AFMベース1分子力分光法によるセルロソームの受容体リガンド系の探索

本実験の全体的な目的は、AFMベースの単分子力分光法を用いて、融合タンパク質の結合パートナーの機械的特性およびフォールディング状態を研究することです。これを実現するために、第2ステップとして、タンパク質結合パートナーをガラススライドとAFMカンチレバーに共有結合で固定し、明確に定義された牽引ジオメトリを構築します。カンチレバーでガラス表面を押し込むことにより、受容体とリガンドの結合を形成させます。

次に、個々のタンパク質ドメインを展開させ、受容体・リガンド複合体を解離させるために、カンチレバーを一定速度で後退させます。得られた結果から、展開経路に沿ってエネルギー障壁として機能する三次構造要素が明らかになり、これらはポリマー弾性モデルによって示されます。動的力スペクトルに速度論的モデルを適合させることで、結合パートナーに関するさらなる速度論的およびエネルギー的な情報を得ることができます。この手順の全体的な目的は、力負荷条件下におけるタンパク質の展開経路を研究することです。

この手法により、タンパク質の機械的安定性に関する知見を得ることができます。この手法は、アクセス可能なファイルグループを設計できるあらゆるタンパク質受容体リガンド系に適用可能です。この手法を初めて用いる研究者は、タイミングが極めて重要であることや、カンチレバーの取り扱いが困難であることから、苦労する場合があります。

この手法は、マルチドメインタンパク質がどのように展開するかなど、生物物理学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。まず、直径24 mm、厚さ0.5 mmのガラスカバースリップ2枚をPTFEホルダーに配置し、エタノールと超純水の50:50混合液中で15分間超音波洗浄します。

超音波洗浄が完了したら、カバーガラスを超純水で洗浄し、ピラニア溶液中で30分間エッチングします。30分後、カバーガラスを取り出して超純水で洗浄し、窒素気流で穏やかに乾燥させます。次に、エタノール、超純水、および3-アミノプロピルトリエトキシシランを45:5:1の割合で混合した溶液にカバーガラスを浸します。

浸漬させたサンプルを、室温で毎分約50回転のシェーカーに60分間置きます。次に、カバーガラスを100% ethanolに浸し、続いて超純水に浸す操作をそれぞれ2回ずつ順に行います。再び、窒素気流を穏やかに当ててカバーガラスを乾燥させます。

乾燥後、カバーガラスをオーブンにて80 °Cで30分間焼成します。未使用のカバーガラスは、シリコン製カンチレバーチップのアミノ化を行うまで、アルゴン雰囲気下で最大6週間保存してください。まず、4本のシリコン製カンチレバーを清潔なガラススライド上に配置し、UVオゾン処理を15分間行います。

次に、カンチレバーをエタノールと3-アミノプロピルジメチルエトキシシランの50:50混合溶液および0.25%の超純水に3分間浸漬させます。続いて、トルエン、エタノール、超純水の順に、それぞれ60秒間カンチレバーを洗浄します。最後の洗浄後、洗浄の合間にフィルターペーパーで慎重にカンチレバーを乾燥させます。

カンチレバーを清潔なガラススライドの上に置き、80 °Cで30分間加熱します。TEP diss sulfide還元ビーズの2つのチューブを準備するため、まず200 µLピペットチップの先端を切断して直径を広げ、次にストックビーズ溶液100 µLを各1.5 mLマイクロチューブに分注します。次に、TEPビーズスラリーのチューブにTBS 1 mLを加え、マイクロチューブを短時間ボルテックスしてビーズを洗浄します。

次に、サンプルを 850 Gs で 3 分間遠心分離し、ビーズをペレット化します。マイクロピペットで上清を慎重に取り除いて廃棄し、1 mL の TBS でビーズをさらに 2 回洗浄します。洗浄の間に遠心分離を行い、最終洗浄後、3 mg/mL の高濃度タンパク質溶液を TEP ビーズに 1:2 の比率で加え、気泡が入らないようにマイクロピペットのチップで撹拌してスラリーを穏やかに混合します。

次に、タンパク質TEPビーズスラリー混合液をローテーターに載せ、2.5時間回転させます。アミノ化されたカンチレバーとカバーガラスをpH 8.5のナトリウムホウ酸緩衝液に45分間浸し、表面の一次アミン基を脱プロトン化します。その後、N-H-S-P-E-Gマレイミド粉末を室温に戻し、ナトリウムホウ酸緩衝液中でボルテックスして、25 µMの溶液を210 µL調製します。

