Name: 複屈折およびタッチ呼び起こすエスケープ応答アッセイによる幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋の欠陥の分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学ぶ複屈折とタッチ呼び起こすエスケープ応答アッセイを用いて、Danio rerio幼虫の骨格筋組織と運動機能を非侵襲的に評価する方法。筋ジストロフィーなどの神経筋疾患モデリングに有用です。

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複屈折画像の定量化に素晴らしい協力をしてくれたBehzad Moghadaszadehに感謝します。 この研究は、米国筋ジストロフィー協会(MDA201302)と国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所(R01 AR044345)から資金提供を受けたほか、A Foundation Building Strength、Cure CMD、AUism Charitable Foundationからの寛大な支援を受けました。 VAGは、National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin DiseasesのK01 AR062601によってサポートされており、LLSはNational Institute of Neurological Disorders and StrokeのF31 NS081928によってサポートされています。

1. 複屈折による骨格筋構造のin vivo解析
<ol>
	<li>給餌後の午後遅くに、目的のゼブラフィッシュ系統の雄と雌を分離する交尾ケージを準備します。
	<ol>
		<li>女性は大きな下腹部とわずかな青/白の色で区別し、男性は細い体型とピンク/黄色の色調で区別します。</li>
		<li>ペアワイズクロス(1つの男性と1つの女性)の成功は、約50%にすぎません。成功率を上げるには、1匹のオスと2〜3匹のメスを交配させます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>光が入り始めた直後の翌朝にケージディバイダーを取り外し、魚が邪魔されずに産卵できるようにします。</li>
	<li>タンクの底に十分な数の受精卵が産まれたら、ストレーナーを使用して卵を収集します。</li>
	<li>ストレーナーを魚の水ですすいで胚を深いシャーレに移し、親魚を水槽に戻します。胚の皿を28.5°Cのインキュベーターに入れます。</li>
	<li>その日のうちに、または翌朝に生存不能な卵子や破片を片付け、胚をインキュベーターに戻してさらに成長させます。</li>
	<li>胚/幼虫は、受精後3〜7日(dpf)で複屈折を観察するのに適切な年齢に達します。これは、3 dpfより前の結果はコントラストが限られている可能性があるためです。野生型の胚は、受精後48〜60時間(hpf)に絨毛膜から孵化し、その後、体軸が矯正されます。孵化が遅れた野生型または突然変異の胚は、手動のデコレーションが必要になる場合があります。
	<ol>
		<li>鋭い鉗子で絨毛膜にそっと裂け目を作り、胚が落ちるように逆さまにします。</li>
		<li>アッセイを開始する前に、デコレーションされた胚をまっすぐにします。</li>
		<li>胚をトリカイン(魚水中の0.04%)で麻酔して、正しい位置付けを支援します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖顕微鏡には、回転させて偏光の角度を調整できる偏光レンズを取り付けます(図1A)。</li>
	<li>脱角化され、麻酔をかけられた胚を、体の横軸に沿って2番目の偏光レンズの上に直接置きます。.2 番目のレンズは、顕微鏡ステージ上の上部レンズの下に配置する必要があります (図 1B)。複屈折アッセイのどの時点でもプラスチックのシャーレは使用しないでください、プラスチックは屈折光の伝送に適した媒体ではないためです。</li>
	<li>2つのレンズの偏光軸が互いに90°の向きになり、背景が完全に暗くなるまで、目的の胚を視野に入れて上部のレンズを回転させます。</li>
	<li>アッセイの最適な出力は、2つの偏光レンズ間の魚の向きに依存します。魚を動かして、できるだけ平らに横たわっていることを確認します。
	<ol>
		<li>魚が湾曲している場合、この平らな方向のセグメントのみが偏光を通過し、複屈折を示します。このような場合は、平坦な領域での複屈折を測定し、野生型の魚類(例えば、野生型魚と変異魚の両方で体節1〜10)の対応する領域の複屈折を記録します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>魚の複屈折表現型を観察します。
	<ol>
		<li>高度に組織化された骨格筋を持つ野生型の魚は、ミオフィラメントに平行な光の屈折率がこれらの構造に垂直な偏光よりも高いため、明るい複屈折を示します。</li>
		<li>非変性ミオパチーまたは発達障害を示唆する無秩序な骨格筋を持つ魚は、通常、複屈折の全体的な減少を示します。</li>
		<li>筋ジストロフィーに特徴的な骨格筋が乱れた魚は、一般的にパッチ状の複屈折パターンを示し、正常な筋肉構造の明るい領域の中で暗い領域が筋肉の変性を表します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>野生型魚と変異魚の偏光下で、同じ露光設定と倍率で画像を撮影することにより、複屈折を定量化します。画像を.tiffファイルとして保存します。
	<ol>
		<li>ImageJソフトウェア(<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/)で複屈折画像を開きます</a>。</li>
		<li>各画像について、ツールバーの「ポリゴン選択」オプションを使用して体の周りに線を引いて、ゼブラフィッシュの筋肉の領域を選択します。</li>
		<li>「分析」ドロップダウンメニューの下にある「測定値の設定」を使用して、画像に必要な統計を選択します。
		<ol>
