Name: ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-19T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学ぶヒト胸腺からの樹状細胞と上皮細胞の単離法。機械的破砕、酵素処理、密度勾遠心分離を用いて高純度の細胞を効率的に分離し、免疫学研究に応用できます。

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私たちは、CDR2抗体を提供するための胸腺サンプルとブルーノKyewski（DKFZ、ハイデルベルグ、ドイツ）を私たちに提供するための胸部心臓血管外科、大学クリニックチュービンゲンの外科医に感謝しています。また、仕分け施設（チュービンゲン大学）からハンス·イェルクBühringとサブリナグリムに感謝したいと思います。この作品は、SFB 685とHertie財団によってサポートされていました。

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利害の対立が宣言されていません。

ここで説明するプロトコルは、ゴッターら 4が発行するプロトコルの改変である。プロトコルにおける重要なステップは、条件や組織の初期準備だけでなく、パーコール密度分離である。私たちは強く、採取後できるだけ速やかに組織を処理することをお勧めします。これは、清掃や組織を切断する際に高速だが、十分に機能することが重要です。ステップ2.3で説明した胸腺細胞の洗浄中に、間質細胞に損傷を与える可能性があまりにも積極的かつ長期圧力などの組織片にシリンジプランジャの背に圧力をかけたときに適切なバランスを見つけることが重要です。摂動を引き起こすことなく、パーコール溶液/細胞懸濁液の上に媒体を積層することもいくつかの練習を必要とし得る。遠心分離後、それは可能な限り迅速にパーコール溶液の最小量を有するパーコール層からすべての低密度画分細胞を収集することが重要である。 ザ·全体の細胞収率および相対APC番号（ 表1参照）、非常に可変であっても（特に年齢に関して）ドナーおよび実験者の取スキルに依存することができる。概要については、細胞懸濁...

胸腺はT細胞の発達が起こる器官である。胸腺の活動はまだ古い時代に検出することができますが、それが連続して脂肪に置き換えるになったとき、その相対的で絶対的なサイズは、年齢とともに減少する。免疫応答のためのその重要性は1960年代初頭1で示された。 T細胞レパートリーは、主に機能性および自己寛容T細胞レパートリー2で、その結果、T細胞の開発に生死キューを提供胸腺APCの異なる種類に対するペプチド-MHC複合体とT細胞受容体の相互作用を介して形成されている。 ヒト胸腺細胞の約98％は、胸腺細胞とも呼ばれるT細胞を開発している。残りの2％は、TEC（皮質、髄質、被膜下）、骨髄および形質DC（MDC、PDC）、マクロファージ、B細胞、成熟した再循環T細胞、顆粒球、様々含む異なる細胞型の数で構成されFibroblasts、内皮細胞および筋肉、神経細胞および気道上皮（ 図1）のような他の組織からの細胞に似た発現表現型を有する上皮細胞を非常にまれ。これらのうち、TECとDCは通常の胸腺に見られる主要なAPCタイプです。近年では、文化や分子プロファイリングのためのこれらのAPCタイプの精製は、より多くの関心を集めている。それらの低い周波数に、詳細な分析のためにこれらの細胞型のいずれかの単離は、効率的で再現可能で費用効果の高い手順を必要とする。ここで紹介する方法は、以前に発表された研究3,4からの変更です。 任意の他の組織と同様に、胸腺からの細胞抽出は、単一細胞の懸濁液を得るために、酵素的に細胞 - 細胞および細胞 - マトリックス相互作用ネットワークを脱凝集することによって達成することができる。良好な解離効率、細胞収量、細胞生存率および細胞秒の保持のような特定のパラメータがあります重要であるとurfaceマーカーは、これらの稀な細胞集団の単離の成功のために最適化される必要がある。 このプロトコルでは、DCおよびTECサブセットの単離は、機械的破壊及び酵素消化によって組織の単一細胞懸濁液を作製することによって行われる。私たちは、組織を一緒に保持している天然コラーゲンを打破するために、様々な酵素活性のバランスの取れた比率がクロストリジウムヒストリからコラゲナーゼAを使用しています。 DNアーゼIは死細胞（胸腺細胞は非常に敏感である）からの遊離DNAによる細胞凝集を減少させるために酵素液に含まれています。我々はまた、組織の解離剤により補助機械的および酵素組織治療を含む一般的な酵素組織消化の代替アプローチを提供する。単一細胞懸濁液を、次いで、細胞の低密度画分（LDF）の富化のための単一のパーコール密度遠心分離にかけられる。細胞のこの画分から、DCはFを染色することによって単離することができるまたはDC表面マーカー（ すなわち、のCD11c +）および磁気分離または蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて。胸腺細胞の大部分を含むリンパ系細胞とは異なり、TECは高レベルでCD45を発現しないが、上皮細胞接着分子EpCAMのために陽性である。 CTECは、CDR-2（皮質樹状網状-2）により認識まだ未定義の抗原抗体4,5および幾分低いEpCAM発現の発現によって髄TECと区別することができる。のEpCAMおよびCDR2の差動共発現は、6ソーティング高速セルを介してこれらのTECサブセットの効率的な単離を可能にする。 ここで紹介するプロトコルは、人間の胸腺組織に最適化されています。 FACS選別を使用した場合の手順の持続時間は、組織の量及び実験者の能力ならびにセルソーターの速度に依存する。通常は、DCを単離するためのプロトコルは、5以内に完了することができます-6時間および8〜10時間でのTECの単離のため。胸腺組織からDCおよびTECサブセットの分離は、時間に敏感である。より高速な単離操作、優れた細胞の状態。最後に、単離された細胞は、mRNAの比較研究およびタンパク質発現、PCR実験では、タンパク質の単離、分子プロファイリング（ すなわちトランスクリプトミクス、マイクロRNA分析）、ならびに細胞培養6のようなさらなる調査のために使用することができる。 倫理に関する声明ヒト胸腺組織と連携できるようにするために研究者は、組織は通常、未成年から取得されるため、ローカル倫理委員会や責任ある当局だけでなく、ドナーの書面によるインフォームドコンセント（または通常は彼または彼女の両親からの承認を得る必要がある子どもたち）。さらに、すべてのヒト組織は、潜在的に感染し、適切な処置などなど 、手袋での作業のように、注意が必要であるとして処理する必要があります。

