Name: 変形性関節症におけるプログラの保護的役割を調査するためにマウスの外科的誘発モデルの確立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-25T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学ぶマウスの内側半月板不安定化手術による変形性関節症モデル構築法。組織病理学的解析とMANKINスコアを用いてプログラニンの保護的役割を評価し、関節破壊メカニズムを解明する。

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この作品はR01AR062207、R01AR061484、R56AI100901、K01AR053210、そして病気が（CJ劉へ）リウマチ研究財団から研究助成を狙っNIHの研究助成金によって部分的にサポートされていました。

動物に関連する手術手順のすべては、手術による痛みや不快感を極力配慮の努力で、地元の機関の動物管理倫理委員会の承認を得なければならない。 1。準備<ol><li>手術のため、約25グラムの体重で8〜12週齢のオスのC57BL / 6マウスを選択します。 </li><li>キシラジン（5 mg / kgの）およびケタミン（40 mg / kg）の両方を含むカクテルの腹腔内注射により動物に麻酔。 </li><li>カミソリで膝を剃るし、外科的に動物をドレープし、ベータダイン及びアルコール（3×）で手術部位を消毒し、軟膏でマウスの眼をカバーしています。 </li></ol> 2。外科的プロセス<ol><li>膝関節を露出させ1センチメートル縦内側パラ膝蓋骨切開する。 </li><li>膝蓋骨の横方向の脱臼と膝蓋靱帯を通してゆっくりと膝関節を開きます。 <ol><li>縦方向に膝関節包をカットステップ2.1の内側パラ膝蓋骨切開により。 </li><li>ピンセットで膝関節包を解剖。 </li><li>左手で後肢の先端部をつかみ、そしてピンセットで膝蓋骨と膝蓋靭帯の横方向の転位を行う。優しく後肢を持って、足に外傷を避けるようにしてください。関節包を切開し、より良い、より少ない力が転位を行うために必要とされる。 </li></ol></li><li>軟骨表面の乾燥を避けるために、動作中の関節軟骨の表面に滅菌生理食塩水を滴下する。 </li><li>脛骨プラトーに内側半月板を固定する内側meniscotibial靭帯を切断。内側半月の下に軟骨を痛めないようにしてください。 <ol><li>大腿骨の内側顆と脛骨の内側高原の間に位置内側半月板を特定します。 </li><li>脛骨の顆間隆起と内側半月板の側面を接続meniscotibial靭帯を識別します。 </li><li>こんにちはを開催ND手で軽くPAW、及び第10外科用メスを使用して丁寧に内側meniscotibial靭帯を切断。関節軟骨や他の靭帯にけがの原因にならないことを確認してください。多くの場合、被覆脂肪パッド側に引っ張られる必要がなく、靭帯を同定するために除去されるべきではない。 </li></ol></li><li> 6-0吸収性縫合糸で膝関節包を閉じます。 </li><li> 6-0絹縫合糸で皮膚を閉じます。 </li></ol> 3。術後ケア<ol><li>術後の痛みを最小限に抑えるために、各マウスの手術部位に0.25％ブピバカインの一滴を適用する。 </li><li>水や食料を得るために自由に操作したマウスを残す。 </li></ol> 4。外科DMMモデルの組織学的スコアリング<ol><li>示された時点で、マウスを生け贄に捧げる手術後（ 例えば 4週間、8週間、12週間。ここでは、代表として8週間の結果を示した）。 </li><li>全体膝関節は、脱灰​​し、embe固定されているパラフィンでddedしてから5ミクロン間隔で連続的に切断した。 <ol><li>第10ブレードを全体後肢を切った。 </li><li>慎重に後肢の皮膚や筋肉を解剖し、RTに3日間、4％PFAでサンプルを固定します。 </li><li> PFAを外し、水でサンプルを清掃してください。その後、2週間、4℃で、EDTAのサンプルを脱灰。 </li><li>エタノール勾配でサンプルを脱水する。具体的には、エタノールを変更するO / Nの70％エタノールの新しいセット内のサンプルを維持、1時間70％エタノール中でサンプルを保つその後、結果として80％および90％エタノールに試料を入れて、O / Nを100％エタノール、続いて、それぞれ、1時間に残し</li><li>エタノールを除去。 1時間o-キシレン中のサンプルを保持し、o-キシレンの新しいセットに変更します。このステップ3回繰り返します。 </li><li>ライカ埋め込むセンターを使用してパラフィン型の中にサンプルを埋め込む。その後、試料を回転式ミクロトーム（ライカRM225を使用して5μmに区画され、5、ドイツ）、次いでガラススライド上に集めた。 </li><li>シリアル矢状セクションは内側顆の中心に外側顆の中心から領域に及ぶ各サンプルのために切断されています。 </li></ol></li><li>サフラニンO染色は、以前に行わ25記載のようにOARSI採点システムを介して採点し、統計分析が続く。 <ol><li>まず、o-キシレン中でスライドを脱パラフィンし、蒸留水に対するエタノールの勾配でそれらを水和する。その後、スライドをワイゲルト鉄ヘマトキシリン​​溶液、0.05％ファストグリーン（FCF）溶液、1％酢酸溶液、および0.1％サフラニンO溶液を介して染色する。樹脂製のメディアを使用してスライドをマウントします。 </li><li>組織学的スコアの統計分析を行う、軟骨と軟骨構造の破壊の割合のプロテオグリカン（赤色）の損失に基づいてサフラニンO染色スライドのスコア。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

