生理フローの状況の下で循環細胞のケモカイン指向溢出を研究する新規三次元フローチャンバーデバイス

本実験の全体的な目的は、ケモカイン濃度勾配に対する循環細胞の遊走を定量的に測定することである。生理的なせん断応力条件下においてこれを実現するため、まずコラーゲンコートした微多孔性インサート上に内皮細胞の単層を培養し、次にそれらをフローチャンバーに組み込んで、ケモカインを含む別の静止コンパートメントを覆うように配置する。その後、血管内の生理的条件を模倣するために、細胞にせん断応力を負荷する。

第2段階として、白血球幹細胞や腫瘍細胞などの目的のテスト細胞を3Dシステム内で循環させます。静止区画内の成分は、循環細胞と内皮細胞との相互作用の効率に影響を与え、その結果、テスト細胞の内皮層を介した遊走速度を左右します。次に、3Dシステムを分解し、下層の静止区画から遊走したテスト細胞を回収して、最新のさまざまな手法を用いて細胞数を定量的に測定します。これにより、静止区画内のケモカイン濃度に基づき、循環するテスト細胞が生理学的血流条件下で内皮細胞と相互作用し、血流から脱出する能力を示す結果が得られます。

並行ラミナフローチャンバーや静的転移アッセイなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、上層コンパートメントにおける剪断応力と下層の静止コンパートメントにおけるケモカインの両方を組み合わせることができる点にあります。これにより、研究者は生理学的フローの条件下で、循環細胞のケモカイン勾配に対する外部流出を定量的に測定することが可能になります。また、本手法は、局所微小環境の細胞と血管内皮細胞との間のクロストークが循環細胞の血管外遊出に及ぼす影響を研究するためにも利用できます。

内皮細胞の下に別のインサートを用いて細胞の追加層を構築する手順を、当研究室の技術者であるValentina against rovaが実演します。まず、実験に必要なインサートの数を算出し、各インサートを個別の滅菌済みペトリ皿に配置します。個別のセットアップに基づき、総線量が11 grayに達するまでガンマ線照射により滅菌します。

次に、ストックのcollagen Type one溶液を、4°Cで保存した0.01 molar塩酸を用いて50 micrograms per milliliterに希釈し、各インサート用に最終溶液を154 microliterずつ分注して準備します。続いて、この溶液を数滴、インサートの表面に円を描くように滴下します。

次に、残りの分注液を加え、インサート表面に大きな滴を1つ形成させます。ピペットチップがどの時点でもインサートに触れないようにし、コラーゲンがインサートの表面全体を覆い、かつ流れ出さないようにしてください。インサートが覆われたら、ペトリ皿に蓋をし、平らな面に慎重に置きます。

インサートを室温で1時間インキュベートした後、コラーゲン溶液を吸引し、160 µLのPBSでメンブレンを洗浄します。次に、PBSを吸引します。蓋を閉め、ディッシュをパラフィルムで密封します。

インサートを同日に使用する場合は、ペトリ皿を室温の乾燥した場所に保管します。それ以外の場合は、ペトリ皿を4 °Cで保存し、7日以内にインサートを使用してください。培養したヒト臍帯静脈内皮細胞は使用直前に回収し、目的の培養液を用いて2.5 million cells/mLの濃度で再懸濁します。

細胞数をカウントする際、トリパンブルーを用いて細胞生存率が98%以上であることを確認し、各インサートに細胞懸濁液を160 µLずつ加えます。まず、コラーゲンコートしたインサートの表面に小さな液滴を円状に数滴滴下し、その後、残りの細胞懸濁液を慎重に加えて大きな1滴にします。完了後、蓋を閉め、37 °C、5% 二酸化炭素濃度のインキュベーターにディッシュを慎重に設置し、細胞がメンブレンに接着するまで30分間インキュベートします。

30分後、プレートをインキュベーターから取り出し、各インサートに予熱した培養液5 mLを静かに加えます。この際、インサートがディッシュの底にとどまり、培養液で完全に覆われていることを確認してください。その後、蓋を閉め、ディッシュを注意深くインキュベーターに戻して培養します。

細胞を37°Cで一晩培養します。フローチャンバーを組み立てるには、まず上プレートと下プレートをネジで固定します。次に、内径1.42 mm、肉厚0.8 mmのPVCチューブを使用して、プレートをガス交換ユニットに接続します。

次に、組み立てたデバイスを清潔なプラスチック袋に入れ、総線量が 11 gray に達するまでガンマ線照射により滅菌します。次のステップでは、インキュベーター用トレイを取り出し、滅菌済みの組織培養フード内に配置し、70%ethanol で滅菌します。その後、トレイを大きな滅菌ナプキンで覆います。