<table><tbody><tr><td colspan="4">試薬と材料</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15-842</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ダルベッコのPBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清-ゴールド</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>PAA</td><td>K41-001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>コラゲナーゼA</td><td>ロシュ</td><td>10 103 586 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DNase I、グレードIIウシ膵臓</td><td>ロシュ</td><td>10 10 104 159 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 10x in PBS</td><td>PAA</td><td>L11-001</td><td>ストック濃度 20 mg/ml</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit</td><td>Molecular Probes</td><td>A-10235</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>抗ヒトCDR2(精製)</td><td>Bruno Kyewski、DKFZ-ハイデルベルク、ドイツ</td><td></td>、<td>Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>anti-human CD45(パシフィックブルー)</td><td>で標識Biolegend</td><td></td> <td>304022&nbsp;</td></tr><tr><td>対ヒトEpCAM(APC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-254</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>抗ヒトCD11c(PE)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-411</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>抗PEマイクロビーズ</td><td>ミルテニーバイオテック</td><td>130-048-801</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>抗CD45マイクロビーズ、ヒト</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-801</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LSカラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>組織解離剤</td></tr><tr><td>Percoll 用 (密度 1.130 g/ml)</td><td>GE Healthcare, Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>滅菌蒸留水(DNAse/RNAseフリー)</td><td>GIBCO</td><td>10977-035</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Gamunex 10%</td><td>Tajecris-Biotherapeutics</td><td>G120052</td><td>1:10 プレ希釈、20 &mu;L/1 x 106セル</td></tr><tr><td>0.22 &mu;m フィルター</td><td>Millex GS</td><td>SLGS033SS</td><td>シリンジ駆動</td></tr><tr><td>Stericup フィルターユニット</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>ポンプ駆動</td></tr><tr><td>50 ml PC オークリッジ遠心分離管</td><td>Nalgene</td><td>3118-0050</td><td>50</td></tr><tr><td>ml 50 ml PP 円錐管</td><td>Becton Dickinson</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm 5 ml 試験管</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td>FACS stainings</td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &mu;m</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>352350</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">INSTRUMENTS</td></tr><tr><td>Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu)</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Evolution R6 (ローター)</td><td>ケンドロ</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ローテーター REAX 2</td><td>ハイドルフ</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>gentleMACS解離剤</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093 235</td><td>tissue dissociator</td></tr></tbody></table>

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

このプロトコルでは、ヒト胸腺から樹状細胞（DC）および上皮細胞（TEC）を単離する方法を提供する。 DCとTECは、主要な抗原提示細胞の正常胸腺に見られる（APC）型であり、それはよく、彼らは胸腺選択の際に異なる役割を果たしていることが確立されている。これらの細胞は、胸腺における異なる微小環境に局在化され、各APC型は、細胞のわずかな集団を構成している。さらに、これらの細胞型の生物学を理解するために、これらの細胞集団の特徴付けは非常に望ましいしかし、それらの低い周波数に、これらの細胞型のいずれかの単離は、効率的かつ再現可能な手順を必要とする。このプロトコルは、多様な細胞の性質の特性に適した細胞を得る方法を詳しく説明します。胸腺組織を機械的に破壊され、酵素消化の異なるステップの後に、得られた細胞懸濁液を、パーコール密度遠心分離工程を用いて濃縮される。骨髄DC（CD11cの単離のための&lt;商標&gt; +）、低密度画分（LDF）からの細胞を磁気細胞選別により免疫選択されている。 TEC集団（MTEC、CTEC）の濃縮は、特定の細胞マーカーを用いて細胞ソーティング（FACS）を蛍光活性化を介してそれらのその後の単離を可能にする低密度パーコール細胞画分からの造血の枯渇（CD45用Hi）細胞によって達成される。単離された細胞は、異なる下流の用途に使用することができる。

