線維芽細胞媒介フィブリンゲル圧縮の観察と定量

本手順の全体的な目的は、フィブリンゲル系における細胞とマトリックスの相互作用が、繊維の再配列およびマトリックスのリモデリング活性に及ぼす影響を観察し、分析することです。これは、まず、環境制御型バイオリアクター内のカバーガラス上に、マイクロビーズを含む三次元フィブリンゲルを重合させることで達成されます。次のステップでは、高濃度の細胞懸濁液を調製し、それを用いて線維芽細胞のクラスターまたはX外植片をゲルの表面に幾何学的なパターンで配置します。

次に、微分干渉コントラスト顕微鏡を用いて、48時間にわたり15分ごとにサンプルのイメージングを行います。最終ステップでは、デジタル画像相関法を用いて、ゲルの異なる領域におけるひずみの形でフィブリンの再編成およびリモデリングの程度を測定します。最終的に、この外植片システムにより、細胞を単純な幾何学的パターンに配置することが可能となり、細胞主導のマトリックスリモデリングと繊維の再配列の根底にあるメカニズムを視覚化し、探索することが容易になります。

この手法を用いることで、空間的・時間的な機械的刺激が細胞挙動にどのような影響を与え、その結果として周囲の組織マトリックスにどのような変化が生じるかといった、メカニカルバイオロジー分野における重要な問いに答えることができます。本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるArabic de Jesusが行います。37 °Cに予熱した生理食塩水にフィブリノゲンを一夜かけて緩やかに溶解させ、33.3 mg/mLのストック溶液を作成します。希望する幾何学的間隔に従って各x外植片（explant）の配置を決定するため、フィルム上にステンシルを準備します。

各ドットの間隔を約1〜2 mmにします。この距離は、外植片間の線維配向を形成させるための理想的な間隔に相当します。次に、バイオリアクターのすべての構成部品を70% ethanolで十分に洗浄し、洗浄した部品を組織培養フードのUV照射下で、操作開始の2〜3時間前に置いておきます。

バイオリアクターの構成部品を滅菌した後、サンプルを調製する60 millimeter直径のカバーガラスの領域の下に、テープを用いてステンシルを貼り付けます。次に、マイクロビーズ懸濁液を調製し、続いてフィブリノゲンとトロンビンを調製します。ストック溶液は、0.017 millilitersのマイクロビーズストック溶液と0.149 millilitersのDMEMをマイクロ遠心チューブに合わせ、1 milliliterあたり10 million個のビーズという濃度にします。

次に、懸濁液を10分間超音波処理して、ビーズを分散させ溶液を均質化します。15 mL centrifuge tubeに、0.22 mLのフィブリノゲンストック溶液、0.44 mLの20 mM HEPES緩衝液、および0.1667 mLのマイクロビーズ溶液を加えます。各成分を静かに混ぜ合わせ、その後、別の15 mL centrifuge tubeに入れて氷上に置きます。

25 units/mLの生理食塩水に溶解したトロンビン32.8 µL、20 mM HEPES緩衝液131 µL、および2 M 塩化カルシウム2.46 µLを混合します。

次に、準備したトロンビン溶液とフィブリノゲン溶液を、ピペッティングで5〜10回上下に混ぜ、溶液が均一に分散するように慎重に混合します。混合時にピペットの中身を完全に出し切らないようにし、混合液への気泡の混入を最小限に抑えてください。混合した溶液を速やかにカバーガラス上の8 mm四方のPDMSモールドにピペッティングし、室温でゲルの重合が行われるようにします。

トロンビンの添加により、重合後約30秒で溶液が速やかにゲル化します。バイオリアクターを密閉し、細胞外植えを準備します。T 75フラスコを用いて、70〜90%コンフルエントまで到達したヒト皮膚線維芽細胞をトリプシンで回収し、200 ×gで5分間遠心分離します。バイオリアクターをバイオセーフティキャビネットに移し、無菌条件下で慎重に蓋を取り除きます。その後、培地を吸引し、細胞ペレットを10% FBS含有DMEMを用いて最終濃度20 million cells/mLになるように再懸濁します。

