キイロショウジョウバエの発生は、分子、細胞、遺伝的基盤の大部分がヒトのような高等真核生物と共通しており、ショウジョウバエは非常に重要なモデル生物となっています。ショウジョウバエの生活環と呼ばれるプロセスはいくつかの発生段階に分かれており、各ステージがそれぞれ発生研究に利用されています。このビデオでは、生活環の各ステージの説明と共に、身体的特徴やそれぞれの段階で起こるイベントについて説明しています。次に、ハエのボディプランを確立し、各組織、器官形成のために重要とされるパターン形成遺伝子調節について説明しています。それに加え、ショウジョウバエの生殖、遺伝的交雑のセットアップ方法も紹介しています。最後に、ショウジョウバエの発生と生殖の原理をどう研究に応用可能かご覧いただけます。ここでは、RNA干渉、求愛などの行動解析、動的プロセスを追跡可能なライブイメージングを用いた発生研究をご覧いただけます。このビデオでは、ショウジョウバエの発生、生殖を理解することの重要性、そしてこの知識をどう他の生物の発生の理解に応用できるのかを学んでいただくことを目的としています。
キイロショウジョウバエは発生と生殖の研究に広く使われているモデル生物です。 ショウジョウバエは生活環でいくつかの発生段階を経て成長し、発生研究する上で、各段階それぞれが特有の研究材料になります。 このビデオでは、ショウジョウバエの発生と遺伝的交雑を含む生殖の基本、そして創傷治癒から行動に至る様々な研究への応用について見ていきましょう。
まずは、ショウジョウバエの生活環について学んでみましょう。 ショウジョウバエの発生は、4段階から成り、胚期、幼虫期、蛹期、成虫期があります。
胚は、大きさ約0.5mm、形は楕円型です。 胚は受精後、大きくなることなく直ちに有糸分裂を開始します。 接合体の核は9回分裂を行います。 しかし細胞質分裂はせず、シンシチウム胚盤葉と呼ばれる多核細胞を形成します。 シンシチウム胚盤葉内のすべての核が同じ細胞質を共有するため、タンパク質は自由に拡散できます。 そしてモルフォゲン勾配をつくります。 これは体の設計やそれぞれの器官、組織形成に重要となります。 10回の 細胞核分裂を終えると、核はシンシチウム胚盤葉の周囲に移動します。 受精後約3時間で13回目の核分裂が起き、シンチウム胚盤葉内の6000個の核がそれぞれ細胞性胚盤葉を作り始めます。 細胞性胚盤葉は単層で構成されていますが、原腸胚形成と呼ばれる過程で、複雑多層へと変わります。 原腸胚形成期、細胞形状の変化により単層の陥入が起こり、最終的に内胚葉、中胚葉、外胚葉が形成されます。 内胚葉は消化管、中胚葉は筋肉や心臓、外胚葉は表皮や中枢神経系ニューロンへと分化します。 24時間後には、胚から幼虫がふ化します。
幼虫は白くて蠕虫(ぜんちゅう)様体節もっています。 湿ったエサの周辺をはい、絶えず食べ続けるため、急成長します。 幼虫期には生まれて24時間までの1齢幼虫、次の24時間の2齢幼虫、更に次の48時間の3齢幼虫の3段階があります。 どの段階でも脱皮を行います。 蛹化の準備ができたら、3齢幼虫はエサから離れバイアルの側面のような硬い場所にくっつきます。
さなぎは動かず、初めは柔らかく白色、最終的には硬く、茶色になります。 4日をかけて、幼虫組織は退化し、成虫組織が出来上がります。 羽化は蛹期の終わりを示し、成虫となったハエが現れます。
羽化の8時間後、成虫は交尾をし始めます。 そしてまた新たな生活環に入ります。
25℃の環境下では10日で生活環が完了します。 これは温度依存的であり、18℃では約19日と長く、29℃ではたったの7日です。
発生の間ずっと、入念なパターン形成遺伝子調節により、ボディプランが確立され、それぞれの組織、器官が特定されます。 ここで重要なのは、器官の頭節から尾節までの位置情報を決定する前後軸の確立が、いくつかの遺伝子群により調節されているということです。
まずメスの母性効果遺伝子が、卵母細胞に与えられ、受け継がれます。 シンシチウム胚盤葉内での初期胚の前後軸の形成に重要な役割を果たします。 具体的には、 bicoid(ビコイド)遺伝子が頭部と胸部を含む前部を、 nanos(ナノス)遺伝子が腹部を含む後部を決定します。
次は、母性効果因子によって調節される分節遺伝子についてです。 ギャップ遺伝子とペアルール遺伝子があります。 ギャップ遺伝子は、胚を大まかに分割し、前後軸に沿って分節化ボディプランを確立します。 ペアルール遺伝子は、前後軸と垂直に縞模様を発生し、さらに胚を細かく分節化します。 その後、engrailedのようなセグメントポラリティ遺伝子が、それぞれの分節内の細胞の運命を決定づけます。
最後に、ホメオティック遺伝子が、羽や足などの解剖学的構造を特定化していきます。 興味深いことに、染色体上の遺伝子の順番が、前後軸に沿って形成していくときに重要になってきます。
ショウジョウバエは非常に生殖能力の高い生物で、生涯で何千もの子孫を残します。 メスは一日に何百もの卵を産み、交配により常に受精卵を持ち続けることができます。
また、ショウジョウバエは性的二形をもつ生物で、性別によって個体の形質が異なります。 具体的には、オスはメスに比べ小さく、下腹部と同じ暗黒色の外性器を持っています。 また、前脚には交配の際にメスにしがみつくためのセックスコームと呼ばれる毛の斑点があります。 これら性差によりメスとオスを簡単に見分けることができ、特に遺伝的交雑のセットアップに便利です。
遺伝的交雑は、遺伝子学研究に有益なテクニックです。 さあ見ていきましょう。
まずは、必要なジェノタイプを持つ処女雌を集め、交配をコントロールします。 ショウジョウバエは、羽化後最初の8時間は交配ができないため、成虫になったばかりの処女雌を集めることができます。 羽化したばかりのメスを収集するためには、まずすべての成虫を処分し、バイアルをきれいにする必要があります。 3、4時間おきに新たに羽化した成虫をチェックし、メスだけを新しいバイアルに集めます。 処女雌の体はとても明るい色をしており、腹部に黒い胎便が見えます。