このプロトコルでは、出発物質として、我々はインフォームドコンセントの後に、制度的なガイドラインの下で得られた矯正心臓血管外科（学科胸部と心臓血管外科、大学クリニックチュービンゲン）を受けている子供から削除胸腺組織を使用しています。この廃棄された材料は2-30 g以上のサイズで大きく異なります。得られたMDCおよびTECサブセット（CTECとMTEC）の数は、サイズだけでなく、単離に使用胸腺組織サンプルの年齢に依存している。 図2（〜9 CM）6歳の子供から得られた組織のかなり大きな部分を示しています。このプロトコルの重要な最初のステップは、取（白矢印）の望ましくない部分からの組織の洗浄である。 単一パーコール密度遠心分離秒を用いて分離した単一細胞懸濁液を得るために、セクション2と3.1のプロトコルで概説した胸腺組織を処理したTEP単一細胞懸濁液を、一方パーコール遠心分離後に、このパーセンテージは15〜40％に、大型の細胞を含む、低密度画分（LDF）に増加し、HLA-DR +細胞（ <stro...

このプロトコルは、濃度の単一細胞懸濁液を遠心分離し、最後に、磁気および/または目的の細胞集団のFACS選別に続いて、組織の酵素消化の異なるステップを介して、ヒト胸腺から抗原提示細胞を単離する方法を詳述する。

