複屈折およびタッチ呼び起こすエスケープ応答アッセイによる幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋の欠陥の分析

この手順の全体的な目的は、半透明のゼブラフィッシュ幼魚における筋原線維の組織化の程度を評価し、両方の手法において触覚刺激に対する泳行距離を定量化することです。これは、まずゼブラフィッシュを交配させ、次に筋肉構造を評価するためのアッセイの第2段階として生存卵を回収することによって達成されます。コーティングを施し麻酔をかけたゼブラフィッシュ胚を、実体顕微鏡のステージ上の2つの偏光レンズの間に直接配置し、魚の体が側軸方向に向けられ、可能な限り平らに配置されるようにします。

次に、複屈折を可視化し、筋肉の完全性を定量化します。接触誘発逃避アッセイの第2ステップでは、コーティングを施した1匹の幼虫を深いペトリ皿に入れ、実体顕微鏡の視野の中心に配置します。昆虫ピンで尾部に触れることで幼虫に感覚刺激を与え、胚が泳ぐのを止めるか、または視野から泳ぎ出して外に出るまで、動物の反応を撮影します。

最終的に、筋肉の構成と運動反応の差異を定量化することができます。これらの非侵襲的な手法の主な利点は、多数の魚を迅速に解析できること、および同一個体における骨格筋の欠損を数日間にわたってin vivoでモニタリングできることです。偏光レンズの設置方法と、幼魚を適切な向きに配置する視覚的なデモンストレーションは、成功させるために極めて重要です。

これらのアッセイを用いて、交配させた成魚から回収したすべてのクラッチから、生存していない卵を取り除きます。これらは通常、肉眼では白く不透明に見え、顕微鏡下では暗色で乱雑な細胞の集団として観察されます。その後、受精から3〜7日後まで、胚をさらに成長させるためにインキュベーターに戻します。目的の胚が依然として卵膜（corion）内に留まっている場合は、鋭いピンセットを使用して、目的の胚の卵膜を慎重に破り、胚が脱落するように胚を逆さまにします。

コーティングした胚をトリカインで麻酔して正しく配置しやすくし、次に、偏光方向を調整するために回転可能な偏光レンズを解剖顕微鏡に取り付けます。胚が真っ直ぐになったら、顕微鏡ステージ上の上部レンズの直下に2枚目の偏光レンズを配置し、その2枚目のレンズの上に胚を直接置きます。その後、目的の各胚を体の側軸に沿って配置します。

目的の胚が見えている状態で上のレンズを回転させ、2つのレンズの偏光軸が互いに90度となり、背景が完全に暗くなるまで調整します。魚を動かして、可能な限り平らに寝かせます。魚が曲がっている場合、平坦な方向を向いているセグメントのみが偏光を透過し、birefringence（複屈折）を示します。

次に、野生型魚の複屈折表現型を観察します。高度に組織化された骨格筋は強い複屈折を示します。これは、筋原線維に平行な光の屈折率が、これらの構造に垂直な偏光の屈折率よりも高いためです。神経変性性ミオパチーや発達異常を示唆する骨格筋の組織乱れがある魚では、通常、全体的に複屈折の減少が見られます。

筋ジストロフィーの特徴です。通常、正常な筋構造を示す明るい領域の間に、筋変性を表す暗い領域が混在するパッチ状の複屈折パターンを示します。複屈折を定量化するため、偏光下で魚の画像を収集します。

画像をTIFFファイルとして保存します。画像処理ソフトウェアで複屈折画像を開きます。ここに示すようにImageJを使用する場合、まずポリゴン選択ツールを使用して魚の体の周囲に線を引き、測定対象となるゼブラフィッシュ筋肉の領域を設定します。

次に、[Analyze]ドロップダウンメニューから[Set Measurements]を選択し、画像に必要な統計項目を選択します。受精後2〜7日のタッチ誘発逃避行動アッセイを設定するため、[Area Mean Gray Value]、[Min Gray Value]、および[Max Gray Value]のチェックボックスにチェックを入れます。コーティングした目的の魚を、一度に1個の胚ずつ、個別に深いペトリ皿に入れます。

デジタルカメラシステムを搭載した実体顕微鏡の視野の中央に魚を配置し、30 Hz以上のフレームレートで連続撮影を開始します。次に、昆虫ピンを用いて胚の尾に触れ、感覚刺激を与えます。胚が泳ぎ止まるか、または視野の外に泳ぎ出た時点で撮影を終了します。最後に、連続画像を動画ファイルに変換するか、タイムラプス画像の個々のフレームを解析します。

オフライン複屈折は、生存しているゼブラフィッシュ胚における筋原線維組織の状態を明らかにするための効率的な非侵襲的アッセイとして利用できます。受精後5日目の野生型ゼブラフィッシュは、筋フィラメントが規則正しく配列しているため、偏光下で高度に屈折する骨格筋を示します。対照的に、distroglycanまたはdag1遺伝子に病原性変異を持つホモ接合体の同齢胚では、筋肉の変性領域を示す斑状の複屈折が認められます。この斑状のパターンおよび初期発生過程における筋肉変性の急速な進行は、他のジストロフィー魚類モデルと一致しています。

受精後5日目のdystrophic DAG1変異体の複屈折を定量化したところ、野生型の兄弟個体で観察される最大複屈折の27.9 ± 5.3%まで著しく減少していることが明らかになりました。この減少は、受精後3日目のmyopathic mtm1モルフォリノで観察された52.4 ± 5.5%への減少よりも深刻です。筋疾患のゼブラフィッシュモデル（myopathic fish models）では、主要な軸骨格筋に筋原線維の不規則性がしばしば見られるため、野生型と比較して全体的な複屈折の減少を示す傾向がありますが、退行性変化の証拠は見られません。タッチ誘発性の逃避行動を用いることで、骨格筋疾患のゼブラフィッシュモデルが運動機能不全および遊泳困難を示すことを実証できます。

この最初のビデオでは、野生型ゼブラフィッシュにおける接触誘発逃避行動アッセイを示しています。受精後5日目の正常な稚魚が、非常に速く泳ぎ去る様子に注目してください。2番目のビデオでは、受精後1日目の稚魚における接触誘発逃避行動を撮影しました。

受精後5日目の変異体胚において、接触に対する反応が損なわれ、刺激後に視野から脱出できないことに注目してください。その後、ビデオをフレームごとに解析し、触覚刺激に対する反応において、DAG one変異体が野生型コントロールと比較して運動機能が低下していることを確認しました。両方のタイプの胚が一定の時間間隔内で移動できた距離を平均化したところ、DAG one変異体で運動機能の減退が示されました。

これらの手法を習得すれば、短期間に大量の魚に対して実施することが可能であり、これはハイスループットな化学スクリーニングや変異原性スクリーニングを行う際に不可欠です。本手順に続き、免疫組織化学や電子顕微鏡法などのより侵襲的なアプローチを行うことで、骨格筋の欠損を分子レベルおよび構造レベルで調査できます。