次に、マイクロピペットに細胞を吸い込み、重合したフィブリンゲルに細胞懸濁液を 0.3 µL 注入してエクスプラントを作成します。ステンシルのパターンに従い、各エクスプラントに約 6,000 個の細胞が含まれるようにします。ゲル上にエクスプラントを配置し終えたら、バイオリアクターを密封します。

次に、ヒーティングブロックを挿入し、熱電対を温度コントローラーに接続します。温度コントローラーを37 °Cに設定し、細胞が沈降してフィブリンマトリックスに接着するように、ゲルを1時間インキュベートします。その後、5% CO₂条件下で2〜3時間コンディショニングし、10% 胎児ウシ血清、1% ペニシリン・ストレプトマイシン、0.1% アムホテリシンB、および 10 µg/mL アプロチニンを添加したDMEMを約5 mL、バイオリアクターチャンバーに直接注入します。

その後、バイオリアクターを再封印します。シリンジを用いて、二酸化炭素条件下で調整した培地をさらに5 mL、入口ポートのバーブ継手から注入し、バイオリアクターを完全に満たします。この際、気泡が形成されないよう注意深く操作してください。次に、さらに5%の二酸化炭素条件下で調整した培地を満たした10 mLまたは30 mLのシリンジを使い、シリンジポンプをセットアップします。ルアーロック付きの滅菌チューブを用いて、シリンジをバイオリアクター蓋の入口ポートに直接接続します。

シリンジポンプの灌流速度を0.01 milliliters per minuteに設定します。次に、改造したチューブを両方の出口ポートに接続し、その端を100 milliliterのビーカーに入れます。廃液を回収するため、ラボジャックを用いて入口と出口フィードの高さを調整し、バイオリアクターの供給系に圧力差が生じないようにします。

実験期間中、5%二酸化炭素条件下で調製した新鮮な培地をバイオリアクターに供給します。pHの維持、栄養素の供給、および代謝廃棄物の除去を行うため、培地を満たした10 milliliterのシリンジ1本で約16時間分となります。20 XDIC対物レンズを顕微鏡のビューポートの下に配置し、偏光板、検光子、およびプリズムがすべて正しく設置されていることを確認してください。

次に、イメージングソフトを開きます。対物レンズを3つのx explanの間の領域に合わせ、この位置のX、Y、Z座標をイメージングソフトに保存します。x explanの間および周囲の全領域を撮影するために、大視野画像（large image）の取得オプションを選択し、領域のサイズを指定します。

これにより、指定領域周辺の複数の画像を撮影して大きなタイル状の画像を作成することが可能になります。光強度と露光時間は可能な限り低い値に設定してください。これにより、細胞、マイクロビーズ、およびフィブリン線維を識別するのに十分な解像度を維持しつつ、光毒性による細胞死を回避することができます。なお、本実験では、ゲル内の光散乱ビーズの密度が高いため、フィブリン線維は観察できません。フィブリン線維を観察するには、ビーズの密度またはゲルの厚さを下げてください。

次に、歪みの追跡を開始します。まず、カスタムのMATLABコードを作成またはダウンロードし、その後、ゲルの全体に分散したマイクロビーズを基準点として画像レジストレーションを行います。画像レジストレーションを行うことで、毎回正確に同じ位置で画像が取得されるようになります。

タイリング画像を15分ごとに撮影することで、エクスプラン間における繊維の再配向を観察しました。48時間にわたって、タイリング画像から個別の領域を抽出し、ストレイン追跡アルゴリズムを用いて解析しました。マイクロビーズの変位から局所的なストレインを測定するため、ストラップに対応する繊維再配向領域における最大主ストレインの分布を等高線図で示します。

この手法に習熟すれば、適切に実施した場合、約3〜4時間で完了させることができます。本手順に続き、コラーゲンや細胞骨格タンパク質の蛍光標識、および細胞遊走の定量化などの他の手法を組み合わせることで、組織リモデリングにどのようなメカノバイオロジー経路が関与しているか、また、これらのプロセスがさまざまな生化学的物質によってどのように調節されているかといった、さらなる疑問を解明することが可能です。