次に、デバイスをプラスチック袋から取り出し、滅菌済みのインキュベーター用トレイに置きます。その後、デバイスをペリスタティックポンプに接続し、ポンプの流速を0.2 milliliters per minuteに設定します。入口として使用する滅菌済みの15 milliliterチューブに、目的の培養液を5〜7 millilitersピペッティングします。

次に、チューブの無菌性を維持するため、小さな滅菌ナプキンを使用してチューブから金属製ニードルを抜き取り、入口チューブを出口から切り離します。金属製の入口ニードルを培地が入った15 mLチューブに挿入し、出口チューブを空の15 mLチューブに挿入します。続いてポンプを起動し、流れを反時計方向にします。陰圧によって培地が15 mLの入口チューブからチューブ内へ吸い上げられるようにし、培地がデバイスに入る直前のチューブの末端に到達した時点でポンプを停止させます。

次に、チューブプレートのネジを外して装置を開き、慎重に上部プレートを取り除きます。下部のウェルに1,500〜1,550 µLの培地を分注し、下部プレートから1〜2 mm上の高さまで半球状になる十分な量の培地が入っていることを確認します。次に、シャーレで準備したインサートを下部プレートのウェルに移します。滅菌済みピンセットを使用して、インサートの下に気泡が閉じ込められていないことを確認し、下部プレートの表面に現れた余分な培地を吸引します。

次に、上部プレートを下部プレートに戻して再接続します。ネジで固定した後、すぐにペリスタルティックポンプを起動させ、3Dデバイス内に培地を流します。プレート間の空間に気泡が形成されるのを防ぐため、デバイスの流出口側を高くし、チャンバーをこの状態で保持してください。

チャンバーとガス交換ユニットを接続するチューブに、培地がガス交換ユニットに到達するまで満たし続けます。次に、ガス交換ユニットに3 mLの培地を入れます。ポンプを起動し、気泡を排出させます。

培地がそこから出るチューブを満たすようにユニットを高くし、培地が終端の2〜3 cm前まで到達したところでポンプを停止させます。完全にプライミングされたら、滅菌済みの小型ナプキンを使用して、入口針を出口チューブに接続します。次にポンプを逆転させ、培地をガス交換ユニットに向かって時計回りに流し、残っている気泡をすべて除去します。

ポンプを再び反時計回りに回します。テスト用の細胞懸濁液100 µLをガス交換ユニットに加えます。その後、レスピレーターの蓋を閉じます。

トレイをインキュベーターに戻し、37 °Cでデバイス内をテスト細胞が循環するようにします。所定の時間が経過したら、作動中のシステムが入ったトレイをインキュベーターから取り出し、フード内に置きます。ポンプを停止させ、入口と出口のチューブを切り離し、その端を滅菌済みの空の15 mLチューブに入れます。

次にポンプを起動し、システムから細胞懸濁液を回収します。細胞懸濁液は使用するまで氷上に置いてください。続いて、ネジを取り外して上プレートを持ち上げ、チャンバーを分解します。

インサートを下層プレートから取り出し、染色または細胞回収のためにペトリ皿に移します。最後に、下層ウェルから細胞懸濁液を回収し、15 milliliterチューブに移します。各ウェルを1.5 millilitersの培地で2回洗浄し、それをそれぞれのチューブに加えます。

次に、チューブを200 Gで5分間遠心分離し、提示されている付随のテキストプロトコルに記載されているような、特定の実験目的に応じて細胞を処理します。ここでは、このシステムを用いて実施可能な多くの試験の一例を示します。セットアップは、5 µmのポアを持つインサート上で培養した骨髄由来血管内皮細胞のミラーリング構成であり、インサートの下側に stromal cell derived factor 1（SDF-1）を 0、5、または 50 ng/mL の濃度で添加しました。

骨髄細胞を3Dシステム内で循環させた。インサートを通過して遊走した細胞を回収し、メチルセルロース培地を用いてプレート上で培養した。造血成長因子により前駆細胞がコロニーを形成させた後、14日後にコロニー数をカウントし、各ウェルにおける前駆細胞の数およびsdfに向かって遊走する能力を評価した。

一方、生理的血流条件下では、静止チャンバーの下部インサートで培養した基質線維芽細胞を添加した状態でsdf 1を50 nanograms per milliliter添加すると、SDF 1単独の場合よりも多くの造血細胞が循環系からチャンバー内へ遊走しました。本手法の開発により、医学および生物科学の様々な分野の研究者が、組織特異的な血管床をin vitroでモデル化し、循環細胞が正常組織および病変組織へと遊走する細胞・分子メカニズムを探索することが可能となりました。