として脳微小血管内皮細胞（CEND）でストレッチ

本手順の全体的な目的は、外傷性脳損傷のモデルとしてストレッチ損傷を用いる方法を示すことです。まず、柔軟な底面を持つウェルで鏡像微小血管内皮細胞を培養します。次に、培地中の胎児牛血清の濃度を低減させることで、細胞を分化させます。

次に、セルストレッチャー装置を用いて細胞に損傷を与えます。最後のステップは、細胞の損傷度を評価することです。最終的に、脳内皮細胞における伸展誘発性損傷を用いることで、in vitroでの血液脳関門の損傷を提示します。

本手法の意義は、海洋生物の脳内皮細胞を用いた伸展損傷により、外傷性脳損傷（TBI）時に血液脳関門で実際に起こる衝撃をモデル化できるため、TBIの治療への応用が期待される点にあります。この手順の実演は、私の研究室のポストドクターであるElaine Salvador博士が行います。まず、T 75培養フラスコで海洋生物の脳微小血管内皮細胞を培養することから始めてください。

コンフルエンスに達するまで、週に2回培地を交換します。次に、PBSで細胞を洗浄します。その後、PBSとトリプシンを除去します。

2 mLの温めたtrypsin EDTA溶液で細胞を処理します。37 °Cで5分間、または細胞層が分散するまでインキュベートします。その後、8 mLの培地を細胞に加え、フラスコを数回タッピングして細胞を剥離させます。

顕微鏡下で細胞を確認し、フラスコから完全に剥離していることを確かめます。次に、剥離した細胞を含む培地をピペッティングします。その後、フラスコを回転させて細胞懸濁液を混合してください。

細胞懸濁液 20 µL をヘモサイトメーターに注入し、細胞数を計測します。細胞密度を算出し、ウェルあたり 20,000 cells/cm² となるように調整します。次に、細胞懸濁液をコラーゲンに転移させます。

6ウェルのコーティング済み柔軟底培養プレートに、1ウェルあたり合計3 mLの培地を分注します。培養液を週2回交換し、細胞がコンフルエントになるまで37 °Cで1週間培養します。

細胞分化のため、細胞の培地を分化培地に変更し、37 °Cで24時間インキュベートします。この手順において、細胞損傷コントローラー装置の電源を入れ、ディレイを50 millisecondsに設定します。次に、レギュレーター圧力を15 PSIに設定し、登録されたピーク圧力が安定するまでトリガーを数回押します。

次に、レギュレーターの圧力を希望の値に設定します。その後、6ウェルフレキシブルボトム培養プレートをトレイホルダーに設置します。ウェルセレクターが正しいウェルサイズに設定されていることを確認してください。

次に、アダプタープラグをしっかりと装着させ、片手でプラグを固定したまま、もう一方の手でトリガーを押し、その後にかかったピーク圧力を記録します。直ちにプレートを37 °Cのインキュベーターに戻して所定の時間静置するか、または、DI取り込みアッセイによる伸展傷害を評価するための後続の実験や評価にすぐに使用してください。細胞を伸展させた直後、細胞毒性マーカーとして機能する1 mg/mLの生存率染色剤を30 µL、細胞培養培地に添加します。

乳酸脱水素酵素（LDH）の放出により伸展傷害を評価します。伸展後、直ちに細胞培養培地を200 µL除去します。LDH放出の調査に含めたい損傷後のすべてのタイムポイントにおいて同様の操作を行います。次に、マイクロ遠心分離機の最高設定で細胞培養培地を5分間遠心分離します。

細胞残渣を除去するために、上清を回収し、これを後続のステップに使用します。さまざまなタイムポイントから必要なサンプルを採取した後、LDHアッセイキットに含まれる溶解液を用いて細胞を溶解させます。その後、キットに付属の96ウェルプレートの各ウェルに、アッセイキットに含まれるアッセイ培地を100 µLずつ加えます。

次に、細胞を含まない細胞培養液 100 µL を96ウェルプレートの2つのパラレルウェルに添加し、プレートを37 °Cで30分間インキュベートした後、492 nmで吸光度を測定します。ここでは、正常細胞と損傷細胞の光学顕微鏡による観察結果を示します。

通常の伸展していないコンフルエントな細胞単層は、密に詰まって伸長していますが、1.8から2.0 PSIのピーク圧力パルスを印加して細胞を伸展させると、凝集度が低くなります。2.5から3.0のピーク圧力パルスによって中程度の損傷を受けた細胞では、一部の細胞に腫脹や変形が見られます。3.5から4.5 PSIの激しい伸展が加わると、細胞は収縮します。

ここでは、正常細胞と損傷細胞の蛍光顕微鏡観察結果を示します。細胞は損傷から2時間後に生存率染色で処理されました。これらは、対照群である非伸展細胞、中程度の伸展を加えた細胞、および高度な伸展を加えた細胞です。

この図は、ストレッチ傷害後に培養液中へ放出されたLDH酵素量を示しています。ストレッチ誘導傷害後のさまざまな時間間隔で培養液中のLDH放出量を測定し、低強度および中強度のストレッチを加えた細胞から放出可能な総LDH量に対する割合（％）として算出しました。これらは、ストレッチを加えていない対照群および相互間で有意な差は見られませんでした。

激しく伸展させた細胞は、伸展後1時間の適度に伸展させたサンプルを除くすべてのサンプルと比較して、有意に多量のLDHを放出した。この手法は、神経生物学分野の研究者が、海洋脳血管内皮細胞を用いて外傷性脳損傷をin vitroで探索するための道を開いた。