Name: その時 液体中の生物学的集合体のTEM (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-30T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学ぼう 液体中のロタウイルス複合体をナノメートル分解能でTEMイメージングする方法。親和性キャプチャー表面を用いたシリコンナイトライドマイクロチップで拡散を防ぎ、動的挙動を観察します。

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著者らは、バージニア工科大学カリリオン研究所所長のマイケル・J・フリードランダー博士が研究努力を奨励することを認めている。このプロジェクトは、S.M.MとD.F.K.への開発資金と、バージニア工科大学の重要技術応用科学研究所のナノバイオイニシアチブによって支えられました。

1. アフィニティ キャプチャ デバイスの準備16
<ol><li>窒化ケイ素Eチップを15mlのアセトンで2分間インキュベートし、2分間15mlのメタノールを2分間洗浄します(図1A)。薄層の空気流の下でチップを乾燥させます。</li>
	<li>乾燥したチップを加熱した攪拌板に150°Cで1.5時間インキュベートし、使用前に室温まで冷却します。</li>
	<li>ハミルトン注射器を使用して、小さなガラス管の脂質混合物を構成して25%クロロホルムを含み、 55%DLPC(1,2-ジロイル・ホスホコリン)クロロホルム(1mg/ml)および20%Ni-NTA脂質(1,2-ジオレオロイルイミノ酢酸-サクシニルニッケル塩)をクロロホルム(1mg/ml)で合計体積40μlとした。</li>
	<li>湿度の高いペトリ皿のパラフィルムに、15μlのミリ-Q水の各15μl滴の混合物のアリコートを適用する(図1B)。氷上でサンプルを少なくとも60分間インキュベートします。</li>
</ol>2. 高分子の捕獲17
<ol><li>150 nm の統合スペーサを備えた E チップを単層サンプルの上に置き、1 分間インキュベートします (図 1C)。</li>
	<li>サンプルからチップをそっと持ち上げ、His タグ付きプロテインA.インキュベートの3 μl アリコートを室温で 1 分間インキュベートします (図 1D)。</li>
	<li>Whatman#1ろ紙を使用して余分な滴を消し去り、すぐに抗体溶液の3μlアリコートを加えます。室温で1分間インキュベートします。</li>
	<li>ハミルトンシリンジを使用して余分な溶液を除去し、50 mM HEPES(pH 7.5)、150 mM NaCl、10 mM MgCl2および10 mM CaCl2を含む緩衝溶液に1μlのロタウイルスDLP(0.1mg/ml)のアリコートをすぐに加える。室温で少なくとも2分間インキュベートする。DMP の準備については、前に18を説明しました。
</li>
</ol>3. マイクロ流体室を組み立て、イン ・ザ・イン ・シーク・フィエサー
<ol><li>ウイルスサンプルを含むウェットEチップをマイクロ流体試料ホルダーの先端にロードします。2番目のフラットEチップを1分間グロー放電し、スペーサーチップの上に積み込みます(図2、 パネル1-5)。</li>
	<li>あるいは、生体高分子のコントラストを高めるために、重金属染色(例えば0.2%ウラニルシフィジ)を、湿った試料に第2のEチップを置く前に湿った標本に加えることができる。しかし、試料を含むEチップは、造影試薬を添加する前にミリQ水で洗浄する必要があります。</li>
	<li>アセンブリ全体を挟み合わせて密閉されたエンクロージャを形成し、3本の真鍮ネジでホルダー内に機械的に保持します(図2、パネル6-8)。</li>
	<li>アセンブリに続いて、ホルダーの先端は、TEMの内側にホルダーを配置する前に、ターボポンプドライポンプ場を使用して10-6 Torrにポンプで送られます。</li>
</ol>4. 透過型電子顕微鏡を用いた液体中のイメージング
<ol><li>LaB6フィラメントを搭載し、120kVで動作する透過型電子顕微鏡(FEI社)にインザッチの標本ホルダーをロードします。</li>
	<li>TEMフィラメントをオンにし、ウォブラー機能を使用して、カラム内のサンプルを前後に-15°から+15°まで傾けることで、標本に対して顕微鏡ステージのユーセントリックな高さを調整します。この手順は、液体チャンバの適切な厚さを考慮するために、Z方向のステージを調整します。このステップはまた、正確な倍率が画像を記録するときに使用されることを保証します。</li>
	<li>最初に、エッジに沿って、マイクロ流体室の隅の領域に画像を記録します。通常、これらの領域には最も薄いソリューションが含まれます。CCDカメラを用いて低線量条件(1-3電子/Å2)の下での検体の画像を記録します。6,000X ~ 30,000X の公称倍率を使用します。</li>
	<li>流体チャンバの端に焦点を合わせ、適切な焦点脱焦点値を決定します。30,000X倍率で画像を記録するには、-1.5 μmの値を使用します。厚い溶液が発生した場合、または造影剤が試料調製に使用されていない場合は、-2〜-4 μmの範囲でより高い脱焦点値を使用してください。</li>
	<li>実験中にマイクロ流体室に溶液が含まれていることを確認するには、デバイス内の液体に気泡が形成されるまで電子線を焦点を合わせます。</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+atomic+resolution+structural+determination+by+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).</li>
<li>Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+interactions+in+bovine+papillomavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Subunit interactions in bovine papillomavirus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).</li>
<li>Unwin, P. N., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+determination+by+electron+microscopy+of+unstained+crystalline+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens.</a> J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-negative+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Cryo-negative staining.</a> Micron. 29, 145-160 (1998).</li>
<li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186, 407-414 (1974).</li>
<li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biol.+Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects.</a> Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184, 77-78 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).</li>
<li>Ring, E. A., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).</li>
<li>Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+locations+of+gold-labeled+proteins+in+a+whole+mount+eukaryotic+cell+obtained+with+3nm+precision+using+aberration-corrected+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).</li>
<li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336, 61-64 (2012).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+gold+nanoparticle+uptake+in+live+cells+with+liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).</li>
<li>Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+with+a+liquid+flow+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy with a liquid flow cell.</a> J. Microsc. 242, 117-123 (2011).</li>
<li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+affinity+capture+devices-a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rsc.+Adv%22%5BJournal%5D)">The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).</li>
<li>Gilmore, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+viral+assemblies+in+a+nanoscale+biosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere.</a> Lab Chip. 13, 216-219 (2013).</li>
<li>Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+bovine+rotavirus+cores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of bovine rotavirus cores.</a> J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+using+electron+cryomicroscopy+and+single-particle+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bayesian+view+on+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Bayesian view on cryo-EM structure determination.</a> J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).</li>
<li>Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Affinity+Grid%3A+a+pre-fabricated+EM+grid+for+monolayer+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification.</a> J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).</li>
</ol>