準備が整ったら、 希望の個体群のオス4から6匹と同数の処女雌を 温度25℃、湿度60%の条件下、バイアル内で交配させます。 3、4日経つと、幼虫が出現します。 交配を防ぐため、親は別のバイアルに移します。 約10日後には、その1世代目が遺伝子検査の対象となります。
研究でよく使用される、バランサー染色体は、遺伝子の組み換えが起こらず、カーリーウィング、つまり曲翅(きょくし)の遺伝情報を維持でき、ジェノタイプの正確性を裏付けることができます。 2つの異なる変異を持つハエを作成する場合、バランサー染色体Curlyをもつ突然変異体#1と#2を交配させます。 曲しを持たない子孫が、両方の変異をもつヘテロ接合体であることが分かります。
他にUAS-GAL4 systemを用いた、組織特異的な遺伝子発現誘導やノックダウンを実施する方法があります。 GAL4は酵母転写因子であり、組織特異的プロモーターにより制御されます。 UASは上流にある活性化配列で、目的遺伝子の発現を制御します。 組織特異的GAL4導入遺伝子をもつハエと、目的遺伝子を下流に含むUAS導入遺伝子をもつハエを掛け合わせると、GAL4タンパクとUASが結合し、目的の遺伝子を発現させることができます。 例えば、UAS-GFPと、さなぎの羽原基特異性apterous-GAL4を掛け合わせると、それらの細胞でGFPがはっきりと発現します。
ショウジョウバエの発生と生殖の研究は様々な場所で応用できます。 一つ目は、求愛などの行動解析です。 求愛行動では、オスがメスに寄って行き、自分の前脚をメスに くっつけてタッピングしながら、後ろについて回ります。 もしメスが受け入れるのなら、オスにマウントさせます。オスは腹部を曲げ丸くなり、精液をメスに注入します。 突然変異体の求愛行動解析により 遺伝子制御について洞察することができます。
ショウジョウバエの発生は、たくさんの細胞運動や形態変化を含む非常に動的なプロセスであり、ライブイメージングを使って研究されます。 例えば、胚発生時の背部が閉塞していく過程では多くの細胞が関わり合って、まるでジッパーを閉めるようにふさがります。 発生時の胚部閉鎖は、創傷閉鎖の臨床研究モデルとして利用されています。
3つ目に、ショウジョウバエ発生プロセスを理解するために利用されるのが、RNA干渉を用いた遺伝子ノックダウン法で、逆遺伝子スクリーニングにも利用されます。 例えば、二本鎖RNAを胚に注入することで、器官発生をノックダウンする遺伝子が導入できます。 ここでは、RNA干渉により、気管形成時の融合に重要な遺伝子を特定しました。
JoVEキイロショウジョウバエの発生と生殖導入編をご覧いただきありがとうございました。 今回は、ショウジョウバエの各発生段階の特徴を含む生活環、生殖能力の遺伝子学や遺伝交配の研究への応用法、そして、行動、創傷閉鎖、器官発生など複雑なプロセスの解明のためにショウジョウバエの発生、生殖がいかに有益であるかということを学びました。
Drosophila melanogaster, are widely used as a model organism in the study development and reproduction. Drosophila progress through several developmental stages in a process known as the life cycle and each stage provides a unique platform for developmental research. In this video, we will present the basics of Drosophila development and reproduction, including how to set up a genetic cross and discuss how this research can be applied to understand processes ranging from wound healing to behavior.
First, let’s discuss the Drosophila life cycle. Drosophila progress through 4 main stages of development: embryo, larva, pupa, and adult.
The embryo is a fertilized egg that is about 0.5 mm long and oval shaped. Immediately after fertilization, the embryo undergoes rapid mitotic division without growth. The zygotic nucleus undergoes nine rounds of nuclear division, but does not undergo cytokinesis, forming a multi-nucleate cell called a syncytial blastoderm. Since all the nuclei in the syncytial blastoderm share a common cytoplasm, proteins can diffuse freely, forming morphogen gradients, which are important for establishing the