Name: 潜在的な土壌菌体外酵素の活動のハイスループット蛍光測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-15T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: 学ぶ土壌菌体外酵素の蛍光測定法。深穴プレートを用いたハイスループット分析で、蛍光色素遊離速度から酵素活性を定量化し、微生物生態学と土壌生物地球化学の研究に活用できます。

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本書は、米国国立科学財団（DEB番号1021559）でサポートされる環境研究調整ネットワーク研究中の酵素によって資金を供給された。この研究は、米国国立科学財団（DEB番号1021559）、およびエネルギー省科学局（生物環境研究）の米国部門によってサポートされていました。本資料に表明いかなる意見、発見、結論や提言は、著者自身によるもので、必ずしも米国NSFの見解を反映するものではありません。

1。アッセイセットアップ<ol><li>ラベル3ディープウェルプレート：「サンプル」、「MUB標準」、および「MUCスタンダード」。 </li><li>各標準（0のMUB、2.5、5、10、25、50、および100μM）と基板（BG、CB、NAG、PHOS、XYL、AG、LAPは）（行指向）は、別々のきれいな、前標識貯水池に注ぐ。 </li><li> MUB標準プレート（ 表1）の対応するウェルに適切なMUB標準をピペット。 <ol><li>ピペットMUB標準プレートの列Aに0μMMUB200μlの。 </li><li>ピペットMUB標準プレートの列Bに2.5μMMUB200μlの。 </li><li>ピペットMUB標準プレートの列Cに5μMMUB200μlの。 </li><li>ピペットMUB標準プレートの列Dに、10μMMUB200μlの。 </li><li> MUB標準プレートの列Eピペット25μMのMUB200μlの。 </li><li>ピペット50μMのMUB標準プレートの列FにMUB200μlの。 </li><li> 100μのピペット200μLMUB標準プレートの列GへのM MUB。 </li><li> MUC標準プレートの対応するウェルにMUC規格の1.3.8 - を繰り返して、1.3.1を繰り返します。 </li></ol></li><li>各土壌サンプルのための準備土壌スラリー。 <ol><li>ブレンダーにフィールド湿った土の2.75グラムを秤量する。 </li><li> 50 mMのバッファの91ミリリットルを追加します。 1分間ハイにブレンド。 </li><li>少なくとも同じ幅攪拌棒付きの8チャンネルピペットなどの清浄なガラスボウルにブレンダーの内容を注ぐ。 </li><li>低オン土壌スラリーを混合、撹拌プレート上に置きます。 </li><li>ピペットサンプルプレート（ 表2）の最初のカラムに土壌スラリー800μlの。 </li><li> MUB標準およびMUC標準プレート（ 表1）の1 列目に繰り返す。 </li><li> DI H 2 Oでブレンダー、撹拌プレートおよび撹拌棒をすすぐか、土壌試料との間のバッファ。 </li><li>後続の各土壌サンプル（ 表1を次の列に移動し、各サンプルについて）1.4.7と-を繰り返して、1.4.1ステップ2）。 </li></ol></li><li>サンプルプレート（ 表2）の対応するウェルに、適切な基質（この例では、200μMの濃度）をピペット。 <ol><li>ピペットサンプルプレートのA列にはBG基板200μlの。 </li><li>ピペットサンプルプレートの列BにCB基板を200μl。 </li><li>ピペットサンプルプレートの列CにNAG基板200μlの。 </li><li>ピペットサンプルプレートの列DにPHOS基板200μlの。 </li><li>ピペットサンプルプレートの列EにXYL基板200μlの。 </li><li>サンプルプレートの行のFピペットAG基板200μlの。 </li><li>サンプルプレートの列GピペットLAP基質200μlの。 </li><li>各インキュベーション温度サンプル版用1.5.7 - を繰り返して、1.5.1を繰り返します。 </li></ol></li></ol> 2。アッセイプレートのインキュベーション<ol><li>ディープウェルプレート（「サンプル」、「MUB標準」、および「MUC標準を封印プレートマットで4 ;)。 </li><li>溶液が完全に混合されるまで、手でそれぞれの（密閉）プレートを反転（〜10倍）。 </li><li>必要なインキュベーション時間（ 表3）のために適切な培養器でプレートを置きます。 </li><li>時間0として初期時間を記録します。インキュベーター（ 表3）から、プレートを削除するときに知っているので、適切なインキュベーション時間を記録します。 </li><li>それぞれのインキュベーション期間、遠心〜2,900×gで3分間、シールしたプレートの端で。 </li><li>認証の後に、（一方黒色プレートをインキュベートし、各ディープウェルプレートのために使用される）、黒色平底96ウェルプレートの対応するウェル中でインキュベートディープウェルプレートの各ウェルから250μlのを転送する。なお、黒色平底96ウェルプレートの同じウェル（ すなわち、A1 ... A12 など ）中にインキュベートしたディープウェルプレートからサ ​​ンプルを転送することが重要である（ 表1,2）。 </li></ol> 3。蛍光測定にマイクロプレート蛍光光度計<ol><li>使用される蛍光プレートリーダーのための製造業者の使用説明書は、450nm〜365nmの発光波長と励起波長を設定する（または適切なフィルタを使用する）を以下。 </li><li>蛍光光度計での3枚をお読みください。重要：サンプルおよび標準プレート（ すなわち MUBまたはMUC）が同じゲインを使用して読み取る必要があります。 <ol><li>自動ゲインに分光光度計を設定し、MUCとMUB標準プレートをお読みください。 </li><li>セットマニュアルゲイン、次に低い数に最適の値を小さくするには、各標準プレートについて、最も近い5に丸め。各プレートについて2倍を繰り返します。 </li><li>自動にゲインを設定し、サンプルプレートを実行します。標準プレート（ すなわち MUBおよびMUC）のそれぞれについて、最も高いゲインに合わせて手動でサンプルプレートを再実行します。 </li></ol></li></ol> 4。データ解析<ol><li> MUBのためにスプレッドシートに標準曲線の蛍光データを入力します（ 表4a）およびMUC標準（ 表4B） <ol><li> （マイクロモル）に（μM）濃度に変換する（ 表4aおよび図4b）。 </li></ol></li><li>各サンプルの検量線蛍光データの場合は、傾き、y切片、およびR MUBおよびMUC（マイクロモル）標準濃度用の2値を計算します。許容されるR 2の値が各サンプルについて0.98を超えるべきである（ 表4aおよび4b）。蛍光は、従属変数（y軸）としてプロット読み出し及び標準濃度（マイクロモル）は独立変数（x ​​軸）（ 図1）としてプロットして、それは散布図で標準曲線を視覚化するのに有用であり得る。 </li><li>あなたが潜在的なEEASへのサンプル+基板生の蛍光データを算出するMUBおよびMUC標準曲線の傾きとy切片値を使用します。まず新しいスプレッドシート（ 表5aにサンプル+基板生の蛍光データを入力する必要があります</strong&gt;）。また、各サンプルのインキュベーション時間（時間）と土壌乾燥重量（ 表5B）を入力する必要があります。試料は25°C（ 表3）でインキュベートしたので注意、この例では入力された時間値は、3時間である。 <ol><li>対応するサンプルの蛍光値から標準曲線の切片の値を減算してから、対応する標準曲線（ 表5C）の傾きで割る。 [Y =サンプルの蛍光生読み取り、MUBまたはMUC標準曲線からB =切片であり、m = MUBからスロープ：X =（YB）/ M;これを実現するために、サンプル酵素濃度（X）を求めるために、標準的な一次方程式を再配置またはMUC標準曲線]。 </li><li> 91ミリリットル（土壌スラリーで使用されるバッファ量）（ 表5D）により、上記のステップ4.3.1から、サンプルマイクロモルを掛けます。 </li><li> [酵素AMT：分周値は、サンプル固有のインキュベーション時間および乾燥土壌の質量（ 表5E）、ステップ4.3.2で得られた。 （＆＃956;モル）×91ミリリットルXインキュベーション（HR）は乾燥土壌（G）×0.8ミリリットル×1,000]をX 注：0.8mlを各ウェルに使用されるスラリーの体積であり、1000は各ウェルにおける実際の土壌量を補正する。 </li><li>希望する単位（ナノモル活動/ g乾燥土壌/時）（ 表5F）を取得するために千、ステップ4.3.3で得られた値を掛けます。 </li></ol></li></ol>

利害の対立が宣言されていません。

潜在的な土壌EEASの実験室ベースの測定は、微生物のその非生物的環境への対応、および生態系の機能のための彼らの結果に重要な洞察を提供することができます。この例では、データセットの結果は、最小限の違いは、気候処置プロットのうち、土壌酵素活性または速度論で存在することを示唆している。しかし、プロットの中で逆の傾向では、土壌水分、土壌pHや植物の成長のような微生物EEASの生産に影響を与える可能性共変量のさらなる調査を奨励しています。全体的に、土壌中の（1）全体的なEEAに関してEEASを評価すること、（2）EEA化学量論（3）アレニウスプロット/活性化エネルギー、及び（4）Q 10は、エコシステム·レベルのプロセスを示すことができるアプローチの広いスペクトルを提供するロバスト土壌生態系の機能のダイナミクスを特徴づけるために、そこから。 ハイスループット蛍光ベースEEAアッセイは広く土壌中の潜在的なEEASを調べるために使用されている便利なツールであり、他の環境。重要なのは、潜在的な活動は、酵素プールサイズを反映してあるが、それだけでは酵素生産や離職率46を定量化しないでください。技術は比較的簡単ですが、実験室のプロトコルの間で、一見わずかな違いが、結果13の比較可能性を妨げることができます。残念ながら、我々は現在、EEAS適した標準化されたポジティブコントロールを持っていません。化学量論比の使用は、これらの課題を克服するための一つのアプローチである。そうでなければ、ハイスループット技術の出現は4環境中の酵素の研究を進めてきた。これらのアッセイによって生成されるデータの慎重な解釈は、微生物活性の重要な傾向を解明できる。 プロトコルのロバスト性は、個々のサンプルに特異的な条件を選択する能力に由来するが、これも限界が生じ得る。変更の一連のサンプルを正確にするために測定されていることを確認する必要があります<html>個々のフィールドサイト： バッファ選択したバッファは、土壌のpHに依存します。バッファリングはまた、高pH値27,47依存する、蛍光標準の蛍光強度を安定させる。試料のpHレベル - 我々は、典型的には土壌スラリーを作る為に必要なpH緩衝剤は、ベストマッチ土壌にバッファの特定の酸解離定数（pKa）のために選択される50 mM酢酸ナトリウムまたはトリス緩衝液である。酢酸ナトリウムは、4.76のpKaを有し、トリス8.06のpKaを有するので、これらの2つのバッファ量は、個々のサンプルのために所望のpKaを達成するために変化するであろう。リン酸塩緩衝液（pKa = 7.2）、中性/わずかに塩基性の土壌のために提案されている。しかし、我々は、高リン酸塩濃度は、酵素活性を妨害することができるように、このバッファを使用する前に、予備的研究における分析の変動をテストするために警告する。 蛍光基質の取り扱いと保管jove_content &quot;&gt;蛍光アッセイが光にさらされると、不純物および/または多くの蛍光化合物の不安定性による干渉に苦しむことができるので、蛍光基質の取り扱いには注意が必要です。私たちは強く、蛍光基質とMUBおよびMUC基準をラベル付けするために任意の光の露出を最小限に抑えることをお勧めします。強くお勧めしアンバーガラスボトルを使用したり、蛍光基質と基準を作り、保存するために使用のガラス器具や容器をカバーする、ガラス製品や容器をラップするアルミニウム箔がうまく機能同様に、効率的にプレートに接種し、暗いインキュベーターに移すことをお勧めしますお勧め。 （5℃）および解凍基板〜24〜48時間前に、酵素アッセイ（複数可）を開始する、基板と基準を（-20℃）のために、もはや2ヶ月未満（光からそれらを保護しながら）を格納する。 