著者のマデリーン・J・デュークスは、株式会社プロトチップスの従業員です。

今回の研究では、テザーロタウイルスDMPに対するアフィニティキャプチャアプローチをマイクロ流体プラットフォームに採用しました。これは、液体微小環境における高分子複合体の画像化をその 場 で可能にした。キャプチャアプローチは、生物学的標本をイメージングウィンドウに局地化して、液体中の画像を記録している間に発生する大きな拡散性の問題を否定するため、 他のマイクロ流体イメージング技術に関して重要です 。しかし、 我々のプロトコルにおける最も重要なステップ の1つは、マイクロチップ表面への脂質バイオフィルムの移動を含む。脂質単層がグリッド上に均等に広がることができない場合、これは欠陥のある実験をもたらすでしょう。不十分な転送ステップの兆候は、ウイルスアセンブリがほとんどまたはまったく流体チップに結合されることです。転写工程における制限は、脂質層の流動性に関する熱安定性である。転写工程が不十分な場合、落下の不均一な広がりによって評価されるように、脂質層は氷上または振動のない冷たい部屋でインキュベートする必要があります。また、ペトリ皿は適切な湿度を維持するためにパラフ...

<a href="https://app.jove.com/t/6605">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/50936">10.3791/50936</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/50936">In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid</a>. The Representative Results and References sections were&#160;updated.

Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

生物学者や技術者の共通の目標は、分子機械の内部の仕組みを理解することです。透過型電子顕微鏡(TEM)は、原子に近い分解能1~2でこれらの複雑な細部を可視化するのに理想的な装置です。TEMの高真空システムを維持するために、生体試料は、典型的には、ビトレウス氷3の薄膜に埋め込まれ、糖4、重金属塩5、またはそれらの組み合わせ6が挙げられる。その結果、埋め込み標本の画像は、動的プロセスの限られたスナップショットのみを明らかにすることができる。
環境液体室で水和した生物学的標本を維持する初期の試みは、パーソンズと同僚が差動ポンプステージを使用して行った。未染色カタラーゼ結晶の電子回折パターンは、水和状態で3Åの分解能に記録された7-8.さらに、相分離脂質ドメインは、ヒト赤血球9〜10の水和膜で調べることができた。しかし、液体の拡散や電子線との干渉による運動は、重度の分解能損失をもたらし、生物学的標本を用いたさらなる実験は最近まで試みられなかった。
半導体マイクロチップを利用してマイクロスケール環境室を形成する新開発のマイクロ流体試料ホルダーが導入されました。これらのデバイスは、TEM 列11 から 12に配置されている間、サンプルを液体に保持できます。TEMイメージングにおけるこの技術的ブレークスルーにより、研究者は分子レベル13で初めて進行性のイベントを見ることを可能にしました。この新しいモダリティを「その時点での 分子顕微鏡」と呼び、EMカラム14-15の「内部」で実験を行うことができるようになりました。この方法の全体的な目的は、ナノメートル解像度でのそれらの動的挙動を観察するために液体中の生物学的アセンブリを画像化することです。開発された技術の背後にある根拠は、リアルタイムの観測を記録し、溶液中の生物学的機械の新しい特性を調べることです。この方法論は、細胞生物学および分子生物学におけるより広範な目的のためのTEMの使用を拡大する 12-16.
現在のビデオ記事では、市販のマイクロ流体標本ホルダーを組み立て、使用するための包括的なプロトコルを紹介しています。これらの専門のホルダーは、溶液の微細なボリュームを囲む液体チャンバーを形成するために、統合されたスペーサーで製造されたシリコン窒化マイクロチップを利用します。薄く透明な窓は、撮像目的のためにマイクロチップにエッチングされる12。TEMを用いて、マイクロ流体ホルダーを用いて、液体中のシミアンロタウイルス二重層粒子(DRP)を調べるのが適切な方法を示す。DMPなどの生物学的アセンブリがイメージング中に遠距離で急速に拡散しないようにするために、我々は、それらをマイクロ流体室16の表面にテザーするためにアフィニティキャプチャアプローチを採用する。この分子捕獲ステップは下流の処理ルーチンに使用されるイメージの獲得を可能にするので液体の生物学的標本をイメージするための 代替技術より大きな利点 がある。マイクロ流体イメージングと組み合わせて使用されるこのキャプチャステップは、当社の手順17に固有です。TEMまたはマイクロ流体イメージングチャンバを使用して構造生物学アプリケーションを採用している読者は、分子レベルでの動的観測が最終目標である場合、アフィニティーキャプチャ技術の使用を検討することができます。

<table><tbody><tr><td>Eチップ、スペーサーチップ</td>、<td>プロトチップス</td><td>EPB-52TBD</td><td>400 &mu;メートル×50 &mu;m window</td></tr><tr><td>E-chip, top chip</td><td>Protochips, Inc. (英語)</td><td>EPT-45W</td><td>400 &MU;メートル×50 &mu;m window</td></tr><tr><td>Ni-NTA脂質</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404P</td><td>粉末形態</td></tr><tr><td>DLPC (12:0) 脂質</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850335P</td><td>粉末形態</td></tr><tr><td>容積フラスコ&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>20-812A; 20-812C</td><td>1 ml; 5 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジハ</td><td>ミルトン株式会社</td><td>80300、80400</td><td>1-10 &mu;l;1-25 &MU;l</td></tr><tr><td>Whatman #1 濾紙</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>100 個、90 mm</td></tr><tr><td>ガラス ペトリ皿</td><td>コーニング</td><td>70165-101</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>ガラス パスツールピペット</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>14673-010</td></tr><tr><td>ガラス培養管</td><td>VWR</td><td>47729-566</td><td>6 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>A11-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A412-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>クロロホルム&nbsp;</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>12550</td><td>100 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Hisタグ付きプロテインA</td><td>アブカム社</td><td>ab52953</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>ミリQウォーターシステム</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>Z00QSV001</td><td>超純水</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP310-500</td><td>500g</td></tr><tr><td>装置&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポセイドン In situ 試料ホルダー</td><td>Protochips, Inc.</td><td></td><td>&nbsp;FEI対応</td></tr><tr><td>FEI Spirit BioTwin TEM</td><td>FEI Co.</td><td></td><td>120 kV</td></tr><tr><td>Eagle 2k HS CCDカメラ</td><td>FEI Co.</td><td></td><td>10&nbsp;&Aring;/pixel 30,000X</td></tr><tr><td>Gatan 655 Dry pump station</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td>ポンプホルダー先端 10-6&nbsp;range</td></tr><tr><td>PELCO easiGlow, グロー放電ユニット</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td></td><td>&nbsp;負極性モード</td></tr><tr><td>Isotemp 加熱攪拌板</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Heat to 150 &ordm;Cで1.5時間</td></tr></tbody></table>

