。 （ 図2B）。 </li></ol></li><li>発芽を設定します。滅菌ピペット傾斜プレートの底に溜まった水をすべて削除します。 <ol><li>蓋を交換し、パラフィルムでプレートをシール。手袋を着用した（ 図2C）無菌に保つ。 </li><li>発芽プレートを積み重ねた後、90°の角度でそれらのすべてを上げる。種子は寒天の垂直面に横たわっていることでしょう。完全に吸水種子を簡単に寒天を遵守する必要があります。根は下向き（ 図2D）が成長します。 </li><li>光を遮断し、3日間、25℃で維持するためにホイルで発芽プレートのスタックを包む。 </li></ol></li></ol>注：以下で3日間発芽が進行する場合には、根は小宇宙で寒天に届かない場合があります。発芽は4日以上縮図プレートに移す前に進んだ場合、苗の生存率は意志悪くなる。 M.場合低速の発芽率とのtruncatulaの生態型または変異体が比較されるべきであり、徐々に発芽生態型は、3日以上発芽させなければならない。 2。個々のプレートマイクロコズムの作製<ol><li> Jensenの媒体12を準備します（組成については表1を参照）、各小宇宙のための約70 mlの培地を許可する。急速に注ぐ（投手はなし以上1〜2以上のL）に便利な投手またはフラスコに準備し、オートクレーブ中に投手の磁気攪拌棒を残す。 <ol><li>媒体が約55〜65℃、サプリメントが追加されているために冷却され、pHが（表1を参照）をチェックした後、丸直径100mmに15ミリメートルの深いプレートを注ぐ。プレートは、（〜70ミリリットル/プレート）〜0.9〜1センチメートル深い注ぐべきである。 </li><li> Jensenの培地の成分は、曇った沈殿物を形成することができるので、沈降からコンポーネントを防止するために、定期的に磁気撹拌板に投手を返すことが重要です。析出物はVISかもしれ彼らが固化した後にプレートにible、そして限りが均等にプレートに分散しているように、パフォーマンスには影響しません。 </li><li>プレートの蓋に結露防止のために注ぐ時にプレートを積み重ねる。 </li></ol></li><li> Jensenのプレートが固化した後、U字型5（ 図3A）に屈曲された計量スパチュラで両プレートと蓋ノッチ。レッドホット、ノッチ5-6枚までバーナーでヘラの曲がりを加熱してから、再度加熱する。ノッチ付き蓋がノッチプレート上に置かれたとき、これは、苗の茎（ 図3B）を介して成長される楕円形のポータルを作成する。ノッチプレートを格納する場合には、パラフィンフィルムで個別に包む.. </li></ol> 3。 シノリゾビウム根粒文化の調製二日植物接種前に、全てのSの文化を開始根粒は、苗に接種することが株。 Cultu2.5のMgSO 4、2.5mMのCaCl 2、および適切な抗生物質（TY培地でもうまく機能）を補充した解像度LBMC（ルリア-ベルターニ[ミラー]）中で増殖されるべき媒体13。各培養物のわずか2〜3ミリリットルで十分です。 <ol><li>細胞が密になるまで2日間、振とうしながら30℃で成長する。 </li><li>ほとんどの植物接種のために、Sの成長期根粒は重要ではない。一般的に、後期対数または初期定常期の細胞が用いられる。 </li></ol> 4。 Mをレイアウトする個々のマイクロコズムにtruncatula苗<ol><li> 3日後、（ステップ1で調製）発芽プレートを開いて、すぐに滅菌超純水をフラッディングする。ディップは、エタノールと殺菌する炎を簡単に鉗子。やさしく乾燥を防ぐために水の下で、すべての苗の根の先端をプッシュする滅菌ピンセットを使用しています。根は2〜6センチメートル長距離ます。大半3-4 cmになります。ストレートルーツと明らかなと苗を選択欠陥。 </li><li>結露の蓄積のためにJensenのメディア小宇宙のふたを確認してください。結露を削除するか、新しいノッチ蓋と交換する蓋をフリック。