デザインとレプリケーションよくよくサンプルのバリエーションに、negativ実施するための最良の口座へEアッセイコントロールと（可能な場合）アッセイが複製することをお勧めします。バリエーションは、典型的に、各ウェル中の土壌粒子の量の違いやピペッティングエラーのために発生します。そのため、強力なミキシングと良好な分注技術は、実質的にうまく変化に十分に最小化されます。さらに、我々は経時的に強く基板の不整合を監視するためのアッセイ陰性対照（緩衝液+基質溶液）を実装示唆する。 （我々は、典型的には、96ウェルプレートの最後の列を使用して）陰性対照ウェルを比較することにより、酵素プレートを読み取るとき、これは容易にモニターすることができる。負の基板コントロールは典型的に安定であるので、ウェル検出限界を超える信号が増加すると、それは、基板および/または標準溶液の交換を必要とする汚染または基質の不安定性の指標である。 他のプロトコルの1種類を実行しますが、スループットを最大化するために、我々のプロトコルは、単一のディープウェルマイクロプレート内のいくつかの潜在的なEEASが含まれてい異なるEEAS以来プレート（プレート当たりすなわち 1の基板）あたりのアッセイは、異なる速度で起こる。いずれにしても、酵素の​​最適化は、アプローチまたは単板のアプローチを通じて、この高を実行する前に、土壌上で実行する必要があります。反応速度は、インキュベーションの期間内に各酵素について比較的一貫している場合は、複数の基板は、単一のプレート上で使用することができる。 〜1グラムは他のプロトコルでは24を推奨している間に我々のプロトコルは、スラリー溶液を作るために〜2.75グラムの土を推奨しています。我々はより多くの土壌（可能な場合）を使用すると、酵素活性レベルの中で、サンプル土壌の変化より良く取り込むために効果的なアプローチであることを示唆している。他の人が唯一の基質50μlと土壌スラリー200μlのインキュベートしながら、このプロトコルでは、我々は、200μlの基質と土壌スラリー800μlのインキュベートする。これは、単に最終的に測定された活性を変えないことをスケールアップの関数である。実用上の利点もありますより大きなボリュームを使用するため。 One、それは蛍光光度計での強度を記録する前に、黒色平底96ウェルプレート中にピペッティングしながら、対応する土壌粒子を回避することが容易である。酵素関連の蛍光強度を記録する前に、蛍光光度計に黒色平底96ウェルプレートを搬送しながら第二に、付加的な容積は、偶発的な流出の場合に有用である。ボリュームのわずかなずれが大幅に井戸の中で蛍光を減少します。最後に、このプロトコルのためのハイスループット性質のために、我々は一般的にかなりのアッセイが複製実行するよりも酵素活性レベルの変化を表現するために実験的な複製に依存することを選択する。それは、常に分析の複製を含めることをお勧めしますが、実際には、我々のプロトコルは限られた資源与えられた分析と実験の反復の間にバランスのとれたトレードオフを提供しています感じています。同様に、我々のアプローチは、内在する、これアッセイ25あたりに比較的よく均質化した土壌（2.75グラム）を使用していますntly内土壌の変化を減少させる。分析の複製を使用するという決定は、慎重に予備試験48で分析誤差のためにテストすることによって考慮されるべきである。しかし、我々はより少ない4治療群が複製した実験計画を強くアッセイ複製物の使用を検討することをお勧めします。 土壌、バッファボリューム、および基質濃度の最適化土壌緩衝液：基質濃度比酵素アッセイを行う際に強く測定された蛍​​光に影響を与える重要な変数である。スラリー中の土壌の量は、アッセイするか、基質の濃度は、土壌試料中の酵素の活性に応じて調整する必要があるかもしれ添加した。この例では選択された量は、その基質利用は、非限定したことを確認するために、これらの土壌の前のテストに基づいて、我々はアッセイ条件下で、最大の潜在的速度（V maxは）44,4測定されたことをされました5。しかしながら、酵素の高い濃度を有する土壌試料について、土壌または基質濃度の量が増加しなければならない。