その時 液体中の生物学的集合体のtem

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

研究者は定期的に透過電子顕微鏡(TEM)を使用して生物学的実体を調べ、新しい材料を評価します。ここでは、液体環境でのウイルスアセンブリの表示- これらの機器のための追加のアプリケーションを説明します。この新しい生物学的構造の可視化手法は、最近開発されたマイクロ流体ベースの検体ホルダーを利用しています。ビデオ記事では、TEM内の液体標本を画像化するためにマイクロ流体ホルダーを組み立てて使用する方法を示しています。特に、モデルシステムとしては、シミアンロタウイルスの二重層粒子(DMP)を用います。また、DDLPsを視受窓につなげたアフィニティバイオフィルムで液体チャンバーの表面をコーティングする手順についても説明する。これにより、3D構造の決定に適した方法でアセンブリをイメージすることができます。このように、我々は、天然の液体環境における亜ウイルス粒子の最初の一見を提示する。

グロー放電されたEチップを用いた液体中のDMPの代表的な画像(図3A)は、アフィニティキャプチャデバイスで富化されたDMPと比較して、拡散によるものと考えられる特定の視聴領域におけるDMPの数が少なくなっています(図3B)。イメージングチャンバにウラニルのフォーマットを加えて、試料のコントラストが高まり、溶液中の個々のDMPの視認性が高まります(図3C、トップパネル)。より良いコントラストは、粒子平均化(図3C、ボトムパネル)や3D再構成ルーチン(図3C、インセット)などのダウンストリーム画像処理を、前述の17のように可能にする。簡単に言えば、3D再構成のために、SPIDERソフトウェアパッケージ19を用いて600個のDMP粒子を選択しました。選択粒子を、80Å分解能に濾過したロタウイルスDLP20の初期モデルに対して精製した。RELIONソフトウェアパッケージ21を用い、約25Åの...