蓋に結露が過剰がある場合は、苗の根は、蓋に付着して、結露が乾燥した後に死亡することがあります。 </li><li>鉗子を使用して、ゆっくりと子葉で発芽プレートから苗を選んで、Jensenのメディア小宇宙に根を置く。根端寒天に接触していることを確認します。 </li><li>それがまだ存在する場合はそっと種皮を取り除きます。種皮には5〜10分間水に浸した後に緩んでなければなりません。静かにそれは方法を提供しますまで、ピンセットで種皮をいじめるし、捨てる。撮影の子葉と約0.5cmのプレート（ 図4A）で、Uノッチから突出しなければならない。丁寧に苗（ 図4B）のためのポータルを作成すること、苗の上に蓋のUノッチプレートの蓋を交換してください。すべての苗が小宇宙上に置かされるまで、水平スタックに置いプレートを設定します。 </li><li>実行可​​能な見て、まっすぐに根を持っているそれぞれの発芽プレートから全ての苗を使用してください。 （可能な場合は、単に接種前しおれた苗の代替品として使用するように未開封の苗の1のプレートにしておきます。） </li><li>すべての苗をレイアウトした後、それらを水平Jensenの小宇宙に座ることを可能にしているが、S.根粒接種懸濁液は、準備されている。 </li></ol> 5。 Sの準備根粒接種懸濁液<ol><li> Sをチェックする定期的に接種後根粒培養は、彼らが成長していることを確認します。 2日間増殖させた後、OD 600は 2と4の間であるべきである。 </li><li>ピペット滅菌した1.5​​mlチューブ、ペレットを遠心分離機に各文化の0.5ミリリットル。上清を取り除きます。 </li><li> 0.85％無菌NaClまたは滅菌超純水のいずれかで細胞を2回洗浄します。 0.5ミリリットル0.85％ステレオで細胞を再懸濁NaClまたは超純水をニトリル。 </li><li>再懸 ​​濁S.の1/10希釈液のOD 600を測定するステップ5.3からメリロティ文化。この読み取りに基づいて、OD 600 = 0.05に滅菌超純水で各培養物の懸濁液とし。細胞密度が高すぎると、根粒形成を抑制することができる。 100μlを各苗に接種することができるように、希釈懸濁液を十分に確認してください。 OD 600 = 0.05懸濁液の濁りは、目でわずかかろうじて認知すべきである。 </li></ol> 6。マイクロコズムの接種とシール<ol><li>直前に始まる接種に、Jensenのメディア小宇宙への転送を生き延びていないしおれた苗をチェック。発芽プレートからの新鮮な苗とのそれらの苗木を交換してください。 </li><li>各小宇宙を開き、適切なS.100μlの接種苗の根の上にメリロティサスペンション。蓋を交換し、水平STACに取っておく6月10日小宇宙のKS。各S.のためのメリロティ株は、比較される、少なくとも15の植物に接種。共生生産性の微妙な違いを持っ​​ている株について、30〜35の植物に接種。ネガティブコントロールとして未接種の少なくとも10の植物を残す。 Sで30〜35の植物に接種メリロティ 1021または他の適切な野生型株を陽性対照として機能する。 </li><li>後にS.メリロティサスペンションは根表面に吸着するための時間を持っていたし、懸濁液を寒天（少なくとも20分）に浸漬している、パラフィンフィルムで個別に各プレートをラップします。プレートは、ノッチの非常にエッジに包まれるべきであるが、パラフィンフィルムは苗（ 図4C）の成長を阻止するべきではありません。 </li><li>ラッピングの際には、プレートの蓋の内側に付着した根のための最終的なチェックを行う。蓋から付着した根を取り除くベンチに平板を置き、寒天SUに戻しダウンルートをノックするように蓋をタップまたはフリックするにデータポート。 </li><li> 6月10日版の各スタックの苗ポータルをラインアップ。上向きの苗（ 図4D）と90°の角度でスタックを置く。パラフィンフィルムの粘着1-2センチのストリップを残して、ホイルでスタック全体を包むように十分な長さの所定の位置にプレートを保持する苗は（ 図4E）出現場所アンラップ。