Name: AFMベース1分子力分光法によるセルロソームの受容体リガンド系の探索 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 学ぼう、AFMベース1分子力分光法によるセルロソームの受容体リガンド系の探索方法。タンパク質の力学的特性と折りたたみ状態を解析し、バイオテクノロジー応用への知見を得る実験手順です。

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著者は、欧州研究評議会(European Research Council)のヘルマン・ガウブへの助成金を認めています。マイケル・A・ナッシュは、Society in Science-The Branco Weiss Fellowshipプログラムからの資金提供に感謝しています。著者らは、この研究で使用されたタンパク質を寛大に提供してくれたワイツマン科学研究所のEdward A. Bayer氏、Yoav Barak氏、Daniel B. Fried氏に感謝します。著者は、有益な議論をしてくれたHermann E. Gaub、Elias M. Puchner、およびStefan W. Stahlに感謝します。

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<li>Severin, P. M. D., Zou, X., Gaub, H. E., Schulten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+methylation+alters+DNA+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cytosine methylation alters DNA mechanical properties.</a> Nucleic Acids Res. 39 (20), 8740-8751 (2011).</li>
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<li>Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Stretched+Single+Polymers%3A+Atomic-Force-Microscope+Experiments+Versus+Ab-Initio+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory.</a> Phys. Rev. Lett. 94 (4), 10-1103 (2005).</li>
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<li>Gustafsson, M. G. L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+force+microscope+springs+optimized+for+optical-beam+deflection+and+with+tips+made+by+controlled+fracture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Scanning force microscope springs optimized for optical-beam deflection and with tips made by controlled fracture.</a> J. Appl. Phys. 76 (1), 172 (1994).</li>
<li>Cook, S. M., Lang, K. M., Chynoweth, K. M., Wigton, M., Simmonds, R. W., Schäffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17 (9), 2135-2145 (2006).</li>
<li>Proksch, R., Schäffer, T. E., Cleveland, J. P., Callahan, R. C., Viani, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finite+optical+spot+size+and+position+corrections+in+thermal+spring+constant+calibration%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Finite optical spot size and position corrections in thermal spring constant calibration.</a> Nanotechnology. 15 (9), 1344-1350 (2004).</li>
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<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Molecular+Fingerprints+in+Single+Molecule+Force+Spectroscopy+Using+Pattern+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition.</a> Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+strength+of+molecular+adhesion+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic strength of molecular adhesion bonds.</a> Biophys. J. 72 (4), 1541-1555 (1997).</li>
<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+by+mechanical+triangulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Protein structure by mechanical triangulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).</li>
<li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Rates+and+Activation+Free+Energies+from+Single-Molecule+Pulling+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments.</a> Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).</li>
<li>Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+widespread+nonlinear+force+spectra+of+intermolecular+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

単一分子力分光実験から意味のあるデータを得るには、明確に定義された再現性のある引っ張り形状を実現することが重要です。ここで使用されるプロトコルは、定義された引っ張り形状におけるタンパク質複合体の部位特異的固定化をもたらします。
この研究で使用されたカンチレバーは、力の感度と水中での共振周波数が高いため選択されました。さらに、約10 nmの小さな先端曲率は、複数の相互作用の可能性が低いため、単一分子実験に有利です。ただし、カンチレバーアームの設置面積が小さい(38x16μm2)ため、光たわみ法29 を使用する場合、レーザービームの調整が複雑になります。この研究に使用されたセットアップで集束されたレーザービームの直径は、カンチレバーの幅に匹敵します。その結果、定常和信号を取得することが困難になる場合があります。カンチレバーのレーザードリフトは、説明したように、データ曲線全体のノイズ解析を使用して逆光学レバー感度を補正することで部分的に補正できます。現在、当社グループでは、データ品質向上のため、光路を短くし、レーザースポットサイズを小さくした新...

