ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

本手順の全体的な目的は、ヒト胸腺から樹状細胞および上皮細胞を単離することです。まず、摘出した組織を機械的に破砕して断片化します。次に、組織断片をさらに酵素的に消化し、単一細胞懸濁液を作成します。

最後に、Percoll分離により、細胞懸濁液から低密度分画の細胞を濃縮します。最終的に、磁気分離またはFACSソート、あるいはその両方を組み合わせることで、この分画から樹状細胞および上皮細胞を単離できます。本手法は、ヒト胸腺に存在する樹状細胞や胸腺上皮細胞のような希少な細胞集団を、効率的かつ再現性高く、また費用対効果に優れた方法で単離し、その後の研究に供するための手順を提供するものです。

当研究室の大学院生であるI rottaが、この手順を実演します。まず、胸腺組織を室温の滅菌済みPBSを入れたペトリ皿に入れ、残存している血液を洗い流してください。次に、ペトリ皿に新鮮なPBSを加え、ピンセットと鋏を用いて、血栓、結合組織、脂肪組織、および健全ではないと思われる組織部分を除去します。

胸腺組織を洗浄後、参照用に重量を測定し、組織を均一な1 cm³の大きさに切断します。次に、切断した組織をPBSで覆い、氷上に置きます。その後、10～20 mLの滅菌シリンジプランジャーの背面を用いて組織に軽く圧力を速やかに加え、胸腺細胞の大部分を除去し、消化させる組織の全体量を減らします。

溶液が目に見えて濁ります。胸腺細胞が放出されたら、ディッシュを穏やかに撹拌し、組織片を誤って吸引しないように注意しながら、ガラスアスピレーターを用いて胸腺を含む上清を除去します。滅菌済みのセルカルチャースクレーパーを使用してすべての組織片をディッシュの片側に寄せ、ディッシュを45度の角度に傾けて残りの上清を吸引すると効率的です。

ディッシュを新鮮なPBSで洗浄し、PBSが比較的透明になるまで上清の回収を続けます。最後にRPMIで洗浄し、鋭利なハサミを用いて、樹状細胞（dc）を単離するために5 mLピペットに入りきる程度の大きさまで、組織片をできるだけ細かく刻みます。まず、最大10 gのメッシュ状組織片を50 mLチューブに入れ、組織5 gあたり10 mLのコラゲナーゼDNA溶液と10 mLのRPMIを加えます。

次に、組織懸濁液を37 °Cのサーマルインキュベーター内で、低速回転させながら40分間インキュベートします。細胞が放出されるにつれて、酵素溶液は濁った状態になります。消化終了後、細胞懸濁液を室温で110 ×gにて2分間遠心分離して組織断片を沈殿させ、上清を回収して細胞懸濁液をペレット化します。

今回は上清を廃棄し、10から50 millilitersの完全RPMIで細胞を再懸濁します。ペレットの大きさに応じて、トリパンブルー排除法により生存細胞数を測定し、その後、胸腺上皮細胞（t.）を単離するために、キャップを緩めた状態で細胞懸濁液を37 degrees Celsiusに置きます。次に、組織残渣を、10 millilitersの新鮮なコラゲナーゼDNA溶液、および10 millilitersのRPMIとトリプシンEDTAに再懸濁します。

組織片を37°Cで緩やかに回転させながら、さらに40分間消化します。インキュベーションの最後の10〜15分間に、トリプシンを中和させるため、1:5の比率で胎児牛血清を添加します。組織片をペレット化した後、上清を回収し、細胞懸濁液を再度遠心分離します。

このとき、緩いペレットを消失させないように注意しながら、上清を慎重に吸引して廃棄します。生存細胞数をカウントした後、この細胞懸濁液も37°Cに置きます。低密度画分（LDF）細胞を濃縮するために、細胞を遠心分離している間に、あらかじめDCおよびtech濃縮用に取り分けておいた細胞懸濁液のペレット化を開始します。

1.07 g/mLのPercoll密度勾配を調製します。この表に従い、両方のペレットを、調製したPercoll溶液6 mLを用いて1×10⁹ cellsまで再懸濁します。細胞溶液を十分に混合して均一な懸濁液とし、その後、溶液を50 mLのオークリッジ社製ポリカーボネート製スクリューキャップ遠心チューブに移します。

次に、ピペットを使用して、各チューブのperca細胞懸濁液の上に完全RPMIを30 millilitersずつゆっくりと重層します。層が混ざらないように注意しながら、チューブを固定角ローターを備えた予冷 centrifuge に慎重に移し、35分間細胞を分離します。その後、滅菌済みのパステールピペットを用い、perca細胞と培地の界面から濃縮された低密度細胞画分を、冷やした完全RPMを含む50 milliliterチューブへ慎重に回収します。

次に、チューブに完全RPMIを追加して、細胞あたりの残渣を希釈します。最後に、濃縮した細胞を完全RPMIで2回洗浄し、ペレットを新鮮な培地で再懸濁して、生存細胞数を測定します。この最初の図には、先ほど説明した通り、6歳の子どもから採取した約9cmのかなり大きな組織片が示されています。

重要な第一歩は、組織から不要な部分を除去して洗浄することです。白矢印で示されているように、胸腺組織から単一細胞懸濁液を作製し、低密度画分細胞を濃縮しました。一般的な単一細胞懸濁液では、密度勾配分離後のH-L-A-D-R陽性細胞は約3%ですが、大型細胞においてはこの割合が15から40%まで増加します。

高密度画分中の低密度画分は、主に均一な小型の胸腺細胞で構成されています。そのような胸腺細胞は実質的に存在しません。

骨髄系樹状細胞は、CD 11 Cを含む多くの表面マーカーの発現によって同定できます。この図は、分離後の修正磁気細胞分離プロトコルを用いたCD 11 C陽性細胞の効率的な単離を示しています。単離した細胞の免疫染色により、CD 11 C陽性DCの純度は93%であることが確認されました。平均して、単離されたCD 11 C陽性細胞の回収率は、総胸腺細胞10⁹個あたり5×10⁵から5×10⁶個の骨髄系樹状細胞です。

この表では、さまざまな年齢および組織重量の複数の個別の胸腺サンプルから得られた代表的なデータを示しています。これには、入力単一細胞懸濁液の範囲、全低密度画分の細胞数、およびその後の抗原提示細胞濃縮画分のみにおけるCD11c陽性細胞の回収率と純度が含まれます。細胞の約0.5%はCD45低発現EPCA陽性またはCD45陰性EPAM陽性の皮質上皮細胞であり、トリプシン消化したCD45低発現・陰性濃縮ストローマ細胞から、それぞれEPAM低発現CD2陽性およびEPAM高発現CD2陰性として髄質上皮細胞を分取することができます。ヒト胸腺からの樹状細胞および胸腺上皮細胞サブセットの分取について説明します。

本手法は時間に制約があります。解離操作が迅速であるほど、細胞の状態は良好に保たれます。このプロトコルを習得すれば、樹状細胞は5～6時間以内に、胸腺上皮細胞は8～10時間以内に単離することが可能です。

本日のビデオを視聴することで、樹状細胞および胸腺上皮細胞を正常に単離するためのヒト胸腺組織の取り扱い方法について、十分に理解していただけるはずです。単離した細胞は、細胞の特性評価や生物学的理解を深めるための、その後の多くのさまざまなダウンストリームアプリケーションに使用することが可能です。