ここでは、透過型電子顕微鏡を用いて、ナノメートル分解能でウイルス複合体を画像化する手順について説明する。

その時 液体中の生物学的集合体のTEM

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

この手順の全体的な目的は、生物学的複合体および液体をイメージングし、ナノメートル解像度でそれらの動的な挙動を観察することです。これは、まず、高分子をマイクロチップ表面に係留させて液体中での拡散を防ぐため、親和性キャプチャー表面を持つ窒化ケイ素マイクロチップを調製することで達成されます。第2のステップでは、ロタウイルス粒子を捕捉するために、生物学的サンプルをマイクロチップにロードします。次に、ウイルス粒子を含むマイクロチップを造影剤で洗浄し、マイクロ流体試料ホルダーに装着します。最終ステップとして、トップチップとフェイスプレートを装着し、液体試料を封入した密閉容器を形成します。最終的に、TEMで画像を記録し、液体マイクロチャンバー内のウイルスサンプルの特徴を明らかにします。液体中の個体を観察する他の既存の手法に対する本手法の主な利点は、マイクロチップに親和性キャプチャーコーティングを施しているため、イメージング中に試料が広範囲に急速に拡散しないことです。この手法の意義は、溶液中でダイナミックなナノマシンがどのように変化するかを初めて観察できるため、ナノ粒子ベースの薬物輸送システムやウイルス病原体に対するワクチン開発のリアルタイム評価へと広がります。本手法は生物学的高分子の可視化に知見を提供できるだけでなく、電気化学的な応用などの他のシステムにも適用可能です。本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。というのも、アフィニティキャプチャーデバイスの作製やマイクロ流体試料ホルダーへのセットは、不慣れなユーザーにとって困難な場合があるためです。まず、窒化ケイ素チップを15 millilitersのアセトンで2分間、次いで15 millilitersのメタノールで2分間インキュベートし、洗浄します。製造工程で使用した残留フォトレジストを除去するため、チップを層流の下で速やかに乾燥させます。乾燥後、150 °Cに加熱したプレート上でチップを1.5時間インキュベートします。その後、室温まで冷却させます。次に、ハミルトンシリンジを使用して、小さなガラスチューブ内で脂質混合液を調製します。まず25%クロロホルムを加え、次に1 mg/mLのクロロホルム溶液である55%DLPCを加えます。最後に、別のシリンジを用いて1 mg/mLのクロロホルム溶液である20%ニッケルNTA脂質を加え、全量を40 µLとします。次に、100 × 15 mmのガラス製ペトリ皿に収まるサイズにパラフィルムを切り、その表面にMilli Q水を15 µLずつ9滴加します。Milli Q水の各ドロップの上に、脂質混合液を1 µLずつ分注し、ドロップの表面に脂質単分子層が形成されるまで、湿度の高い環境下で氷上に少なくとも60分間静置します。単分子層のドロップの上に、150 nmの統合スペーサーを備えたEIPを載せ、1分間インキュベートします。次に、チップを液滴からそっと持ち上げ、0.01 mg/mLのHisタグ付きプロテインAを3 µL、チップの表面に直接添加します。チップとプロテインAを室温で1分間インキュベートします。その後、Whatman No.1ろ紙を用いて余分な液体を吸い取り、直ちに0.01 mg/mLのIgG抗体溶液を3 µL添加します。サンプルを室温で1分間インキュベートします。次に、Hamiltonシリンジを用いて余剰な溶液を除去し、直ちにHEPESバッファー溶液中で0.1 mg/mLに調整したロタウイルスの2層粒子を1 µL分注し、チップを室温で少なくとも2分間インキュベートします。2枚目のフラットIPは、1分間のグロー放電によって準備します。まず検体チャンバーの先端にOリングを装着し、ST.Stereoscopeを用いてマイクロ流体チャンバーを組み立てます。次に、ウイルス試料を含む湿式E IPをマイクロ流体試料ホルダーの先端にロードします。続いて、グロー放電処理した平坦EIPを試料の上に重ね、アセンブリ全体を挟み込んで、ホルダー内の3本の真鍮製ネジで機械的に固定し、密閉容器を形成します。組み立て後、ホルダーの先端を10⁻⁶ torまで排気します。ターボ分子ポンプ付きドライポンプステーションを用いて排気した後、LaB6フィラメントを搭載し120kVで動作している透過電子顕微鏡（TEM）にI two試料ホルダーを導入します。次に、TEMのフィラメントを点灯させ、ウォブラー機能を用いて試料を-15度から+15度まで繰り返し傾斜させ、試料に対する顕微鏡ステージの中心高を調整します。カラム内で、マイクロ流体チャンバーの端およびコーナー領域に沿って、6,000倍から30,000倍の倍率で画像を記録します。1〜3 electrons/Å²の低線量条件下で、CCDカメラを用いて最初の画像を取得します。流路チャンバーの端でフォーカスを合わせ、適切なデフォーカス値を決定してください。一般的に、溶液がマイクロ流路チャンバー内に保持されていることを確認するため、30,000倍の倍率で画像を記録する際は、-1.5 µmのデフォーカス値を使用します。実験全体を通して、デバイス内の液体中に気泡が形成されるまで電子ビームをフォーカスしてください。ここに示されている画像は、5 electrons per angstrom squaredで2分間照射した後に撮影したものです。5分後には、さらに多くの気泡が形成され、グロー放電とマイクロチップの結合が起こりました。溶液中では、おそらく拡散のため、二層構造の粒子はごくわずかしか存在しません。対照的に、ここに示すアフィニティー修飾マイクロチップ上では二層構造の粒子が濃縮されています。これらは、造影剤を含む液体中の二層構造粒子の代表的な画像および3D再構成図です。再構成図の直径は80 nanometersです。二層粒子および液体のクラス平均画像では、その外表面に沿って明確な構造が認められました。各パネルのスケールは110 nanometersです。この手順を行う際は、E IPSを試料ホルダーの先端に中心合わせし、電子顕微鏡に挿入する前にホルダーをPrepUすることを忘れないでください。この手順に続き、電子線がウイルス複合体の機能的能力にどの程度影響を与えたかという追加の疑問に答えるため、転写活性の評価などの他の手法を実施することができます。このビデオを視聴することで、アフィニティキャプチャデバイスの作製、分子アダプターによる修飾、マイクロ流路TEMホルダーへのウイルス検体の導入、および標準的な顕微鏡手順を用いた検体のイメージング方法について十分に理解できたはずです。ウイルス病原体を扱う操作は極めて危険である可能性があるため、BSL 2の病原体を用いて手順を行う際は、手袋や保護メガネの着用などの予防措置を常に講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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クライオSTEMトモグラフィーによるオルガネラのin situ 可視化

学ぼう 液体中のロタウイルス複合体をナノメートル分解能でTEMイメージングする方法。親和性キャプチャー表面を用いたシリコンナイトライドマイクロチップで拡散を防ぎ、動的挙動を観察します。

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