私たちはここに、我々は利害関係のないことを宣言します。

これは、マウスの異なる株はC57BL6、129/SvInJ、その後FVB続く、129/SvEv株では最高レベルで、DMMの後にOAの重症度を変化させてきたようにマウスの系統は、DMMモデルの誘導のために非常に重要であることが報告されている/ N 26。 DMMに比較的影響を受けやすい我々は本研究で使用したマウス、 - 導入遺伝子の大部分は、PGRN - /などのC57BL6マウスで確立されている。導入遺伝子は、このようなFVB / Nマウスのような小文字を区別しない株に基づいている場合は、それは、DMM誘導前の感受性株で、これらのマウスを戻し交配することが必要である。研究は既に雌マウスは、雄マウス27よりも感度が低いことが示されているように、DMMの誘導のために使用したマウスの性別も非常に重要です。また、DMMの動作のためのマウスの年齢はまた、OAの病因に重要な役割を果たしている文献29に基づいて、12週齢の古い8週間ごとに異なります。したがって、同じ年齢のマウスは、この影響を排除するために操作すべき。術後疼痛管理、手術後のマウスの動きを向上させるために必要とされる。...

また、変形性関節症として知られている変形性関節症（OA）は、世界の人口の15％、米国内4600万人以上の人々に影響を与え、滑膜炎、軟骨の変性、および骨棘形成1によって特徴づけられる。それは、遺伝的な代謝、生体力学的および生化学的要因の複雑な相互作用の結果であり得る。 OAの基礎となるメカニズムは、科学界を回避し続けています。 2,3 OAの病因を模倣することができる多数の動物モデルが現在存在する。それがために、様々な遺伝子改変マウスの可用性および実験の費用対効果の両方のマウスにおいて、動物モデルを確立することが重要である。実験のOAモデルのさまざまな種類の中では、内側半月板（DMM）モデルの外科的に誘発される不安定化は、その良好な再現性やOA開発中に比較的遅く進行の広く受け入れられたOAモデルです。これらの属性の両方を持っているさまざまな治療法や導入遺伝子3-8のOA進行を評価するための鍵となって。しかしながら、外科OAモデルの一貫性は、手術中に様々な要因によって影響され、その結果、外科用マウスモデルの適用が制限される。 プログラニュリン（PGRN）は、様々な細胞で発現多機能成長因子である。なお、PGRNは、創傷治癒9、10腫瘍形成、および炎症11-15のような種々の生理学的および疾患プロセスにおいて重要な役割を果たすことが知られている。研究はまた、PGRNの不足は、ヒトおよびマウスの両方において16-18神経系の変性疾患を引き起こす可能性があることを示す。なお、PGRNは、ヒト関節軟骨において発現されることが知られており、そのレベルは有意にOA 19および慢性関節リウマチを有する患者の軟骨において上昇する。さらに、PGRNも軟骨細胞増殖20、分化および軟骨性に重要な役割を果たしている開発21,22の間の成長板の骨化。最近では、PGRNは、TNF受容体への結合を介して、TNF-α拮抗し、炎症性関節炎モデル13,14,23,24において抗炎症機能を示すことを報告した。しかしながら、OAにおけるPGRNの役割は、特にインビボで 、謎のままである。ここで、我々は、外科DMMモデルを誘導するための手順を提示し、WTおよびPGRN - / DMMでモデルを構築を通してOA開発におけるPGRNの役割を調査 - マウス。