			<li>最小選択では、「Area」、「Mean gray value」、および「Min & max gray value」のチェックボックスがオンになっている必要があります。</li>
			<li>最大グレー値 >255 は、ピクセルの彩度を示します。したがって、最大グレー値が 255 未満の画像を使用してください。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>選択した領域で平均強度を正規化し、複屈折画像ごとにこれと同じ定量化手順を繰り返します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. タッチ誘発型エスケープビヘイビアアッセイ
<ol>
	<li>適切なゼブラフィッシュ系統の交配ペアを設定し、上記のステップ1.1-1.5で説明したように胚を採取します。</li>
	<li>受精後2〜7日で、脱乳した胚/幼虫を個々の深部シャーレまたはマルチウェルプレートのチャンバーに入れます。</li>
	<li>一度に1つの胚のみで作業し、胚をSPOT RT3デジタルカメラシステムなどを搭載したニコンSMZ1500実体顕微鏡の視野の中央に配置し、シーケンシャルイメージングを開始します。
	<ol>
		<li>野生型と変異型の両方の魚に同じ頻度のイメージングを使用する必要があります。フレームレートは>30Hzが推奨されますが、これは通常、低速のレートでは野生魚の速い泳ぎを捉えるには不十分です。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>昆虫ピンで尾に触れることで、胚に機械感覚刺激を送り込みます。</li>
	<li>胚が泳ぐのをやめたとき、または視野から泳いだときにイメージングを停止します。</li>
	<li>SPOT 5.1 Advancedソフトウェアを使用して、連続した画像をビデオファイルに変換したり、タイムラプス画像の個々のフレームをオフラインで分析したりできます。同様のソフトウェアパッケージには、Open Lab、NIS Elements、または無料で入手できるImageJ(<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" title="">http://rsbweb.nih.gov/ij/)が含まれます</a>。</li>
	<li>複数の胚で触覚誘発反応を行うことにより、遊泳行動を定量化します。
	<ol>
		<li>これは、ソフトウェアまたはメトリックルーラーを使用して、水泳試合の開始点と終了点をマークし、胚が一定の時間間隔で泳ぐことができる距離を平均化することで達成できます。</li>
		<li>胚が時間の経過とともに触覚刺激に慣れるのを防ぐには、実験の繰り返しごとに新しい胚でアッセイを実施します。野生型で信頼性の高い変異体モデルにおける振る舞いは、再現性が高い傾向があります。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130, 5851-5860 (2003).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum. Mol. Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).</li>
<li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+%CE%B12-deficient+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+myotubularin+function+results+in+T-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5 (2), e1000372(2009).</li>
<li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neb%3A+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis. Model Mech. 5 (3), 389-396 (2012).</li>
<li>Ferrante, M. I., Kiff, R. M., Goulding, D. A., Stemple, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troponin+T+is+essential+for+sarcomere+assembly+in+zebrafish+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Troponin T is essential for sarcomere assembly in zebrafish skeletal muscle.</a> J. Cell Sci. 124 (4), 565-577 (2011).</li>
<li>Hawkins, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ATPase-dependent+chaperoning+activity+of+Hsp90a+regulates+thick+filament+formation+and+integration+during+skeletal+muscle+myofibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The ATPase-dependent chaperoning activity of Hsp90a regulates thick filament formation and integration during skeletal muscle myofibrillogenesis.</a> Development. 135 (6), 1147-1156 (2008).</li>
<li>Barbazuk, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+syntenic+relationship+of+the+zebrafish+and+human+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The syntenic relationship of the zebrafish and human genomes.</a> Genome Res. 10 (9), 1351-1358 (2000).</li>