我々は、基質濃度を増加させる（それに応じて標準曲線を調整する）曲線の直線性に影響を与えることができることを見出した。したがって、我々は、必要に応じてボリュームをバッファリングするために土壌の量および/または比例調整を減らすことをお勧めします。測定EEASは飽和及び準飽和基質濃度26間のより大きな大きさの程度によって区別することができるのでかかわらず、それはアッセイごと土壌タイプのための基質濃度を最適化することが重要である。したがって実験処置（ 等 ）の違いは、タイプII統計誤差およびサブ飽和条件下で検出されにくく、かつ統計誤差27,35の影響を受けやすい。基質濃度を最適化するために、予備的な酵素アッセイは、基質濃度の広い範囲を使用して、代表的な土壌サンプルに対して実施すべきである。後に蛍光を記録し、単純に（同様に標準曲線の例を、 図1）にデータをプロット場所スロープ横ばい活性（y軸）酵素に対応する基質濃度（x軸）を識別するために（〜0）。同様に、スロープレベルはオフ（〜0）、その特定の土壌に最適な基質濃度の良い指標である点に対応する基質濃度。 このアッセイは、最終的に酵素媒介基質解重合の結果、基板から切断されている蛍光性部分によって生成与え経時的な蛍光を測定します。したがって、ステップ5（基質添加）が重要であり、基板を土壌に添加されるとアッセイが培養されるときとの間の時間を最小にするために可能な限り効率的に実行されなければならない。基板は、サンプルと接触するいったん同様に、酵素反応が起こり始めます。我々は、マルチチャンネルの使用をお勧めしますこのような理由のためのピペット。ことを強く前日に、あなたの酵素アッセイを実行しているマルチチャンネルピペットを使用して効率的になることが示唆されている。簡単にあなたのピペッターで96ウェルプレートにボリュームを転送できるようになるまで、これを実現するためには、水でピペッティングを練習することができます。 土壌焼入れクエンチングは、土壌スラリー-26のインキュベーション中の微粒子及び/又は有機材料に起因する蛍光強度を減少させることを意味する。バッファ比25：急冷土壌を調整することによって影響され得る。による個々の試料からのバックグラウンド蛍光を、バックグラウンド（消光）蛍光を説明するために試料と標準を実行することが重要である。いくつかのプロトコルは、信号が線形であることをテストした後、単一の濃度を使用していますが、私たちは強く消光の影響のための最高のコントロールに各試料の標準クエンチ制御を実現するお勧めします。これを怠ると、スタンドになりますサンプルには適用されませんARDカーブ、および酵素活性の誤推定。標準添加試料のバックグランド蛍光に影響を与えない土壌スラリーへの基準の追加は、時間に敏感ではありません。 NaOH添加合成基質から放出された蛍光染料が、pH&gt; 9.0 26,49にピーク蛍光を示すので、NaOHの添加は、蛍光、酵素活性測定を最適化するためにいくつかのプロトコルで使用される。この提案を検討する場合、土壌スラリーpH（ すなわち、pH&gt; 9）に必要なNaOH濃度は、特定の土壌によって異なり、pH緩衝剤26を使用した 。しかしながら、他の信号強度がさらに低いpHで一般的に非常に高いので、それは測定誤差の追加のソースを導入するためのNaOHが必要ないかもしれないと主張している。例えば、スラリーpH、したがってMUBまたはMUC fluoreにNaOHを添加の効果時間25以上のscence変わります。最大60分26についての蛍光を減少させたMUCが安定実証されていながら、MUBリンクされた基板は、レベルが先細りする前のNaOHの追加を次の20分間の一貫した増加した蛍光を発揮することが示されている。したがって、NaOHを添加し、蛍光測定の間の時間を標準化することが重要である。蛍光レベルは、NaOHを添加することなくアッセイを行う、添加なしで十分に検出可能である場合に代替的に均等に許容される代替的な26として提案されている。 温度インキュベーション温度を決定する際の温度感度を考慮に入れるべきである。主な関心が示されているように（結果のセクションで）アレニウスプロットを使用して3つ以上の温度を用いて、酵素反応速度を理解している場合は、堅牢なアプローチです。