<table><tbody><tr><td>No. 10 サージカルブレード</td><td>フェザー</td><td>25-2976#10</td><td></td></tr><tr><td>6-0 縫合</td>糸 <td>Applied Dental</td><td>WG-N53133</td><td></td></tr></tbody></table>

変形性関節症におけるプログラの保護的役割を調査するためにマウスの外科的誘発モデルの確立

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

内側半月（DMM）モデルの不安定化は、 生体内での変形性関節症（OA）の発症に非常に多くの関節炎に関連する分子の病態生理学的役割を研究するための重要なツールです。しかし、マウスでは、この複雑なモデルを確立するための詳細な、特に可視化プロトコルは、使用できません。 - / - マウスではDMMモデルを誘導するためのプロトコルを導入する例として、マウス、およびこの外科的に誘発されたモデルの確立に続いて、OAの発症を比較して、ここに、我々は野生型およびプログラ（PGRN）を利用しました。マウスで実行された操作だけmenisco脛骨靭帯を切って内側半月の不安定化を引き起こし、関節包、またはDMMの操作を、開かれた偽手術、のいずれかであった。変形性関節症の重症度は、組織学的ア ​​ッセイ（ 例えばサフラニンO染色）、OA関連遺伝子の発現、軟骨の細胞外マトリックス分子の分解、および骨棘のフォームを用いて評価したATION。マウス、およびこの外科的に誘導されたモデルでは、より深刻なのOAの表現型につながっPGNR成長因子の損失 - DMM操作が正常に野生型およびPGRN - /の両方でのOA開始および進行を誘導した。

DMMモデルが正常マウスに設立され、PGRNの欠乏は外科的に誘発されるOAの開発を誇張した。 マウス-偽とDMMの操作（ 図1）は 、WTおよびPGRN - /で行った。 8週間運転した後、マウスを屠殺し、サフラニンO染色は、組織学に基づいて、関節炎スコアの統計的分析、続いて、膝関節の切片上で実施した。 図2Aに示すように、同様のベースライン条件（上のパネル）を暗示サフラニンO染色に基づいて、偽手術群の両方の遺伝子型における軟骨の明らかな変性が存在しなかった。マウス（赤い矢印） - 8週間DMM動作（下のパネル）の後に、WT及びPGRN - /の両方でプロテオグリカンおよび軟骨構造の破壊の損失があった。両方のプロテオグリカンおよび軟骨の劣化の損失は、OAの表現型が正常に誘導を示唆している。 indicat列のバーDMM動作を次のイントラグループメンバー間の変動を編しかし、バーは比較的短く、PGRNノックアウトは高いプロテオグリカンの損失および軟骨構造はより厳しく、野生型品種...

我々は、マウスにおける内側半月（DMM）モデル、変形性関節症（OA）研究のための効果的なツールの不安定化のためのプロトコルを記述します。加えて、我々はプログラがOAの病因において保護的な役割を果たしていることを示す、このモデルを用いてprogranulincan誇張のOAの発症および進行の欠乏を示した。