<li>Schapira, G., Dreyfus, J. C., Joly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+flow+birefringence+of+myosin+as+a+result+of+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changes in the flow birefringence of myosin as a result of muscular atrophy.</a> Nature. 170 (4325), 494-495 (1952).</li>
<li>Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+behavioral+characteristics+of+the+startle+response+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Psychobiol%22%5BJournal%5D)">The development and behavioral characteristics of the startle response in zebrafish.</a> Dev. Psychobiol. 7, 47-60 (1974).</li>
<li>Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mauthner-initiated+startle+response+in+teleost+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Mauthner-initiated startle response in teleost fish.</a> J. Exp. Biol. 66, 65-81 (1977).</li>
<li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+relatively+relaxed+mutants+have+a+ryanodine+receptor+defect%2C+show+slow+swimming+and+provide+a+model+of+multi-minicore+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease.</a> Development. 134 (15), 2771-2781 (2007).</li>
<li>Wallace, G. Q., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+muscle+degeneration%2C+regeneration%2C+and+repair+in+the+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of muscle degeneration, regeneration, and repair in the muscular dystrophies.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 37-57 (2009).</li>
<li>Granato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+controlling+and+mediating+locomotion+behavior+of+the+zebrafish+embryo+and+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva.</a> Development. 123, 399-413 (1996).</li>
<li>Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+birefringence+readily+measures+the+level+of+muscle+damage+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (4), 785-788 (2012).</li>
<li>Low, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM7+is+required+within+zebrafish+sensory+neurons+for+the+activation+of+touch-evoked+escape+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TRPM7 is required within zebrafish sensory neurons for the activation of touch-evoked escape behaviors.</a> J. Neurosci. 31 (32), 11633-11644 (2011).</li>
<li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+identified+motoneurones+and+co-ordination+of+primary+and+secondary+motor+systems+during+zebrafish+swimming%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Function of identified motoneurones and co-ordination of primary and secondary motor systems during zebrafish swimming.</a> J. Physiol. 403, 73-89 (1988).</li>
</ol>