body plan and patterning of individual organs and tissues in the fly. After the 10th nuclear division, the nuclei migrate to the periphery of the syncytial blastoderm . Following the 13th round of nuclear division, which occurs approximately 3 hours after fertilization, the 6000 nuclei in the syncytial blastoderm become individualized forming the cellular blastoderm . The cellular blastoderm contains a monolayer of cells and is transformed into a complex multi-layered structure, in a process known as gastrulation. During gastrulation, cell shape changes drive invaginations of the monolayer, ultimately creating the endoderm, mesoderm, and ectoderm germ layers. The endoderm gives rise to the gut, the mesoderm gives rise to the muscles and heart, and the ectoderm gives rise to the epidermis and central nervous system. After 24 hours, embryos hatch as larvae.
Larvae are white with worm-like segmented bodies. They crawl around in wet food eating constantly, leading to rapid growth. Larvae progress through three stages: the first instar for 24 hours, second instar for another 24 hours, and third instar for 48 hours. Molting occurs between each stage. When ready for pupation, third instar larvae leave their food source and attach to a firm surface, such as the side of a vial.
Pupa are immobile and are initially soft and white but eventually harden and turn brown. Over a period of four days, larval tissues degenerate and adult tissues form. Eclosion marks the end of the pupal stage and the flies emerge as adults.
8 hours after eclosion, the adults become sexually receptive and begin to mate, starting the life cycle all over again.
The complete life cycle takes about 10 days at 25 °C, but it can be affected by temperature. For example, at 18 °C the life cycle is about 19 days and at 29 °C, the life cycle is only 7 days.
Throughout development, careful genetic regulation of pattern formation establishes the body plan and specifies individual tissues and organs. Importantly, the establishment of the anterior-posterior axis defines the head to tail orientation of the organism, and is regulated by several groups of genes.
First, maternal effect genes are supplied in the oocyte and inherited from the female. They are important in the syncytial blastoderm for initially establishing the anterior and posterior of the embryo. In particular, the bicoid gene defines the anterior of the embryo including the head and thorax, while the nanos gene defines the posterior, including the abdomen.