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

本手順の全体的な目的は、マウスにおいてDMMモデルを作成し、DMM手術後の変形性関節症の発症を研究することです。動物の準備後、膝関節を露出させるために、膝蓋骨内側に1 cmの縦方向の切開を加えます。次に、膝関節包を剥離し、膝の内側脱臼を行います。最終ステップは、内側半月板脛骨靭帯を切断し、膝を縫合することである。最終的に、組織病理学的解析を用いて、関節構造の破壊およびプロテオグリカンおよび軟骨の消失、骨関節炎を確認する。重症度は、サフラニンO染色によるMANKINスコアを用いて評価する。一般的に、この手法に不慣れな人は、マウスでの手術実施を実際に見ていない限り、習得に苦労します。本手法の視覚的なデモンストレーションは極めて重要です。詳細な手順の習得は困難であり、現在は顕微鏡下で実施されているため、膝関節のあらゆる構造を明確に認識する必要があります。このモデルを確立するために、体重約25gの8〜12週齢の雄性C 57 black sixマウスを麻酔し、内側側半月板不安定化（DMM）手術の準備をします。次に、膝周囲を除毛した後、眼科用軟膏を眼に塗布します。ベタジンとアルコールで術野を3回滅菌し、手術用ドレープで覆います。膝関節を露出させるため、膝蓋骨内側に1 cmの縦方向の切開を加えて手術を開始します。次に、大腿骨が露出するまで、膝蓋骨内側の切開線から関節包を縦方向に慎重に切開します。続いて、鉗子を用いて切開範囲を広げ、深くすることで、関節包構造を緩めます。片手で後肢の遠位端をそっと掴みます。ピンセットを使用して、膝蓋骨および膝蓋靱帯の外側脱臼を行います。関節包を縦方向に切断していれば、脱臼に大きな力は必要ありません。手術の残りの工程の間、関節軟骨表面が乾燥するのを防ぐため、滅菌生理食塩水を滴下し続けてください。次に、大腿骨の内側顆と脛骨の内側平台の間にある内側半月板を確認します。必要に応じて、半月板脛骨靭帯を覆っている脂肪体（fat pad）を脇に除けて、内側半月板の外側と脛骨の顆間隆起を結んでいる半月板脛骨靭帯を露出させます。片手で後肢を優しく保持してください。10番の外科用メスを用いて、内側半月板脛骨靭帯を慎重に切断し、DMM手術を行います。関節軟骨や他の靭帯を損傷しないように注意してください。次に、6-0 吸収性縫合糸で膝関節包を閉鎖し、6-0 シルク縫合糸で皮膚を縫合します。術後の痛みを最小限に抑えるため、メロキシカムを10 mg/kgの用量で皮下投与し、麻酔が切れた後にマウスをケージに戻します。手術から数週間後、マウスを安楽死させ、10番メスを用いて両後肢を切り出します。次に、後肢から皮膚と筋肉を慎重に剥離し、サンプルを4%パラホルムアルデヒドに浸し、室温で3日間固定します。3日後、パラホルムアルデヒドを除去し、蒸留水で3分間サンプルを洗浄します。その後、4 °CのEDTA中で2週間、サンプルの脱灰を行います。2週間後、エタノール濃度勾配を用いてサンプルを脱水します。最後にエタノールを除去した後、サンプルを3つのLene浴にそれぞれ1時間ずつ浸します。次に、サンプルをパラフィン型に埋没させます。回転式ミクロトームを用いて5 µmの切片を作成し、切片をガラススライド上に回収します。外側顆の中心から内側顆の中心まで連続的に矢状切片を作成し、サフランO染色を行います。まず、スライドをキシレンに3～5分間浸して脱パラフィン処理します。このキシレン浴を2回繰り返します。次に、蒸留水で終わるエタノール段階希釈系列でスライドを親水化します。続いて、Weigert鉄ヘマトキシリン溶液、0.05% fast green溶液、1% 酢酸溶液、および0.1%サフランO溶液に順次浸漬します。その後、樹脂封入剤を用いてスライドを封入します。サフランO染色されたスライドについて、軟骨における赤色プロテオグリカン色の消失度および軟骨構造の破壊率に基づいてスコア判定を行います。次に、O-A-R-S-I組織学的スコアリングシステムを用いて統計解析を行います。これらの画像は、偽手術またはDMM手術から8週間後の野生型およびPG rrnノックアウトマウスにおける、サフラニンO染色を施した膝関節を示しています。偽手術後、どちらの遺伝子型においても軟骨に明らかな変性は認められません。しかし、DMM手術から8週間後、軟骨の赤色消失によりプロテオグリカンが喪失していることが示され、また野生型およびPGRNノックアウトマウスの両方において赤色の矢印で示される軟骨構造の破壊が認められたことから、変形性関節症表現型が正常に誘導されたことが示されました。DMM手術後の野生型マウスとPGRNノックアウトマウスにおける変形性関節症スコアの比較において、ノックアウトマウスで有意に高いスコアが示されており、PGRNの喪失がより深刻な変形性関節症表現型をもたらすことが実証されました。この手法は、正しく行えば10分から15分で完了します。このビデオを視聴することで、大量のサンプルにおけるDMM操作の実施方法について十分に理解できるはずです。

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JoVE Journal

Bioengineering

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タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

学ぶマウスの内側半月板不安定化手術による変形性関節症モデル構築法。組織病理学的解析とMANKINスコアを用いてプログラニンの保護的役割を評価し、関節破壊メカニズムを解明する。

変形性関節症におけるプログラの保護的役割を調査するためにマウスの外科的誘発モデルの確立

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