利益相反は宣言されていません。

原発性神経筋障害は、伝統的にジストロフィー性または非ジストロフィー性プロセスとして分類されます。筋ジストロフィーは、筋線維変性とそれに続く再生の繰り返しを特徴とし、最終的には線維症に代表される末期プロセスと脂肪組織による置換につながります14。対照的に、非ジストロフィー性ミオパチーは壊死や再生変化とは関連しませんが、筋線維の乱れと全体的な骨格筋の衰弱を引き起こします。
ゼブラフィッシュモデルは、さまざまな神経筋疾患の分子経路と病因をよりよく理解するための非常に貴重なリソースとして近年浮上しています。迅速な 子宮外 発生、半透明の胚、高い生殖能力、ヒトと密接に関連するゲノムなど、このモデルシステムの一般的な利点に加えて、ゼブラフィッシュ病モデルはしばしばヒトの病気を密接に模倣します。骨格筋に欠陥のある多くのゼブラフィッシュは形態学的異常を持っていますが、一部の変異表現型は肉眼的に正常であり、より詳細な特徴付けが必要です。これらおよびすべてのケースについて、筋肉の損傷と衰弱の程度は、複屈折および接触誘発脱出行動の非侵襲的 in vivo<...

<table><tbody><tr><td>トリカイン</td><td>シグマ</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>0875711Z</td><td></td></tr><tr><td>鉗子フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>100189-588昆虫</td><td></td></tr><tr><td>ピン</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>S67375</td><td></td></tr><tr><td>偏光レンズリッツ</td><td>カメラ</td><td>クォンタレイトライスターオプティクスC-PL72mm</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>フィッシャーScientific</td><td>Isotemp Incubator Model 630D</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ニコンインスツルメンツ</td><td>SMZ 1500</td><td></td></tr><tr><td>カメラ</td><td>診断機器株式会社</td><td>SPOT RT3</td><td></td></tr><tr><td>イメージングソフト</td><td>Diagnostic Instruments Inc.</td><td>SPOT 5.1 詳細</td><td></td></tr></tbody></table>

複屈折およびタッチ呼び起こすエスケープ応答アッセイによる幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋の欠陥の分析

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、哺乳類8のゲノムおよび構造保存が高いため、筋ジストロフィー1-3、先天性ミオパチー4,5、および肉腫集合の混乱6,7を含む骨格筋に影響を与えるヒトの疾患をモデル化するための特に効果的なツールとなっています.筋肉の解体と運動障害は、ゼブラフィッシュでは受精後の最初の数日間で迅速に評価できます。ゼブラフィッシュの骨格筋欠損を特徴付けるのに役立つ2つのアッセイは、複屈折(構造的)と触覚誘発逃避反応(行動的)です。
複屈折は、光が筋肉のサルコメア9の擬似結晶配列などの秩序ある物質を通過するときに回転する物理的特性です。これは、発生の初期段階で半透明のゼブラフィッシュの幼生の筋肉の完全性を評価するためのシンプルで非侵襲的なアプローチです。高度に組織化された骨格筋を持つ野生型ゼブラフィッシュは、2つの偏光フィルターの間で視覚化すると、暗い背景の中で非常に明るく見えますが、筋肉変異体は、モデル化する主要な筋肉障害に固有の複屈折パターンを持っています。筋ジストロフィーをモデル化するゼブラフィッシュは、筋線維の変性とそれに続く再生の繰り返しを特徴とする疾患であり、偏光下で骨格筋に変性した暗い斑点を示します。非ジストロフィー性ミオパチーは、壊死や再生変化とは関連していませんが、筋繊維の乱れや骨格筋の衰弱を引き起こします。ミオパシーゼブラフィッシュは、通常、サルコメアの解体を反映して、複屈折が全体的に減少します。
触覚誘発脱出アッセイは、触覚刺激10-12に応答して胚の遊泳行動を観察することを含みます。野生型の幼虫と比較して、突然変異型の幼虫はしばしば弱い脱出収縮を示し、その後、ゆっくりと泳ぐか、または幼虫を短距離以上推進できない他のタイプの障害運動を示します12。これらのアッセイの利点は、同じ種類の魚類の疾患の進行を数日間in vivoで監視できることと、高等脊椎動物と比較して多数の魚を短時間で分析できることです。

複屈折は、生存しているゼブラフィッシュ胚における筋原線維組織の状態を明らかにするための、効率的かつ非侵襲的なアッセイとして利用できます。野生型ゼブラフィッシュ、および骨格筋の発達と機能に重要な遺伝子の発現が低下したゼブラフィッシュの例を提示します。受精後5日（5 dpf）の野生型ゼブラフィッシュは、筋フィラメントが規則正しく配列しているため、偏光下で非常に強い複屈折を示す骨格筋を呈します（Figures 2A-B）。対照的に、ジストログリカン遺伝子（dag1）に病原性変異を持つホモ接合体の同齢胚では、筋変性領域を示す斑点状の複屈折が見られます（Figures 2C-D）2。この斑点状のパターンおよび初期発生過程における筋変性の急速な進行は、他のジストロフィー魚類モデルと一致しています1,3。5 dpfのジストロフィー性dag1変異体の複屈折を定量化したところ、野生型の兄弟魚に見られる最大複屈折の27.9%±5.3まで輝度が有意に低下していることが分かりました。この低下は、3 dpfのミオパチ...