ホイルは光から根を保護します。 </li><li> （16時間明/ 8時間暗のサイクルで21〜25℃、60〜70％の相対湿度および100から175マイクロモル/ M -2 S -1光で照らさ成長チャンバーまたは成長ルームでホイル包まスタックを配置図1A）。これらの成長条件の下で、光レベルでの長時間のインキュベーションは、より高い200μモル/メートル-2 s -1の植物成長に有害な影響を有することができる。 </li></ol> 7。根系と共生の表現型の定量の検討植物は、維持することができる最大9週間の小宇宙。 <ol><li>結節数は、各スタックからホイルをアンラップし、結節を計数することにより一連の時間点で定量することができる。 S.を接種した植物に根粒を開発メリロティ 1021野生型接種後10〜14日で明らかである。 </li><li>共生生産性も新興シュートの長さを測定することにより、各時点で測定することができる。 </li><li>共生の生産の最終定量は、通常撮影を取り外し、撮影の生重量を測定することにより、接種後7週目に行われている。長い成長が必要な場合は、このステップは、後半9週ようにして行うことができる。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

成功のために不可欠なプロトコルのいくつかのステップがあります：1）精製された、植物細胞培養を使用する必要は寒天を強調しすぎることはできませんテストされています。これはアルファルファの苗のために重要ではないが、それはMの成長のために重要であるtruncatula A17。 2）ステップ1に記載したように垂直寒天プレート上に実生を発芽することが重要である。苗の根がまっすぐ短すぎ、および/ ​​またはないであるので、15ミリメートル、深プレート7で反転水平面に苗を発芽の広く使われている技術は、このプロトコルのためお勧めできません。長さ2-4センチストレートに成長しているルーツを持つ苗は小宇宙に発芽プレートからの転送に最適です。垂直発芽プレートの成長の三日間は、この長さを達成するために、通常の根に最適です。 3）また、接種前に根粒菌との苗木の汚染を回避することが重要です。 microcoに発芽プレートから苗の移送前SMSは、作業領域が完全にエタノールで洗浄する必要があり、転送で使用されているすべての機器は頻繁に滅菌炎べきである。汚染の他の潜在的な源は、S.を調製すること...

マメ科宿主植物ウマゴヤシtruncatula A17とシノリゾビウムは 1021 メリロティ根粒細菌との相互作用は、根粒の発達と窒素固定共生の研究のための最も扱いやすいモデル系の一つである。両方の共生パートナーのゲノムは、1,2を配列決定されており、プラントおよび細菌の両方が遺伝子操作3,4に適している。植物および細菌の変異株の両方の表現型の解析は、根粒の発達の段階を観察し、時間の経過とともに共生の生産性を定量化する能力を必要とします。ここでは、M.の根粒の発達を観察するための方法を記載履歴書をtruncatula。 S.を接種Jemalong A17標準、ラウンド直径100mm、15ミリメートル、深実験室プレート（ 図1A）から作られた個々の小宇宙内メリロティ 1021。シュートは、プレートの側面にある切り欠きのポータル（Figurを介して公開し、成長しているエス1B、1C、および1E）。根は小宇宙の中に含まれているとプレート（ 図1D）の蓋による観察を可能にしながら、無菌保持されます。シュートがアクセス可能であるので、その成長が制約されるものではなく、ルートの無菌性を損なうことなく、定期的に測定することができる。ノッチプレートマイクロコズムを作成する方法は、もともとアルファルファ植物を成長させるためのリーら 5によって開発されたが、それは広く、他の方法に比べて多くの利点にもかかわらず、採用されなかった。この方法のバリエーションは、植物の根と菌根6の間の相互作用を分析するために開発された。