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

本手順の全体的な目的は、ヒト胸腺から樹状細胞および上皮細胞を単離することです。まず、摘出した組織を機械的に破砕して断片化します。次に、組織断片をさらに酵素的に消化し、単一細胞懸濁液を作成します。最後に、Percoll分離により、細胞懸濁液から低密度分画の細胞を濃縮します。最終的に、磁気分離またはFACSソート、あるいはその両方を組み合わせることで、この分画から樹状細胞および上皮細胞を単離できます。本手法は、ヒト胸腺に存在する樹状細胞や胸腺上皮細胞のような希少な細胞集団を、効率的かつ再現性高く、また費用対効果に優れた方法で単離し、その後の研究に供するための手順を提供するものです。当研究室の大学院生であるI rottaが、この手順を実演します。まず、胸腺組織を室温の滅菌済みPBSを入れたペトリ皿に入れ、残存している血液を洗い流してください。次に、ペトリ皿に新鮮なPBSを加え、ピンセットと鋏を用いて、血栓、結合組織、脂肪組織、および健全ではないと思われる組織部分を除去します。胸腺組織を洗浄後、参照用に重量を測定し、組織を均一な1 cm³の大きさに切断します。次に、切断した組織をPBSで覆い、氷上に置きます。その後、10～20 mLの滅菌シリンジプランジャーの背面を用いて組織に軽く圧力を速やかに加え、胸腺細胞の大部分を除去し、消化させる組織の全体量を減らします。溶液が目に見えて濁ります。胸腺細胞が放出されたら、ディッシュを穏やかに撹拌し、組織片を誤って吸引しないように注意しながら、ガラスアスピレーターを用いて胸腺を含む上清を除去します。滅菌済みのセルカルチャースクレーパーを使用してすべての組織片をディッシュの片側に寄せ、ディッシュを45度の角度に傾けて残りの上清を吸引すると効率的です。ディッシュを新鮮なPBSで洗浄し、PBSが比較的透明になるまで上清の回収を続けます。最後にRPMIで洗浄し、鋭利なハサミを用いて、樹状細胞（dc）を単離するために5 mLピペットに入りきる程度の大きさまで、組織片をできるだけ細かく刻みます。まず、最大10 gのメッシュ状組織片を50 mLチューブに入れ、組織5 gあたり10 mLのコラゲナーゼDNA溶液と10 mLのRPMIを加えます。次に、組織懸濁液を37 °Cのサーマルインキュベーター内で、低速回転させながら40分間インキュベートします。細胞が放出されるにつれて、酵素溶液は濁った状態になります。消化終了後、細胞懸濁液を室温で110 ×gにて2分間遠心分離して組織断片を沈殿させ、上清を回収して細胞懸濁液をペレット化します。今回は上清を廃棄し、10から50 millilitersの完全RPMIで細胞を再懸濁します。ペレットの大きさに応じて、トリパンブルー排除法により生存細胞数を測定し、その後、胸腺上皮細胞（t.）を単離するために、キャップを緩めた状態で細胞懸濁液を37 degrees Celsiusに置きます。次に、組織残渣を、10 millilitersの新鮮なコラゲナーゼDNA溶液、および10 millilitersのRPMIとトリプシンEDTAに再懸濁します。組織片を37°Cで緩やかに回転させながら、さらに40分間消化します。インキュベーションの最後の10〜15分間に、トリプシンを中和させるため、1:5の比率で胎児牛血清を添加します。組織片をペレット化した後、上清を回収し、細胞懸濁液を再度遠心分離します。このとき、緩いペレットを消失させないように注意しながら、上清を慎重に吸引して廃棄します。生存細胞数をカウントした後、この細胞懸濁液も37°Cに置きます。低密度画分（LDF）細胞を濃縮するために、細胞を遠心分離している間に、あらかじめDCおよびtech濃縮用に取り分けておいた細胞懸濁液のペレット化を開始します。1.07 g/mLのPercoll密度勾配を調製します。この表に従い、両方のペレットを、調製したPercoll溶液6 mLを用いて1×10⁹ cellsまで再懸濁します。細胞溶液を十分に混合して均一な懸濁液とし、その後、溶液を50 mLのオークリッジ社製ポリカーボネート製スクリューキャップ遠心チューブに移します。次に、ピペットを使用して、各チューブのperca細胞懸濁液の上に完全RPMIを30 millilitersずつゆっくりと重層します。層が混ざらないように注意しながら、チューブを固定角ローターを備えた予冷 centrifuge に慎重に移し、35分間細胞を分離します。その後、滅菌済みのパステールピペットを用い、perca細胞と培地の界面から濃縮された低密度細胞画分を、冷やした完全RPMを含む50 milliliterチューブへ慎重に回収します。次に、チューブに完全RPMIを追加して、細胞あたりの残渣を希釈します。最後に、濃縮した細胞を完全RPMIで2回洗浄し、ペレットを新鮮な培地で再懸濁して、生存細胞数を測定します。この最初の図には、先ほど説明した通り、6歳の子どもから採取した約9cmのかなり大きな組織片が示されています。重要な第一歩は、組織から不要な部分を除去して洗浄することです。白矢印で示されているように、胸腺組織から単一細胞懸濁液を作製し、低密度画分細胞を濃縮しました。一般的な単一細胞懸濁液では、密度勾配分離後のH-L-A-D-R陽性細胞は約3%ですが、大型細胞においてはこの割合が15から40%まで増加します。高密度画分中の低密度画分は、主に均一な小型の胸腺細胞で構成されています。そのような胸腺細胞は実質的に存在しません。骨髄系樹状細胞は、CD 11 Cを含む多くの表面マーカーの発現によって同定できます。この図は、分離後の修正磁気細胞分離プロトコルを用いたCD 11 C陽性細胞の効率的な単離を示しています。単離した細胞の免疫染色により、CD 11 C陽性DCの純度は93%であることが確認されました。平均して、単離されたCD 11 C陽性細胞の回収率は、総胸腺細胞10⁹個あたり5×10⁵から5×10⁶個の骨髄系樹状細胞です。この表では、さまざまな年齢および組織重量の複数の個別の胸腺サンプルから得られた代表的なデータを示しています。これには、入力単一細胞懸濁液の範囲、全低密度画分の細胞数、およびその後の抗原提示細胞濃縮画分のみにおけるCD11c陽性細胞の回収率と純度が含まれます。細胞の約0.5%はCD45低発現EPCA陽性またはCD45陰性EPAM陽性の皮質上皮細胞であり、トリプシン消化したCD45低発現・陰性濃縮ストローマ細胞から、それぞれEPAM低発現CD2陽性およびEPAM高発現CD2陰性として髄質上皮細胞を分取することができます。ヒト胸腺からの樹状細胞および胸腺上皮細胞サブセットの分取について説明します。本手法は時間に制約があります。解離操作が迅速であるほど、細胞の状態は良好に保たれます。このプロトコルを習得すれば、樹状細胞は5～6時間以内に、胸腺上皮細胞は8～10時間以内に単離することが可能です。本日のビデオを視聴することで、樹状細胞および胸腺上皮細胞を正常に単離するためのヒト胸腺組織の取り扱い方法について、十分に理解していただけるはずです。単離した細胞は、細胞の特性評価や生物学的理解を深めるための、その後の多くのさまざまなダウンストリームアプリケーションに使用することが可能です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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マウス肺樹状細胞の分離

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ヒトCD14+ 単球から寛容性樹状細胞を作製するための免疫調節剤を試験するための簡便で効率的な方法

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ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

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