ゼブラフィッシュは、筋ジストロフィー、先天性ミオパチー、および関連する神経筋疾患をモデル化するための確立された強力なツールとなっています。複屈折と触覚誘発逃走行動は、ゼブラフィッシュ胚の早期発生における筋肉の混乱と運動障害の程度を決定するために使用される2つの一般的な非侵襲的アッセイです。

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

この手順の全体的な目的は、半透明のゼブラフィッシュ幼魚における筋原線維の組織化の程度を評価し、両方の手法において触覚刺激に対する泳行距離を定量化することです。これは、まずゼブラフィッシュを交配させ、次に筋肉構造を評価するためのアッセイの第2段階として生存卵を回収することによって達成されます。コーティングを施し麻酔をかけたゼブラフィッシュ胚を、実体顕微鏡のステージ上の2つの偏光レンズの間に直接配置し、魚の体が側軸方向に向けられ、可能な限り平らに配置されるようにします。次に、複屈折を可視化し、筋肉の完全性を定量化します。接触誘発逃避アッセイの第2ステップでは、コーティングを施した1匹の幼虫を深いペトリ皿に入れ、実体顕微鏡の視野の中心に配置します。昆虫ピンで尾部に触れることで幼虫に感覚刺激を与え、胚が泳ぐのを止めるか、または視野から泳ぎ出して外に出るまで、動物の反応を撮影します。最終的に、筋肉の構成と運動反応の差異を定量化することができます。これらの非侵襲的な手法の主な利点は、多数の魚を迅速に解析できること、および同一個体における骨格筋の欠損を数日間にわたってin vivoでモニタリングできることです。偏光レンズの設置方法と、幼魚を適切な向きに配置する視覚的なデモンストレーションは、成功させるために極めて重要です。これらのアッセイを用いて、交配させた成魚から回収したすべてのクラッチから、生存していない卵を取り除きます。これらは通常、肉眼では白く不透明に見え、顕微鏡下では暗色で乱雑な細胞の集団として観察されます。その後、受精から3〜7日後まで、胚をさらに成長させるためにインキュベーターに戻します。目的の胚が依然として卵膜（corion）内に留まっている場合は、鋭いピンセットを使用して、目的の胚の卵膜を慎重に破り、胚が脱落するように胚を逆さまにします。コーティングした胚をトリカインで麻酔して正しく配置しやすくし、次に、偏光方向を調整するために回転可能な偏光レンズを解剖顕微鏡に取り付けます。胚が真っ直ぐになったら、顕微鏡ステージ上の上部レンズの直下に2枚目の偏光レンズを配置し、その2枚目のレンズの上に胚を直接置きます。その後、目的の各胚を体の側軸に沿って配置します。目的の胚が見えている状態で上のレンズを回転させ、2つのレンズの偏光軸が互いに90度となり、背景が完全に暗くなるまで調整します。魚を動かして、可能な限り平らに寝かせます。魚が曲がっている場合、平坦な方向を向いているセグメントのみが偏光を透過し、birefringence（複屈折）を示します。次に、野生型魚の複屈折表現型を観察します。高度に組織化された骨格筋は強い複屈折を示します。これは、筋原線維に平行な光の屈折率が、これらの構造に垂直な偏光の屈折率よりも高いためです。神経変性性ミオパチーや発達異常を示唆する骨格筋の組織乱れがある魚では、通常、全体的に複屈折の減少が見られます。筋ジストロフィーの特徴です。通常、正常な筋構造を示す明るい領域の間に、筋変性を表す暗い領域が混在するパッチ状の複屈折パターンを示します。複屈折を定量化するため、偏光下で魚の画像を収集します。画像をTIFFファイルとして保存します。画像処理ソフトウェアで複屈折画像を開きます。ここに示すようにImageJを使用する場合、まずポリゴン選択ツールを使用して魚の体の周囲に線を引き、測定対象となるゼブラフィッシュ筋肉の領域を設定します。次に、[Analyze]ドロップダウンメニューから[Set Measurements]を選択し、画像に必要な統計項目を選択します。受精後2〜7日のタッチ誘発逃避行動アッセイを設定するため、[Area Mean Gray Value]、[Min Gray Value]、および[Max Gray Value]のチェックボックスにチェックを入れます。コーティングした目的の魚を、一度に1個の胚ずつ、個別に深いペトリ皿に入れます。デジタルカメラシステムを搭載した実体顕微鏡の視野の中央に魚を配置し、30 Hz以上のフレームレートで連続撮影を開始します。次に、昆虫ピンを用いて胚の尾に触れ、感覚刺激を与えます。