我々は今、Mの増殖に適合し、この方法を最適化していますtruncatula工場 。より一般的に使用される方法に勝るこのプロトコルの利点は、以下に説明する。 Mの根粒形成の研究のために現在広く用いられているいくつかの方法があります。 truncatula inocuSでlated メリロティ 7。節のある根の大規模調製のために最も一般的に使用される方法は、aeroponicケーソン7の成長である。この方法では、植物は、大血管上に懸架され、根はS.の混合物で通気されている根粒と栄養溶液7。この方法は現実的であるかのSの唯一の遺伝子型根粒は、テストされる。それは細菌の高濃度のエアロゾル化を必要とするため、異なる細菌株を接種したケーソンの間の交差汚染の可能性が高い。多くの場合、接種した植物を大量に調製するために使用される別の方法は、浴槽またはパーライト、バーミキュライト、砂または栄養溶液を注入し、S.を接種された焼成粘土の鉢で成長であるメリロティ 7。このメソッドは、開いている桶やポットの使用を必要とし、栄養溶液の水やりや補充が必要です。ポットの別の欠点は、植物のことである根や結節の検査のために、この粒子状マトリックスから削除する必要があります。この方法の別の欠点は、ときに、多くの異なるS.インキュベーター空間の大きな領域が必要とされることである別個の鍋は、各細菌の遺伝子型のために使用しなければならないので、 メリロティ遺伝子型は、比較される。 「レナードジャー」は、この方法で8,9のバリエーションです。レナードジャーは、他の上に1を積層して芯で接続された2つの滅菌の容器で構成されている。増殖培地を下部容器に入れ、パーライト、バーミキュライト、砂、上部容器中の焼成粘土の成長マトリックス中に毛管作用によって芯を通って引き込まれる。苗（単数または複数）は、成長マトリックス中に入れ、S.を接種するメリロティ 。この方法は、水やりは必要ありませんが、根や結節の検査では、苗が粒子状の成長マトリックスから削除されている必要があります。 カンガルーの簡単な検査を可能にするか、いくつかの方法がありますTS。これらの一つは、透明なプラスチックの「成長パウチ」7である。この方法の欠点は、≤10ミリリットルの液体媒体はM.を成長させるために最適であるので、頻繁な散水が必要とされることである小袋7 truncatula。ポーチ実験はまた、通常のため、ポーチ内の紙芯の内訳を、〜2週間7に限定されている。一般的に使用される2つの他の方法は、植物を寒天上で増殖させ、根が見えるされていることに我々の手法と同様であるが、これらの方法はまた、我々の手順が回避される欠点を有する。これらの方法では、植物は完全に24.5センチメートル多孔サージカルテープでトップの周りに密封された、または綿のプラグまたはプラスチック製のキャップ7で栓を寒天スラント試験管で栽培X 24.5センチメートル寒天プレート内に含まれています。これらの方法はいずれも、根の容易な検査を可能にし、無菌に保つことができる。しかし、寒天斜面管は通常、媒体7寒天のみ20ミリリットルで増殖させ、水やりと栄養A必要植物の長期的な成長のためにddition。 24.5センチメートルX 24.5センチメートル内寒天平板マイクロコズムを成長した植物は、長期的な成長のために十分な水分と栄養を持っていますが、根粒7を阻害する構築することができ、成長のシュートを速やかに囲まれたプレート縮図とエチレンガス内に拘束になる。ここで説明する手順では、シュートを露出させ、長期的な成長を可能にするメディアの〜70ミリリットルが含まれている小宇宙の外に自由に成長する。 ここで説明する手順は、マメ科植物の根粒形成の研究のためだけでなく、他の中型植物の根の表現型の研究のためだけでなく、有用であり得る。これらの小宇宙と伝統的なポリカーボネートの植物組織培養瓶の違いは、ここで説明するプレートマイクロコズムにおける根がダウンジャーの底に寒天の水平層に寒天の垂直面上に成長ではなく、ということです。これは、ルートは、最小のdの寒天表面から持ち上げられることを可能にする根毛や顕微鏡によって根毛の検査を容易に根表面に寒天の最小付着amage。