Second, the segmentation genes, which are regulated by maternal effect genes, include the gap genes and pair rule genes. Gap genes establish a segmented body plan along the anterior-posterior axis by broadly subdividing the embryo. Pair rule genes are expressed in a striped pattern perpendicular to anterior-posterior axis, further dividing the embryo into smaller segments. Then the segment polarity genes, such as engrailed begin to establish cell fates within each segment.
Lastly, homeotic genes are responsible for defining particular anatomical structures, such as wings and legs. Interestingly, the order of the genes on the chromosome reflect how they are expressed along the anterior-posterior axis.
Drosophila are extremely fertile organisms that can produce thousands of progeny in a lifetime. Females lay hundreds of eggs per day and continue to fertilize eggs well after mating has occurred.
Drosophila are also sexually dimorphic organisms meaning that the females are phenotypically distinct from males. In particular, males are smaller than females and have darkly colored external genitalia, as well as more black pigment on their lower abdomens. Males also have a patch of bristles on their forelegs called sex combs used to latch onto the female during copulation. These distinct phenotypic differences make it very easy to distinguish males from females, which is particularly useful when setting up a genetic cross.
Setting up a cross with Drosophila is a useful technique for studying genetics. So let’s get started!
The first step to setting up a cross is to collect virgin females of the desired genotype, so that you can control exactly which male with whom she will mate. Drosophila are unable to mate during the first 8 hours after eclosion, so collecting very young adults guarantees virginity. To collect newly eclosed females, clear the vial into the morgue to get rid of all adults. Every 3-4 hours, check the vial for newly eclosed adults, and collect the females in a new vial without any males until ready for use. Virgin females are identified by their very light body color and a dark spot on their abdomen, known as the meconium.
When ready to begin the cross, combine 4-6 males with 4-6 virgin females of your desired genotypes in a dated food vial, and store at 25° C and 60% humidity. After 3-4 days, larvae will be present and the parents should be transferred to a new vial, preventing the parents from mating with the progeny. After approximately 10 days, new offspring will emerge and their phenotypes can be examined.
One tool that Drosophila researchers use are balancer chromosomes that prevent genetic recombination and contain genetic markers such as curly wings, which are useful in determining the correct genotype of a fly. If you wanted flies that are heterozygous for two different mutations, you can cross a stock with mutation #1 over the balancer chromosome CyO, to a second stock with mutation #2 also balanced over CyO. Any progeny that emerge without curly wings are heterozygous for both mutations.
Another commonly used tool in Drosophila research is the UAS-GAL4 system, which allows researchers to express or knockdown a gene in a specific tissue. GAL4 is a yeast transcription factor that is driven by a tissue specific promoter and UAS is the Upstream Activating sequence, which controls the expression of the gene of interest . When you cross a fly with a tissue specific GAL4 transgene to a fly with a UAS transgene with your gene of interest directly downstream, the GAL4 protein binds the UAS and drives expression of your desired gene. For example, UAS-GFP crossed to apterous-GAL4, which is specific for the wing discs in pupa, expresses GFP specifically in those cells.
There are many applications that can be used to study Drosophila development and reproduction. One application is behavioral analyses – specifically courtship behavior. During courtship, the male orients himself towards the female and follows her while tapping her with his forelegs. If the female is receptive, she allows the male to mount her. The male curls his abdomen and transfers seminal fluid into the female, a process known as copulation. The analyses of these behaviors of courtship in various mutants gives insight into the genetic control of behavior
Drosophila development is an extremely dynamic process that includes many cell movements and shape changes, which can be studied via live imaging. For example, dorsal closure during embryogenesis is when a gap in the epithelium is closed in a zipper-like manner involving the coordination of many cell types. Dorsal closure during development is often used as a model to study wound closure, which may have clinical implications.
A third application used to understand processes during Drosophila development is RNA interference, which knocks down the activity of individual genes and can be used in large scale reverse genetic screens. For example, dsRNA can be injected into embryos, and the impact of the gene knockdown on organ development, for example, can be assessed. Here, RNA interference revealed a gene important for fusion during tracheal development.
You’ve just watched JoVE’s introduction to Drosophila melanogaster reproduction and development . In this video we reviewed: the Drosophila life cycle, including details about each stage of development. We also learned how to use the reproductive capabilities of Drosophila to study genetics and set up a cross. Finally, we learned how Drosophila development and reproduction are useful for understanding complex processes such as behavior, wound closure, and organ development.
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