胚が泳ぎ止まるか、または視野の外に泳ぎ出た時点で撮影を終了します。最後に、連続画像を動画ファイルに変換するか、タイムラプス画像の個々のフレームを解析します。オフライン複屈折は、生存しているゼブラフィッシュ胚における筋原線維組織の状態を明らかにするための効率的な非侵襲的アッセイとして利用できます。受精後5日目の野生型ゼブラフィッシュは、筋フィラメントが規則正しく配列しているため、偏光下で高度に屈折する骨格筋を示します。対照的に、distroglycanまたはdag1遺伝子に病原性変異を持つホモ接合体の同齢胚では、筋肉の変性領域を示す斑状の複屈折が認められます。この斑状のパターンおよび初期発生過程における筋肉変性の急速な進行は、他のジストロフィー魚類モデルと一致しています。受精後5日目のdystrophic DAG1変異体の複屈折を定量化したところ、野生型の兄弟個体で観察される最大複屈折の27.9 ± 5.3%まで著しく減少していることが明らかになりました。この減少は、受精後3日目のmyopathic mtm1モルフォリノで観察された52.4 ± 5.5%への減少よりも深刻です。筋疾患のゼブラフィッシュモデル（myopathic fish models）では、主要な軸骨格筋に筋原線維の不規則性がしばしば見られるため、野生型と比較して全体的な複屈折の減少を示す傾向がありますが、退行性変化の証拠は見られません。タッチ誘発性の逃避行動を用いることで、骨格筋疾患のゼブラフィッシュモデルが運動機能不全および遊泳困難を示すことを実証できます。この最初のビデオでは、野生型ゼブラフィッシュにおける接触誘発逃避行動アッセイを示しています。受精後5日目の正常な稚魚が、非常に速く泳ぎ去る様子に注目してください。2番目のビデオでは、受精後1日目の稚魚における接触誘発逃避行動を撮影しました。受精後5日目の変異体胚において、接触に対する反応が損なわれ、刺激後に視野から脱出できないことに注目してください。その後、ビデオをフレームごとに解析し、触覚刺激に対する反応において、DAG one変異体が野生型コントロールと比較して運動機能が低下していることを確認しました。両方のタイプの胚が一定の時間間隔内で移動できた距離を平均化したところ、DAG one変異体で運動機能の減退が示されました。これらの手法を習得すれば、短期間に大量の魚に対して実施することが可能であり、これはハイスループットな化学スクリーニングや変異原性スクリーニングを行う際に不可欠です。本手順に続き、免疫組織化学や電子顕微鏡法などのより侵襲的なアプローチを行うことで、骨格筋の欠損を分子レベルおよび構造レベルで調査できます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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この研究では、ゼブラフィッシュの幼生に対してEvans Blue Dye(EBD)分析を行う簡単な方法について説明します。...

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ゼブラフィッシュで筋肉のパフォーマンスと機能を評価するためにタッチ誘発応答と歩行アッセイを使用して

てんかんのゼブラフィッシュモデルにおける行動と生理学的解析

骨格筋再生は、筋ジストロフィーなどの多くの筋疾患で障害を受ける組織常駐筋幹細胞によって駆動され、筋肉が再生できないことが生じる。ここでは、筋疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋再生の検討を可能にするプロトコルについて述べる。...

ゼブラフィッシュモデルの筋肉再生を調べる

微小循環の観察のための新たな汎用性の高い方法が提示される。それは長期的な観察のため、およびpharmacophysiologicalまたは分子生物学的介入との組み合わせに適して考えられている。...

イントラ不可欠な顕微鏡による骨格筋のin vivo微小循環測定における

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複屈折およびタッチ呼び起こすエスケープ応答アッセイによる幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋の欠陥の分析

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