セルロソームは、嫌気性セルロース分解細菌(C. thermocellumなど)の表面に表示される大きな多酵素複合体で、植物細胞壁のリグノセルロースを可溶性オリゴ糖1に効率的に解重合するように進化しました。セルロソームの中心的な属性は、高親和性コヒーシン-ドッカーリン相互作用です。最も顕著なパラダイムでは、高度に保存された60-75アミノ酸I型ドドクリンモジュールが、さまざまな細菌酵素のC末端に示されています。ドッカーリンモジュールは、I型ドッカーリンモジュールに特異的なコヒーシンドメインのポリタンパク質を含む非触媒的スカフォールドタンパク質(「スカフォールディン」)に、酵素の相乗的な組み合わせの組み立てを指示します。より高いレベルでは、セルロソームの構造は非常に複雑になり、構造を細胞表面に固定し、複数のスキャフォールディングを含む分岐構造の組み立てを可能にする代替のコヒーシンとドッカーリンのペア(例:II型、III型)を組み込んでいます2。さまざまなコヒーシン-ドッカーリンタイプは、関連する構造を持っているにもかかわらず、意図しない足場や他のセルロソーム産生細菌種の成分との交差反応性を抑制する異なる結合特異性を示します。バイオインフォマティクスのアプローチにより、遺伝子レベルで数千ものユニークなセルロソーム成分が同定されてきましたが、タンパク質構造は比較的少なく、コヒーシン-ドッカーリン特異性の決定に働くメカニズムは、依然として構造生物学研究の活発な分野です。
Binnigらによる原子間力顕微鏡(AFM)の発明以来。図3に示すように、非接触イメージング、発振モードイメージング4、1分子力分光法(SMFS)5,6など、さまざまなAFM動作モードが開発され、継続的に改善されています。SMFSは、個々のタンパク質7-11、核酸12-15、および合成ポリマー16-19を直接プローブするために広く使用されている技術に進化しました。受容体-リガンド結合を調査するための典型的なSMFS実験20,21では、AFMカンチレバーチップは結合パートナーの1つで修飾され、平らなガラス表面は相補的結合パートナーで修飾されます。変更されたカンチレバーは表面に接触し、パートナーが結合できるようにします。次に、カンチレバーのベースを一定速度で引き抜き、光学レバーのたわみ法を使用して力を測定します。結果として得られる力-距離データトレースは、結合が確立されている場合、のこぎり歯のようなピークを示します。結合パートナーが複数のタンパク質ドメインに融合している場合、力-距離トレースの各ピークは、単一のタンパク質ドメインまたは折り畳まれたサブドメインのアンフォールディングと相関し、最後のピークはタンパク質結合界面の破裂に対応する。耐力性要素の特定の位置は、目的のさまざまなタンパク質ドメインを特定するためのフィンガープリントとして使用できます。この方法は、タンパク質のフォールディングと安定化に関与する重要なアミノ酸を調べるために使用できます。SMFS実験で観察された特徴的な力の伸長挙動を治療するために、多くのモデルが文献で報告されています。最も一般的に使用されるモデルには、自由結合チェーン(FJC)モデル22、ウォームライクチェーン(WLC)モデル18,23-25、および自由回転チェーン(FRC)モデル25,26が含まれます。
以前の研究11では、コヒーシンモジュールとドッカーリンモジュールの相互作用を調査するために単一分子の力分光法を使用しました。ここでは、酵素-ドッカーリンおよびCBM-コヒーシンタンパク質コンストラクトによるガラス表面およびカンチレバーの機能化の実験的プロトコールを紹介します。また、データ取得および解析手順を含むAFMベースのSMFSプロトコルについても紹介します。記載されているプロトコルは、他の分子系に容易に一般化することができ、高親和性受容体リガンドペアに関心のある研究者にとって特に有用であることが証明されるはずです。