<table><tbody><tr><td>寒天精製、植物細胞培養試験済み</td><td>Sigma</td><td>A7921</td><td></td></tr></tbody></table>

根粒とマメ科植物の成長のための単一の植物、滅菌マイクロコズム<em&gt;ウマゴヤシtruncatula</em&gt;根粒共生と<em&gt;シノリゾビウム根粒</em

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

根粒菌は、互換性のあるホストマメ科植物の根に共生窒素固定根粒を形成している。これらの相互作用を研究するための最もよく発達したモデル系の一つは、 ウマゴヤシの履歴書をtruncatula植物です。 Jemalong A17と根粒細菌シノリゾビウムは 1021 メリロティ 。植物の根と共生の表現型のスコアリングを繰り返しイメージングは​​、植物や細菌のいずれかに非破壊的な方法を必要とします。いくつかの植物や細菌の突然変異体の共生表現型は、成長の比較的短い期間の後に明らかになると、ホスト/共生相互作用の長期観測を必要としません。彼らが得点する前にしかし、根粒形成過程の初期段階で明らかにならないの共生効率と結節老化の表現型の微妙な違いは、比較的長い成長期間が必要。いくつかの方法がこのホスト/共生対の長期成長および観察のために開発されている。しかしながら、これらの方法の多くは、他の微生物による汚染の可能性を増大させる繰り返し散水を必要とする。他の方法は、植物の多数の成長のために比較的大きなスペースを必要とする。ここで説明する方法、Mの共生成長truncatula / S滅菌された単一の植物マイクロコズムにおける根粒は 、いくつかの利点があります。これらのマイクロコズム中の植物はその水やりは水やりの際に交差汚染を防ぐ、最大9週間のために必要されていないことを確認するのに十分な水分と栄養を持っている。これは表現型は、結節の開発と早期結節老化の微妙な遅延などの短期的な成長システムに見逃される可能性のある定量化することができます。必要とされていないアップ発根観察のための植物のようにも、小宇宙をルーツと結節が容易に、プレートのふたを通して見ている。

これらのプレートマイクロコズムの調製及び接種は、冒頭で説明した大部分の他の方法に比べて比較的単純である。これらの小宇宙の使用も水やりや栄養素の補給、ルート無菌性の維持、両方のルーツと光から根の保護を容易に検討することなく、（9週まで）延長された植物の成長を可能にし、植物の制約のない成長は、のために撮影して、簡単にアクセスを撃つ長さ測定、及び根毛への最小限のダメージで小宇宙からの植物の除去。 図1（a）は、培養器内の小宇宙に成長している若い苗を示しています。 図1B-1Eショーで画像Mを含むマイクロコズムのいくつかの異なるビュー野生型S.を接種truncatula A17植物メリロティ 1021。密集した場合は、&gt; 220小宇宙73.8センチ×67.5センチメートルインキュベーターの棚に収まる。で1Bおよび1Cは小宇宙を図マイクロコズムにおけるポータルから出てくる植物とホイルでラップされたスタック。 図1Dは</...

標準的な実験プレートから作られた個々の滅菌マイクロコズムにおける窒素固定細菌シノリゾビウム根粒との共生におけるウマゴヤシtruncatulaの植物の成長は、無菌性を損なうことなく、根系や結節の頻繁な検査を可能にします。植物は、最大9週間、これらの成長チャンバー内に維持することができる。

Rhizobial  bacteria form symbiotic, nitrogen-fixing nodules on the roots of compatible host  legume plants.  One  of the most well-developed model systems ...

