酵母をモデル生物として用いる利点の一つは、酵母が核酸(DNAとRNA)を含む多量の生体高分子を持ち、それらが培養細胞から精製可能であることです。
このビデオは、核酸抽出のために必要となるステップを中心として進んでいきます。まず始めに、すべての生体高分子の分離に共通したステップである培養、集菌そして酵母細胞の溶解法について簡単に説明しています。次に2種類の核酸分離法: カラム吸着、層分離、ついて説明しています。それに加え、実際に実験に用いられる、PCRやサザンブロット、環境刺激に対する遺伝子発現の定量、そして多量の組み換えタンパクの精製といった分子生物学的手法をいくつか紹介しています。
これからパン酵母として知られる出芽酵母の核酸精製法について見ていきましょう。DNA、RNAは共に核酸です。 このビデオでは、相分離とクロマトグラフィを用いた酵母細胞からの核酸分離についてお話します。
核酸分離にはいろいろな方法がありますが、始めの工程はどれも共通しています。
まず培地からシングルコロニーを取り出しYPD培地に埴菌して、酵母細胞を繁殖させます。 その混合物を30度で一晩、シェーカーまたはローテーターを使ってインキュベートします。
酵母は、対数増殖期半ばに採取するのが理想的です。 対数増殖期の酵母では、波長600ナノメートルで測定した光学濃度、ODが0.5から1になります。 最適な細胞密度に達したら、細胞ペレットを遠心分離で回収し、ライシスバッファーで再懸濁させ細胞を壊します。
酵母から核酸精製する際に最も大変なのは、強固な細胞壁を破壊することです。 この細胞壁は、酵素処理と物理的手法を用いて壊していきます。 細胞壁を壊すと、酵母はスフェロプラストと呼ばれる球状細胞を形成し、通常の方法を用いて細胞溶解することができるようになります。
通常スフェロプラストは、細胞膜を溶解するドデシル硫酸ナトリウム、SDSのような化学洗剤を用いて溶解させます。 ガラスのビーズを細胞に加え、ボルテックスでホモジナイズすることもできます。 あるいは、細胞溶解を速めるためソニケーターで超音波処理し、細胞壁を破壊するのも効果的です。
ここまでの核酸精製工程は、増殖、採取、細胞溶解とみな同じステップを踏んできましたが、この後の過程でいくつかの異なる方法が用いられます。 核酸はカラム吸着や相分離によって精製することができます。
DNA、RNAの分離にはシリカカラム吸着が最適です。 陰イオン交換により核酸だけがカラムに吸着し、その後溶出させることができます。
相分離は、溶液の純度の違いや、タンパク質濃度の違い、あるいは核酸の溶解性の違いを利用した方法です。 クロロホルムを加え、細胞成分をスラリ―状にし、水層と有機層に分けることができます。 タンパク質は有機層に核酸は水層に分かれます。 さらに、有機層にエタノールを加えることでDNAを沈殿させることができます。
酵母の核酸はカラム吸着法により分離できます。 まず、細胞を育て、遠心分離により細胞を回収します。
上清部分を除き、細胞ペレットを酵素含有バッファーに再懸濁、撹拌し細胞壁が分解されるまでインキュベートします。 適切に酵素処理されていると、細胞壁の破壊とスフェロプラストの形成が顕微鏡で確認できます。 その後バッファーを加え、混合物を撹拌します。
上清部分のDNA、微粒子、可溶性タンパクなどのデブリを除去するため、細胞溶解液を遠心分離します。 上清をシリカカラムにかけると、不純物の大半を除け、核酸だけが吸着します。
吸着した核酸から残りの不純物を取り除くため、エタノール又は高塩濃度バッファーで洗っていきます。 そしてDNA、RNAを水、又は低塩濃度バッファー中に溶出させます。 ここではDNA及びRNA分解酵素を含まないバッファー、又は水を用います。
酵母から分離した核酸は、様々な研究に応用できます。 PCR,サザンブロット、制限酵素処理など多くの分子生物学的手法に適用されます。
ここにあるように遺伝子解析するためのマイクロアレイにより遺伝子変化を調べることができます。
ここに過酸化水素により刺激した酵母とそうでない通常の酵母があります。 これらの酵母からmRNAを抽出しマイクロアレイを行います。これにより酸化ストレスで制御される遺伝子群を調べることができます。
ここでは、ロボットシステムを使って野生酵母突然変異株のライブラリーを作製しています。 遺伝子バーコードと呼ばれる固有の遺伝子配列を組み込むことで、同時に4000から6000株もの遺伝子変異を起こした酵母DNAを抽出することができ、マイクロアレイ解析やシークエンンシングにかけられます。 バーコード配列の相対存在量をもとに、その個々の遺伝子変異株の適合性をいくつかの実験条件下で決定することができます。
今回のJoVE酵母の核酸分離編では、酵母を溶解するための準備方法や様々な抽出、分離方法について学びました。ご覧いただきありがとうございました。
Today we will be showing you how to purify nucleic acids from Saccharomyces cerevisiae, also known as baker’s yeast. Nucleic acids can include DNA or RNA. This video will discuss the isolation of these molecules from yeast cells by phase separation and chromatography.
