ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパ​​ミン-2受容体に対する抗体を検出する

次の実験の全体的な目標は、ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイを使用して、患者サンプル中のニューロン抗D two RまたはN-M-D-A-R抗体を検出することです。これは、プラスミド内のヒトD two RまたはN-M-D-A-Rの完全なCDNA配列であるサブクリングによって達成されます。第2のステップとして、ヒト細胞株をトランスフェクションし、ニューロン抗原の細胞表面発現につながります。

次に、トランスフェクションした細胞を、フローサイトメトリーを取得する前に、患者の血清および適切な二次抗体とインキュベートします。細胞表面抗原への抗体結合を検出するために、フローサイトメトリー解析に基づいて結果が得られます。この当社の高3ポートフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイは、患者サンプルの大規模なコホートに対して高速、定量的、効率的です。

これは、免疫化学および共焦点解析を伴う細胞ベースのアッセイを使用するよりも大きな利点です。一般に、この方法に不慣れな個人は、フローサイトメーターで適切な数の細胞を取得するために、実験の過程で細胞の損失に苦労します。洗濯の合間に細胞を吸引しないように注意してください。

膜貫通タンパク質の発現に適しており、抗原と緑色蛍光タンパク質を別々に細胞内で共発現させることができる発現ベクターを選択してください。例えば、このベクターは、内部リボソームエントリーサイトの制御下で強化されたGFPレポーターを有し、適切な制限酵素を用いてヒトCD NAの全長をベクターにサブクローン化し、クローンをシーケンシングにより検証した後、トランスフェクション培養に用いるのに適したプラスミドストックを作製する。HEK 2 93細胞は、10%ウシ胎児血清を含む完全なDMEMです。

1回の洗浄後、トリプシンで細胞を回収し、細胞を遠心分離し、細胞ペレットを新鮮な完全なdmmで懸濁します。細胞をカウントし、次に6つのウェルプレートに2ミリリットルの培養物を約70%Coの流暢さで播種し、HEK 2 93細胞のウェルに発現コンストラクトとコントロールベクターをトランスフェクションに割り当てます。トランスフェクションしたHEK 2 93細胞に一部を保管し、後で補正します。

200マイクロリットルの0.9%塩化ナトリウム、2.5マイクログラムのDNA、および4マイクログラム/ミリリットルのポリエタリンからなるトランスフェクションミックスを調製します。すぐに10秒間ボルテックスし、室温で10分間インキュベートしてから、トランスフェクションミックスを2ミリリットルの新鮮な完全なdmmの各ウェルに加えます。プレートを覆い、側面をパーフィルで包み、細胞トランスフェクションを助けるために280GSで5分間遠心分離します。

次に、パラフィルムをはがし、プレートを培養条件下で18時間置きます。培養培地を新鮮で完全なDM EMと交換し、さらに72時間培養中に保持します。細胞を剥離するには、各ウェルに500マイクロリットルのバリスを加え、摂氏37度で約5分間インキュベートします。

次に、各ウェルの細胞をPBS中の2ミリリットルの2%FBSに再懸濁し、3回の洗浄後に細胞を円錐管に移します。セルパレットを2%FBS溶液中に1ミリリットルあたり100万セルで再懸濁します。次に、フローサイトメトリー取得用の96ウェルテンプレートを設計し、異なる細胞株を各患者サンプルまたは一次抗体で処理します。

次に、Vボトム96ウェルプレートにウェルあたり50, 000個の細胞を播種し、450Gで5分間遠心分離することにより細胞をペレット化します。プレートを斜めに傾け、細胞ペレットを吸引しないように注意しながら、スープラナチンを静かに取り外します。次に、抗原表面発現を評価するために、一次抗体の段階希釈液を添加します。

そして、抗体を検出するために、2%FBS溶液の170マイクロリットルで3回洗浄した後、暗所で室温で1時間細胞をインキュベートし、患者と抗米国に適したAF 6 47標識二次抗体抗ヒトIgGを追加します。一次抗体のIgG。3回の洗浄後、暗所で室温で1時間ハイブリダイズします。

Resusは、フローサイトメーターでのフローサイトメトリー細胞取得のために、35マイクロリットルの2%FBS溶液に細胞を懸濁します。まず、ハイスループットサンプラーをセットアップします。フローサイトメトリー取得テンプレートに従って、ウェルあたり10, 000イベントを取得します。

データをエクスポートし、フローサイトメトリーソフトウェアパッケージを使用して、前方内側散乱光に基づいて生HEK 2 93細胞をゲートして解析します。また、トランスフェクションされた細胞のみを解析するために、高いGFP陽性率でゲートします。生GFP陽性細胞内のAF 6 47チャネルの平均蛍光強度を決定します。

次に、データをExcelまたはプリズムにエクスポートして分析します。各患者およびコントロールサンプルの対応するサンプルから得られた一次抗体の濃度とMFIの濃度をプロットします。デルタMFIの決定 対照コホートの平均デルタMFIに3標準偏差を加算することにより、抗体陽性率の閾値を計算します。

次に、患者グループに従ってグループ化された個々のサンプルをグラフにプロットします。ここでは、しきい値を線で表します。n メチルドアスパラギン酸受容体またはドーパミン 2 受容体のいずれかを発現する細胞を、ハイスループットサンプラーを使用してフローサイトメーターで取得しました。

解析中、細胞はサイズを前方散乱光、粒度を横散乱光に基づいてゲート化しました。TRANSFECTED HK 2 9 3細胞は細胞質内でGFPレポーター分子を発現し、UNTトランスフェクションされた細胞はGFP陽性歩行内の分析から除外されました。AF 6 47標識抗ヒトIgG二次抗体結合に関連するMFIを測定し、ヒト血清を分析する際のバックグラウンド蛍光を排除しました。

デルタMFIは、コントロールセルのバックグラウンドMFIを差し引くことによって計算されました。このフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイは、目的の細胞表面抗原の抗体検出に基づいています。例えば、N-M-D-A-Rの発現プラスミドをトランスフェクトしたa GK2 93細胞は、表面およびメチルde受容体の高発現を示した。

同様に、D 2 Rトランスフェクト細胞はドーパミン2受容体を発現したが、制御された細胞はこれらの抗原のいずれも発現しなかった。この臨床試験では、N-M-D-A-R脳炎の患者コホート、D 2 R抗体関連脳炎の患者コホート、および他の非炎症性神経疾患の対照コホートを評価しました。陽性患者はいずれも抗体に対して二重陽性ではなかったことに注意してください。

予想通り、N-M-D-A-R-M-D 2つのRをターゲットとしています。N-M-D-A-RおよびD 2つのR抗体は、分析したコントロールのいずれにおいても検出されませんでした。一度習得すると、この技術は、開発後約80サンプルの1時間のフロー取得で5時間で適切に実行できます。

この技術は、神経免疫学の研究者が免疫介在性疾患における新しい抗体標的を発見する道を開きました。