NHSの半減期は極めて短いため、溶液はできるだけ速やかに使用してください。pH 8.5で、N-H-S-P-E-Gマラム溶液を30 µLずつシャーレに、また、1つおきのガラスカバースリップに90 µLずつ迅速に滴下します。カンチレバーを30 µLの液滴の中に慎重に配置します。

次に、液滴のないカバーガラスを、N-H-S-P-E-G malam溶液がついたカバーガラスの上に反転させて重ね、N-H-S-P-E-G MALAM溶液を挟んだサンドイッチ構造にします。そのまま、カンチレバーとカバーガラスをN-H-S-P-E-G MALAM溶液中で室温で1時間インキュベートします。TEPビーズと還元タンパク質溶液を100 GSで1分間遠心分離し、上清を回収します。

次に、タンパク質溶液をTBSで希釈します。表面結合時のタンパク質濃度が0.5〜2 mg/mLの範囲になるように調整してください。その後、カンチレバーとカバーガラスを洗浄する間、還元および希釈したタンパク質溶液を数分間放置します。

カバーガラスを、超純水を入れた3つのビーカーで順次洗浄します。カバーガラスの端をろ紙に慎重に触れさせ、残留した液体を取り除きます。その後、AFM装置に対応した適切なサンプルホルダーにカバーガラスを固定し、緩やかな窒素気流で残留液体を乾燥させます。

希釈したタンパク質溶液 20 µLを、カバースリップの中央に滴下します。次に、カンチレバーを3つの超純水ビーカーで順次洗浄し、続いて2番目の希釈タンパク質溶液を 30 µL 滴下します。PEG化されたカバースリップとカンチレバーを、それぞれの希釈タンパク質溶液とともに、加湿チャンバー内で室温で1〜2時間インキュベートします。

次に、ピペットを用いてカバースリップを1 mLのTBSで10回以上洗浄し、測定までTBSに浸して保存します。同様に、結合していないタンパク質を除去するため、TBSを入れた3つのビーカーを用いてカンチレバーを順次洗浄し、TBSに浸して保存します。機能化したカンチレバーとガラススライドを、液体中での測定に適しており、Zピエゾの走査速度範囲が約200～5,000 nm/sで調整可能なAFMモデルに装着します。

マウント時に空気への露出を最小限に抑え、レーザービームを正しく調整した後、プロセス全体を通じて表面がバッファーで覆われた状態を維持してください。ドリフトの影響を軽減するため、システムを少なくとも30分間平衡化させ、必要に応じて再調整を行ってください。その後、凝集の結合が確認された時点で測定を開始します。

ここに示す記録された力-距離トレースのペアは、特徴的なピークパターンを示しています。トレース内の各ピークは1つのタンパク質サブドメインのアンフォールディングを表しており、最後のピークは受容体-リガンド複合体の解離に対応しています。

記録された力-距離曲線は、その後、力-輪郭長空間に変換され、バリア位置ヒストグラムにまとめられました。データは、約 89 nanometers の輪郭長増分を示しており、これは cohesive docker との相互作用のエネルギーランドスケープを調査するための xin ドメインの展開に明確に割り当てることができます。4 つの異なるプル速度で、計 186 本のデータ曲線が得られました。

大きな青い円で示された結果の動的力スペクトルは、特定の負荷速度における最も可能性の高い破断力を表しています。これらの値をBell-Evansモデルにフィッティングした結果、Koffおよびdelta Xの値が得られ、これらは以前に発表された結果とよく一致することが確認されました。この手法の実験部分は、習得すれば8〜9時間で完了させることができます。

この手順に続き、開発後に結合に重要なアミノ酸を特定するための部位特異的変異導入を、追跡実験として行うことができます。この手法は、単一分子生物物理学分野の研究者がタンパク質折りたたみランドスケープを探索するための道を切り開きました。本研究では、既知のタンパク質システムの中で最も機械的に安定なものの一つであるセルロースSOEの機械的特性を調べるために、この手法を用いています。

このビデオを視聴することで、タンパク質受容体・リガンドペアに対する単分子力分光法（single molecule force spectroscopy）の実施方法について、十分に理解することができます。