本手順の目的は、標準的なラボプレートで作製した単一植物用滅菌マイクロコスムを用い、窒素固定細菌 Sinooume latte の異なる変異体を接種した Medicago truncatula 植物の共生表現型を定量化することです。まず、M. truncatula の種子を酸でひげきし、アガープレート上で発芽させます。次に、曲げた熱スパチュラを用いて、凝固したプレートとその蓋に切り込みを入れ、プレートを密閉することで、単一植物用滅菌マイクロコスムを調製します。後で側面に楕円形の穴を開けます。次に、個々のMula苗をマイクロコスム上に配置し、根端がアガールに接触するようにし、また、シュートの0.5 cmがプレートのU字型切り欠きから突き出すように配置します。最後のステップは、SME latteによる接種と、プレートをアルミホイルで包んで積み重ね、照明付きの育成チャンバー内でインキュベートすることです。最終的に、植物の地上部の長さと重量、および根粒の形態を定量化することで、各S milliot高病原性系統またはULA変異株の相対的な共生成功率を示します。成長ポーチやカソン（cason）のように根の成長を継続的に視覚的に観察できる他の手法と比較して、本手法の主な利点は、異なるCy Melo系統を接種した植物間の交差汚染のリスクが極めて低いことです。この方法は、異なる効率で根に侵入するs rosa Melodi系統のコレクションを接種したmego trica植物における根粒形成のタイムフレームなど、Zoia legumの共生分野における重要な課題の解決に役立ちます。マイクロコスムの構築と苗の移植を文章で説明することは困難であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが不可欠です。この手順のデモンストレーションでは、私の研究室の大学院生であるHaji MendezとポストドクトラルフェローのClotilde Caruが補助を務めます。本手順は、M trunk aulaの滅菌から始まります。A 17 種子の酸処理による種皮破砕を行うには、まず、目的の苗の数に必要な量の種子を量り取ります。Mula A 17 種子の1粒あたりの重量は約 4 mg です。種子を滅菌済みの 125 mL フラスコに移し、滅菌済みのアルミホイルで蓋をします。ピペットを用いて、濃硫酸 20 mL をフラスコの壁面に沿って加えます。壁面に沿って酸を加えることで、未滅菌の種子が接触したフラスコ内部を滅菌することができます。滅菌済みのガラスピペットを用いて、種子の凝集をほぐします。各フラスコを10〜12分間、頻繁に回転させます。すると、種子に小さな褐色の点が見えてきます。これらは種皮にある微小な穴です。少なくとも10%の種子に小さな褐色の点が見られるか、または12分が経過した方のいずれか早い時点で、滅菌済みのガラスピペットを用いてフラスコからすべての酸を取り除きます。フラスコを傾けて残りの酸を曲面部分に集め、小型のガラスピペットで残った酸をすべて取り除きます。各フラスコに100 millilitersの滅菌超純水を素早く注ぎ、種子を洗浄します。十分な量の水を用いることで酸が希釈され、酸と水の反応による過熱および種子の損傷を防ぐことができます。水を捨て、フラスコの口を火炎滅菌してください。各フラスコに滅菌超純水を50 milliliters加え、回旋混和させる。水を捨て、フラスコの口を火炎滅菌する。さらに滅菌超純水を50 milliliters加え、同様に回旋混和させる。最後のすすぎの後、種子を8〜10回すすぎます。各フラスコに50 millilitersの滅菌超純水を注ぎ、滅菌フォイルで蓋をして、4 °Cの暗所で一晩置きます。翌日、種子を吸水させるため、2本のフラスコを滅菌ラミナーフローフードに移動させます。空中浮遊するカビの胞子が最も問題となる汚染源であるため、以降のすべての工程は滅菌済みのラミナーフローフード内で行わなければなりません。各フラスコから水を捨て、約 25 milliliters の超純水で2回すすぎます。2回目のすすぎの後、各フラスコに 20 milliliters の滅菌超純水を加え、種子を再懸濁するために撹拌し、種子を 1.1 to 1.2%Agar 発芽プレートに注ぎ、プレートを揺らして種子を分散させます。種子は4～5 cm幅の帯状に均等に播種してください。プレートの一端を上端とします。下側の5～6 cmには種子を播種せず、空白にしておいてください。滅菌ピペットを用いて水を吸い出します。プレートを45度の角度に傾け、残った水がプレートの底に溜まるまで10〜20分間保持します。次に、傾けたプレートの底に溜まったすべての水を滅菌ピペットで取り除きます。蓋を戻し、パラフィルムでプレートを密閉します。発芽プレートを積み重ね、すべて上向きに回転させます。90度の角度にすることで、種子がアガールの垂直面に接した状態になります。