<table><tbody><tr><td>3-アミノプロピルジメチルエトキシシラン</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB110423</td><td></td></tr><tr><td>5 kDa NHS-PEG-maleimide</td><td>Rapp ポリマー</td><td>13 5000-65-35</td><td></td></tr><tr><td>TCEP ジスルフィド還元ゲル</td><td>Thermo Scientific, Pierce</td><td>77712</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com/pierce">www.thermoscientific.com/pierce</a</td></tr><tr><td>>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLever ミニ窒化ケイ素カンチレバー</td><td>オリンパス</td><td>BL-AC40TS-C2</td><td>ソフトバッチ</td></tr><tr><td>XYZ圧電アクチュエータ</td><td>Physik Instrumente GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赤外線 "ブロードスペクトラム」IRレーザー</td><td>Superlum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP-3D AFMコントローラー</td><td>アサイラムリサーチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6.31</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>データ収集と分析</td></tr><tr><td>塩化</td><td></td><td></td><td></td>ナトリウム</tr><tr><td>塩化</td><td></td><td></td><td></td>カルシウム</tr>pH<tr><td>メーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td></td><td></td><td></td>ナトリウム</tr><tr><td>ピンセット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバーメガネ</td><td>Thermo Scientific、Menzel-GL&auml;</td><td></td> ser直径<td>24mm、厚さ0.5mm</td></tr>の<tr><td>PTFEサンプルホルダー</td><td></td><td></td><td>カスタムメイド</td></tr><tr><td>ソニケーターバス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td></td><td>分析純度</td></tr><tr><td>硫酸(濃縮)</td><td></td><td></td><td>分析純度</td></tr><tr><td>過酸化水素(30%)</td><td></td><td></td><td>分析純度</td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トルエン</td><td></td><td></td><td>分析純度</td></tr><tr><td>濾紙</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブに適した</td><td>遠心分離機</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ローテーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

afmベース1分子力分光法によるセルロソームの受容体リガンド系の探索

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

セルロソームは、嫌気性細菌や真菌の一部がリグノセルロース基質を消化するために使用する個別の多酵素複合体です。非触媒性足場タンパク質への酵素の組み立ては、相互作用するコヒーシンモジュールとドッカーリンモジュールを含む関連する受容体-リガンドペアのファミリー間の相互作用によって指示されます。コヒーシンモジュールとドッカーリンモジュール間の非常に強い結合により、低ピコモルからナノモルの範囲で解離定数が生じ、従来のバルク法では正確なオフレート測定が妨げられる可能性があります。原子間力顕微鏡を用いた単一分子力分光法(SMFS)は、力に対する個々の生体分子の応答を測定し、他の単一分子操作法(光ピンセットなど)とは対照的に、高力領域(>120 pN)をプローブする能力があるため、高親和性受容体-リガンド相互作用の研究に最適です。ここでは、セルロソームタンパク質集合体を単一分子レベルで研究するための完全なプロトコルを紹介します。天然セルロソームに由来するタンパク質トポロジーを用いて、酵素-ドッカーリンおよび糖鎖結合モジュール-コヒーシン(CBM-コヒーシン)融合タンパク質を用い、それぞれが遺伝子操作されたシステイン残基にアクセス可能な遊離チオール基を有するタンパク質を用いました。ここでは、部位特異的な表面固定化プロトコルと、高親和性複合体の詳細な結合パラメータを取得するための測定およびデータ解析手順を紹介します。結合ウェルの単一サブドメイン展開力、複雑な破裂力、運動オフレート、および潜在的な幅を定量化する方法を示します。マルチドメインセルロース分解複合体の集合に関与するコヒーシン-ドッカーリン相互作用を特徴付ける上でのこれらの方法の成功した適用がさらに説明されています。