Though many different methods exist to purify nucleic acids from yeast, most of them share the same initial steps.
Yeast cells are first propagated by selecting a single colony from a plate and inoculating into YPD media. The mixture should be grown overnight at 30 °C in a shaking or rotating incubator.
Yeast cells should be harvested in the mid-log phase of growth to optimize yield. Yeast in the log phase of growth will usually have an optical density or “OD” value of 0.5-1 when measured at a wavelength of 600 nm. Once cells have reached the appropriate optical density, they are centrifuged to form a pellet, and resuspended in lysis buffer so that cells are broken open.
One of the most challenging aspects of isolating nucleic acids from yeast is disrupting its tough cell walls. Cell walls can be destroyed with a combination of enzymatic and physical techniques. The destruction of the cell wall causes yeast to form spheroid cells called spheroplasts that can be lysed via standard cell lysis techniques.
Spheroplasts are typically lysed with chemical detergents such as sodium dodecyl sulfate or SDS, which lyse cellular membranes. Cells can also be homogenized. For instance, glass beads can be added to cells and cells homogenized by vortexing. Or cell walls can be disrupted with ultra-high frequency sound, using a sonicator, to aid in the lysis process.
As mentioned all nucleic acid purification procedures done in yeast will have similar steps for growing up, harvesting, and lysing yeast cells, however once cells are lysed, several different methods can be used to isolate nucleic acids. Nucleic acids can be purified through column binding or phase separation.
DNA and RNA are best-isolated using silica column binding. Nucleic acids will bind to the column through anion exchange and can be eluted from the column once separated from other cellular components.
Phase separation uses the principle that solutions with different properties can be used to purify or concentrate certain proteins or nucleic acids based on their solubility. The addition of chloroform differentiates a slurry of cell components into two different phases, the aqueous and organic. The organic phase contain proteins while the aqueos phase contains nucleic acids. The DNA can then be precipitated from the organic phase with the addition of ethanol.
Nucleic acids can be isolated from yeast using a column binding protocol. First, cells are grown up and harvested by centrifugation.
The supernatant is removed and discarded while the cell pellet is resuspended in enzyme-containing buffer, vortexed, and incubated until cell walls are digested. Cell wall digestion and spheroplast formation can be verified with microscopy when optimizing enzyme treatment. After cell wall digestion, lysis buffer is added to the cells and the mixture is vortexed.
The lysed cells should be centrifuged to clarify the mixture of debris, leaving DNA and small particulates and soluble proteins in the supernatant. The supernatant is loaded onto a silica column and nucleic acids are then allowed to bind following centrifugation, which will remove a bulk of the soluble impurities.
Washing steps are performed with ethanol or high salt buffer to remove residual impurities from the bound nucleic acids. Finally, the DNA or RNA is eluted with water or a buffer low in salt. Be sure to use a buffer or water that is free of the enzymes DNAse and RNAse.
Nucleic acids isolated from yeast have a variety of uses depending on your specific experimental goal. DNA isolated from yeast can be used for a number of different molecular biology techniques including: PCR, southern blotting, or restriction enzyme digestion.
Changes in gene expression can be identified by a process known as microarray analysis, which uses gene arrays like this one.
If we have two yeast cultures, one exposed to hydrogen peroxide and one a control, mRNA can be isolated from these cultures and hybridized on microarray slides. The slides are analyzed and the genes that are modified by oxidative stress can be identified.
In this video, researchers make use of a robotic system to prepare a library of genome-wide yeast mutants, which are used to evaluate gene function. Due to the insertion specifically-engineered sequences, called genetic barcodes, into genes genomic DNA from mutant strains can be extracted from 4,000 to 6,000 individuals simultaneously and subjected to microarray analysis or sequencing. Based on the relative abundance of the barcode sequences, the fitness, of each mutant can be determined under multiple experimental conditions.
You’ve just watched JoVE’s video on isolating nucleic acids from yeast. You should now understand the basic aspects of purifying nucleic acids such how to prepare yeast cells for lysis and how to perform different extraction and isolation procedures. As always, thanks for watching!
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