十分に吸水させた種子は、アガーに容易に付着します。根は下方に向かって伸びます。発芽プレートのスタックをアルミホイルで包んで遮光し、25 °Cで3日間保持してください。この手順を開始するために、付属の原稿にあるレシピと指示に従って Jenssen 培地を調製します。培地が冷却され、サプリメントが添加され、pH の確認が完了した後、直径 100 mm、深さ 15 mm の円形プレートに培地を注ぎ始めます。プレートの厚さは約0.9〜1 cmになるように注いでください。1プレートあたり約70 mLの培地を使用します。プレートの蓋に結露が生じるのを防ぐため、注いでいる間はプレートを重ねて置いてください。jenssen's mediumの成分は白濁した沈殿を形成することがあるため、成分の沈降を防ぐために定期的にフラスコをマグネ Tステアラーに戻すことが重要です。jenssen'sプレートが凝固した後、プレートと蓋の両方に、U字型に曲げた秤量用スパチュラを用いて切り込みを入れます。バーナーでスパチュラの曲がっている部分を赤くなるまで加熱し、5〜6枚のプレートに切り込みを入れた後、再度加熱して切り込みを入れます。同様に、プレートの蓋にも切り込みを入れてください。切り込みのある蓋を切り込みのあるプレートに重ねると、苗のシュートが成長して通り抜けるための楕円形のポータルが形成されます。前述の手順で播種したMula種子の発芽から3日後、発芽プレートを開け、直ちに滅菌超純水で満たします。ピンセットをエタノールに浸し、短時間火炎滅菌してください。滅菌済みのピンセットを使用して、乾燥を防ぐためにすべての苗の根端をそっと水中に押し込み、根が真っ直ぐで明らかな欠陥のない苗を選別します。 Jenssen培地マイクロコスムの蓋に結露が溜まっていないか確認してください。ピンセットで蓋を弾いて結露を取り除きます。発芽プレートから苗を慎重に摘み取り、根をJenssen培地のマイクロコスム上に置きます。根端がアガーに接触していることを確認してください。種皮がまだ残っている場合は、慎重に取り除きます。ピンセットで種皮を軽く刺激し、剥がれたら種皮を廃棄します。苗の約0.5 centimetersのシュートが、プレートのU字型ノッチから突き出している必要があります。プレートの蓋を慎重に閉め、蓋のU字型ノッチを苗の上に合わせ、マイクロコスムの接種前に苗用のポータルを作成します。S mil latteの接種液懸濁液は、付随するテキストに記載されている通り、S mil latte培養物から調製します。各懸濁液を滅菌超純水でOD 600が0.05になるまで希釈します。このとき、懸濁液の濁りは目視でかろうじて確認できる程度である必要があります。各マイクロコスムを開け、適切なsalvati懸濁液100 µLを苗の根に接種します。蓋を閉め、比較する各SEL株ごとに6〜10個のマイクロコスムを水平に積み重ねて置いておきます。共生能の差がわずかである菌株については、少なくとも15株の植物に接種してください。30から35株の植物に接種します。陰性対照として、少なくとも10株の植物を未接種のまま残しておきます。陽性対照として、30から35株の植物にEsme Lata 1 0 2 1またはその他の適切な野生型菌株を接種します。Esme Lata懸濁液が根の表面に吸収され、懸濁液がアガーに浸透するまで少なくとも20分間待機した後、各プレートをパラフィンフィルムで個別に包みます。プレートは切り欠きの端まで包みますが、パラフィンフィルムが苗の成長を妨げないようにしてください。6枚から10枚のプレートを積み重ねた各スタックの苗用ポータルを一直線に揃えます。スタックを90度の角度に傾け、苗が上を向くように配置します。パラフィンフィルムの粘着性により、プレートが十分に固定されるため、その間にスタック全体をアルミホイルで包みます。この際、苗が出ている部分は1〜2 cmほど包まずに残してください。アルミホイルで包んだスタックを、適切な条件に設定した照明付きの育成チャンバーまたは育成室に置きます。植物はマイクロコスモス内で最大9週間まで維持できます。各スタックからホイルを外して根粒を数えることで、一連の時間経過における根粒数を定量化できます。SME 1 0 2 1 野生型を接種した植物では、接種後10〜14日までに根粒の発達が確認できます。共生生産性は、また、出現したシュートの長さを測定することにより、各時点での測定が可能です。共生生産性の最終的な定量化は、通常、接種から7週間後にシュートを切り離し、若苗の生重量を測定することによって行われます。この写真では、インキュベーター内のマイクロコスムで育成している様子が示されています。密に配置した場合、73.8 centimeter × 67.5 centimeter のインキュベーター棚に 220 個以上のマイクロコスムを設置することが可能です。