記述された手順を用いて、C. thermocellum由来のタイプI cohesin-dockerinペアを調査しました。cohesin-dockerinペアの結合に成功すると、記録された力-距離トレースに特徴的なピークパターンが示されました。代表的なトレースを図4aに示します。トレース内の各ピークは1つのタンパク質サブドメインの展開を表しており、最後のピークは受容体-リガンド複合体の解離に対応しています。
本研究で検討したCBM-コヒーシン-ドケリン-キシラナーゼ複合体において、初期の力の立ち上がりはPEGリンカー分子の伸展に対応します。それに続く最大3回の下降方向へのフォースディップ（力の低下）の一連の流れは、キシラナーゼドメインのアンフォールディングを反映しています。最終的なピークは、コヒーシンとドケリンの結合界面の解離を表しています。
記録されたすべての力-距離トレースを力-輪郭長空間に変換した。得られたバリア位置のヒストグラムをFigure 4B</...

セルロソームは、セルロースを消化するために設計された多酵素複合体です。AFMベースのSMFSを使用して、セルローム関連タンパク質集合体の機械的特性とフォールディング配置を研究しました。セルロソームの組み立てに関与する個々の受容体-リガンド複合体の相互作用を研究するための、タンパク質の固定化、データ取得、およびデータ解析のための完全なワークフローを紹介します。

AFMベース1分子力分光法によるセルロソームの受容体リガンド系の探索

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

本実験の全体的な目的は、AFMベースの単分子力分光法を用いて、融合タンパク質の結合パートナーの機械的特性およびフォールディング状態を研究することです。これを実現するために、第2ステップとして、タンパク質結合パートナーをガラススライドとAFMカンチレバーに共有結合で固定し、明確に定義された牽引ジオメトリを構築します。カンチレバーでガラス表面を押し込むことにより、受容体とリガンドの結合を形成させます。次に、個々のタンパク質ドメインを展開させ、受容体・リガンド複合体を解離させるために、カンチレバーを一定速度で後退させます。得られた結果から、展開経路に沿ってエネルギー障壁として機能する三次構造要素が明らかになり、これらはポリマー弾性モデルによって示されます。動的力スペクトルに速度論的モデルを適合させることで、結合パートナーに関するさらなる速度論的およびエネルギー的な情報を得ることができます。この手順の全体的な目的は、力負荷条件下におけるタンパク質の展開経路を研究することです。この手法により、タンパク質の機械的安定性に関する知見を得ることができます。この手法は、アクセス可能なファイルグループを設計できるあらゆるタンパク質受容体リガンド系に適用可能です。この手法を初めて用いる研究者は、タイミングが極めて重要であることや、カンチレバーの取り扱いが困難であることから、苦労する場合があります。この手法は、マルチドメインタンパク質がどのように展開するかなど、生物物理学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。まず、直径24 mm、厚さ0.5 mmのガラスカバースリップ2枚をPTFEホルダーに配置し、エタノールと超純水の50:50混合液中で15分間超音波洗浄します。超音波洗浄が完了したら、カバーガラスを超純水で洗浄し、ピラニア溶液中で30分間エッチングします。30分後、カバーガラスを取り出して超純水で洗浄し、窒素気流で穏やかに乾燥させます。次に、エタノール、超純水、および3-アミノプロピルトリエトキシシランを45:5:1の割合で混合した溶液にカバーガラスを浸します。浸漬させたサンプルを、室温で毎分約50回転のシェーカーに60分間置きます。次に、カバーガラスを100% ethanolに浸し、続いて超純水に浸す操作をそれぞれ2回ずつ順に行います。再び、窒素気流を穏やかに当ててカバーガラスを乾燥させます。乾燥後、カバーガラスをオーブンにて80 °Cで30分間焼成します。未使用のカバーガラスは、シリコン製カンチレバーチップのアミノ化を行うまで、アルゴン雰囲気下で最大6週間保存してください。まず、4本のシリコン製カンチレバーを清潔なガラススライド上に配置し、UVオゾン処理を15分間行います。次に、カンチレバーをエタノールと3-アミノプロピルジメチルエトキシシランの50:50混合溶液お

investigating-receptor-ligand-systems-cellulosome-with-afm-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

原子間力顕微鏡を用いた細胞ソームの受容体-リガンド系の単分子力分光法による調査

多種多様な単一分子をAFMチップに共有結合するプロトコールが提示されます。これらの分子が固体支持体および生体界面に付着力および自由エネルギーを決定するための手順および例が提供される。...

