3.10: 酵母の核酸分離

今日は、パン酵母としても知られるSaccharomyces cerevisiaeから核酸を精製する方法を紹介します。核酸には、DNAまたはRNAが含まれることがあります。このビデオでは、相分離とクロマトグラフィーによる酵母細胞からのこれらの分子の単離について説明します。

酵母から核酸を精製する方法は数多くありますが、そのほとんどが初期段階を共有しています。

酵母細胞は、まずプレートから単一のコロニーを選択し、YPD培地に接種することによって増殖します。混合物は30歳で一晩育てるべきですか?振とうまたは回転するインキュベーター内のC。

酵母細胞は、収量を最適化するために、成長の中間対数期に収穫する必要があります。成長の対数期の酵母は、600nmの波長で測定すると、通常、光学密度または「OD」値が0.5〜1になります。 細胞が適切な光学密度に達したら、細胞を遠心分離してペレットを形成し、溶解バッファーに再懸濁して細胞を壊して開きます。

酵母から核酸を単離する上で最も困難な側面の1つは、その強靭な細胞壁を破壊することです。細胞壁は、酵素的手法と物理的手法の組み合わせで破壊することができます。 細胞壁が破壊されると、酵母はスフェロプラストと呼ばれるスフェロイド細胞を形成し、標準的な細胞溶解技術で溶解することができます。

スフェロプラストは通常、細胞膜を溶解するドデシル硫酸ナトリウムやSDSなどの化学界面活性剤で溶解されます。 細胞は均質化することもできます。例えば、ガラスビーズを細胞に添加したり、ボルテックスによって均質化された細胞に添加することができます。 または、ソニケーターを使用して超高周波音で細胞壁を破壊し、溶解プロセスを助けることができます。

前述のように、酵母で行われるすべての核酸精製手順には、酵母細胞の増殖、回収、および溶解のための同様の手順がありますが、細胞が溶解されると、いくつかの異なる方法を使用して核酸を単離できます。 核酸は、カラム結合または相分離によって精製できます。

DNAとRNAは、シリカカラム結合を使用して最適に単離します。核酸は陰イオン交換によってカラムに結合し、他の細胞成分から分離するとカラムから溶出できます。

相分離は、異なる特性を持つ溶液を使用して、その溶解度に基づいて特定のタンパク質または核酸を精製または濃縮できるという原理を使用します。クロロホルムを添加すると、細胞成分のスラリーが水性と有機性の2つの異なる相に分化します。有機相にはタンパク質が含まれ、水相には核酸が含まれています。 その後、DNAはエタノールを添加して有機相から沈殿させることができます。

核酸は、カラム結合プロトコールを使用して酵母から単離できます。まず、細胞を成長させ、遠心分離によって回収します。

上清を除去して廃棄する間、細胞ペレットを酵素含有緩衝液に再懸濁し、ボルテックスし、細胞壁が消化されるまでインキュベートします。 細胞壁の消化とスフェロプラストの形成は、酵素処理を最適化する際に顕微鏡で確認することができます。細胞壁消化後、溶解バッファーを細胞に添加し、混合物をボルテックスします。

溶解した細胞を遠心分離して破片の混合物を清澄化し、上清にDNAと小さな微粒子および可溶性タンパク質を残す必要があります。 上清をシリカカラムにロードし、遠心分離後に核酸を結合させることで、可溶性不純物の大部分を除去します。

エタノールまたは高塩緩衝液を使用して洗浄ステップを実行し、結合した核酸から残留不純物を除去します。最後に、DNAまたはRNAを水または塩分を含まない緩衝液で溶出します。必ず、酵素DNAseおよびRNAseを含まないバッファーまたは水を使用してください。

酵母から単離された核酸は、特定の実験目標に応じてさまざまな用途があります。 酵母から単離されたDNAは、PCR、サザンブロッティング、制限酵素消化など、さまざまな分子生物学的手法に使用できます。

遺伝子発現の変化は、このような遺伝子アレイを使用するマイクロアレイ解析と呼ばれるプロセスによって特定できます。

過酸化水素に曝露された酵母培養物とコントロール培養物の2つの酵母培養物がある場合、これらの培養物からmRNAを単離し、マイクロアレイスライド上でハイブリダイズすることができます。 スライドを解析し、酸化ストレスによって修飾された遺伝子を同定することができます。

このビデオでは、研究者がロボットシステムを利用して、遺伝子機能の評価に使用されるゲノムワイド酵母変異体のライブラリを調製します。遺伝子バーコードと呼ばれる特別に設計された配列を遺伝子に挿入するため、変異株のゲノムDNAを4,000〜6,000人から同時に抽出し、マイクロアレイ解析またはシーケンシングを行うことができます。 バーコード配列の相対的な存在量に基づいて、各変異体の適応度は、複数の実験条件下で決定できます。

JoVEの酵母からの核酸の単離に関するビデオをご覧になりました。これで、酵母細胞を溶解するための調製方法や、さまざまな抽出および単離手順の実行方法など、核酸の精製の基本的な側面を理解できるようになったと思います。いつものように、ご覧いただきありがとうございます!