続く4枚の画像は、Mula を含むマイクロコスムのさまざまな視点を示しています。野生型 S を接種した 17 本の植物（Malta 1 0 2 1 パネルBおよびC）では、ホイルで包んで積み重ねたマイクロコスムから、ポータルを通じて植物が生えている様子が示されています。地上部の長さは、植物を乱すことなく、マイクロコスモスから出ている点から測定できます。パネルDは、フォイルを取り除き、プレートの前面から根と根粒が見えている単一のマイクロコスモスを示しています。パネルEは、同じマイクロコスモスを平らに置き、プレートのポータルから植物が出ている様子を示しています。マイクロコスモス内での育成は、根粒の発達とシュート長の一連のタイムポイントを収集するのに理想的です。このグラフは、emran atulaのシュート長のデータを示しています。野生型Es Malta 1 0 2 1を接種した17株の植物と、非接種の植物を、接種後7週および9週で比較しています。接種から9週間後、シュートを切り取り、シュート生重量を測定します。非接種植物は成長が停止して黄変し、シュートの重量は約0.01 gにとどまります。Mulaに効率的に侵入するssta株を接種した植物は、より速く成長し、接種から9週間までに0.10～0.12 gの重量に達します。この図は、接種後7週目における3つの共生表現型の例を示しています。異なるsmetaストリームを接種したMTR aula. A 17植物の相対的な共生生産性は、 shoot length（cmおよびm）および shoot fresh weight（g）によって定量化されています。グラフのバー上のアスタリスクは、対応のないT検定において、1 0 2 1 野生型参照株との統計的に有意な差があることを示しています。これらの菌株を接種した植物の根粒数はパネルCに示されています。ピンク色は根粒が機能的であり窒素固定能があることを示し、小さな白い根粒は通常機能せず、褐色の根粒は老化し壊死しています。本図の比較により、XOY ecop親株のホスファターゼ・ガラクトース・ホスホトランスフェラーゼを過剰発現させるP-S-T-B-L-A FFR five XOYプラスミドを保持するSML Lavati 1 0 2 1を接種したM trunk aula A 17植物の共生生産性は、野生型S me 1 0 2 1および陰性対照プラスミドP-S-T-B-L-A-F-R fiveを保持する菌株よりも高いことが示されました。これらのexo Y過剰発現株は、対照株よりも共生エキソ多糖であるSAGグリカンを多く産生します。発現までに数週間かかる共生表現型の差異を定量化できることは、共生生産性のあらゆる指標において本手法の大きな利点となります。MTR Aula A 17において、Sano Zoia Medicaid株のWSM 4 1 9およびABS sevenは、Smeta 1 0 2 1よりも優れた性能を示しました。sucおよびOグリカンを全く産生しないXO YN fiveヌル変異体を接種した植物は、非接種植物と同等のシュート長および生重量であり、マイクロコスムを解体してシュート生重量を測定する時点で、非効率的な根粒のみを形成していました。また、シュートを除去することも可能です。M trunk atulaの代表的な視野のイメージングについて。この図には、マイクロコスムから取り出した17本の根が示されています。パネルAおよびBは接種後10日目の画像であり、パネルCは接種後14日目の画像です。各画像のバーは100 micronsに対応しています。ここに示されている根は、smeta 1 0 2 1 野生型、egg, C Gus Fusion を保持する smeta 株、および SMC 0 0 9 1 1 Gus Fusion を保持する smeta 株で接種されたものです。パネルCでは、SMC 0 0 9 1 1 Gus fusion を保持する STI 細胞の Gus 染色が見られ、根毛および根の表面に確認できます。この手順を行う際は、常に苗の根が寒天に接触した状態に保つことが重要です。各共生表現型に関連する解剖学的、生理学的、および遺伝子発現の違いを分析するために、切片作成や根粒の染色といったその他の方法、あるいは根および根粒からの全RNA抽出を行うことができます。このビデオを視聴することで、種子の発芽、マイクロコスムの調製、および苗への接種を含む、Mego Tula Sino Rosa Melo共生を観察するための単一植物滅菌マイクロコスムの構築方法について十分に理解できるはずです。

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根粒とマメ科植物の成長のための単一の植物、滅菌マイクロコズム

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