原子間力分光法による単一分子の接着性を調査

私たちは、原子間力顕微鏡と力分光法を使用して、支持脂質二重膜の調製とその特性評価のためのプロトコルを記述します。...

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

私たちは、単一のTリンパ球におけるカルシウムシグナル伝達のリアルタイムイメージングと、力制御された単一の受容体-リガンド結合速度の測定を同時に行うための技術について説明します。...

蛍光生体膜フォースプローブ：単一細胞上の受容体 - リガンド速度論の同時定量との結合によって誘導される細胞内シグナル伝達

我々は、液体中の振幅変調（タッピングモード）原子間力顕微鏡を用いて、サブナノメートルの解像度の画像を達成するための方法を提示します。この方法は、市販の原子間力顕微鏡で実証されています。私たちは、パラメータの私達の選択の背後にある理論的根拠を説明し、解像度の最適化のための戦略を示唆しています。...

液体中の振幅変調原子間力顕微鏡でのサブナノメートル分解能イメージング

詳細な手順と機械的性質および原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子のアンフォールディング経路を機械的に測定するための戦略について述べる。また選択と良い単一蛋白質分子の録音の正当化のための参照として代表的な結果を述べる.

原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法

このプロトコルを記述する、heterobifunctional シラン カップリング剤による酸化シリコン薄膜表面の原子間力顕微鏡による単一分子力分光法のために設計するで例示されている蛋白質の共有結合固定化、RrgA の相互作用 (毛 1 先端付着性S.

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

我々は、免疫学的研究のための単一のT細胞およびビーズ粒子を用いて原子間力顕微鏡(AFM)片持ちを機能化するプロトコルを提示する。AFMによる単一対T細胞樹状細胞結合をプローブし、蛍光イメージングを用いてAFMによる単一固体粒子に対するマクロファージのリアルタイム細胞応答を監視する手順が示されている。...

免疫学的単一細胞力分光法のための単一T細胞または単一粒子による原子間力顕微鏡片持ちの機能化

ここでは、タンパク質ポリマーを制御された配列で形成する酵素によってタンパク質モノマーを結合し、単一分子力分光研究のために表面に固定化するプロトコルを提示する。...

OaAEP1-媒介酵素合成と単分子力分光法のための重合タンパク質の固定化

原子間力顕微鏡(AFM)片持ち体先端へのプローブ分子の共有結合は、その物理的性質を調査する上で不可欠な技術である。これにより、AFMベースの単一分子力分光法を介して、高い再現性を持つ伸縮力、脱着力、ポリマーの長さを決定することができます。...

AFMベースの力分光法のための単一分子の共有結合

このプロトコルは、数百個の微生物細胞のAFM測定を自動化することを目的としています。まず、微生物をPDMSスタンプ微細構造に固定化し、次に何百もの固定化された細胞に対して力分光測定を自動的に行います。...

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

原子間力顕微鏡-赤外線分光法(AFM-IR)は、細菌研究のための強力なプラットフォームを提供し、ナノスケールの分解能を達成することを可能にします。いずれも、細胞内変化(例えば、細胞分裂時)のマッピング、ならびに化学組成の比較研究(例えば、薬剤耐性から生じる)のマッピングは、細菌中の単一細胞レベルで行うことができる。...

単一細菌化学を探るツールとして赤外線分光法と組み合わせた原子間力顕微鏡

学ぼう、AFMベース1分子力分光法によるセルロソームの受容体リガンド系の探索方法。タンパク質の力学的特性と折りたたみ状態を解析し、バイオテクノロジー応用への知見を得る実験手順です。

AFMベース1分子力分光法によるセルロソームの受容体リガンド系の探索

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