サンプルサイトは、永久凍土の土壌、そしてduratioとして特徴的に低温を持っている場合インキュベーションのnは寒いインキュベーション温度に反応する酵素をできるように拡張する必要があるかもしれません。温度の上昇は、増大した酵素活性をもたらすはずであることを示唆している伝統的な酵素動力学が、我々は、酵素が温度感受性50の観点で部位特異的であり得ることを見出した。そのため、サイト固有の酵素活性のポテンシャルを理解するには、培養温度と持続時間は現場の値を反映するように調整することが重要です。 結論のEEは、土壌中の生物地球化学的プロセスの重要なドライバであるため、我々は彼らの活動を測定することができるようにする必要があります。干渉や阻害を含む土壌中EEASを測定するには多くの課題があります。これらの課題にもかかわらず、（ここに記載されるものなど）標準化されたプロトコルは、普遍的に酵素の幅広いEEASを測定するために適用することができる。それは中に、これらのプロトコル以下の品質データを生成するために非常に簡単ですが生態学的文脈でこのデータのterpretationは、これらのアッセイが実際に測定しているかを慎重に検討する必要があり、どのようにアッセイ条件下でEEASは、 その場での条件での下では異なる場合があります。

陸域生態系における細胞外酵素土壌細菌、真菌、および古細菌によって生成（のEE）は無数の生物地球化学的過程に関与しており、処理の中心である、安定化、および土壌有機物の不安定化や栄養循環1。のEEを生成することによって、土壌の微生物が分解することにより、植物や微生物が土壌から利用可能な栄養素を吸収することができ、以前にバインドされたミクロおよび主要栄養素を遊離する、より小さな水溶性分子に高分子有機物を変換。直接酵素を検出し定量することは非常に困難であるためのEEは、主に実験室アッセイ2-4での活動を測定することにより、数十年にわたって研究されている。 細胞外酵素活性（EEA）が最も強く酵素および対応する基質の濃度によって制御される。の存在量の異なるC-、N-、及び土壌におけるP-分解酵素は、多くの因子により制御されるiを微生物バイオマス、群集組成、基質利用、微気候、および化学量論的な要求5,6 ncluding。しかし、土壌環境内のインサイツ EEAS でも土壌の粘土と腐植特性2、そして最終的に活性酵素プールを規制拡散制約9、サイズの点で、基質利用に酵素の結合を、温度7,8の影響を受けている、および離職率10から12。異なる環境のサイトにわたって土壌微生物機能を解釈するために実験室用酵素アッセイを使用して、したがって、 その場で土壌条件に肯定応答することが重要である。 EEAの多くの異なるクラスが（詳細については、「試薬表一覧」をご参照ください）​​合成基質のさまざまな方法を使って実験用アッセイで定量化することができる。いくつかのプロトコルは、wは、分光光度計で検出することができる比色反応に接続されているアッセイにおいて基質を利用我々はここで説明するプロトコルを含む他の人を、hile、蛍光部分に結合された基板を利用している。蛍光EEアッセイは、典型的には、（合成基質とリンクし、発色性部分を使用してください）比色アッセイ12月14日より（一桁）より敏感である。 1、目的の化合物の量に関係して検出され、検出可能な最低の潜在的な酵素活性の他の関連：EEA検出における感度は二つの側面が含まれています。比色p-ニトロフェノールのための方法（PNP）に基づくアッセイは、過去に記載されています15,16に動作します。簡単に説明すると、土壌（典型的に&lt;2mm及び空気乾燥に篩い分け）が最適かフィールド関連の温度およびpHでインキュベートする。反応生成物が放出される速度は、分光光度計14と比色決定される。蛍光酵素アッセイの高感度は、SUBSTRに関連した蛍光性部分の分離をより高感度な検出に一部起因する劣化を食べたのではなく、特定の波長で特定の色素産生の部分を分離した後、吸光度を記録する。二つの最も一般的に使用される合成蛍光指示薬は、4 -メチルウンベリフェロン（MUB）17および7 -アミノ-4 -メチルクマリン（MUC）18,19である。 MUC-結合基質は、一般に、タンパク質及び/又はアミノ酸のようなN-リッチな合成基質と関連している。蛍光技術は第一の水生サンプル20,21のために開発され、土壌への応用は、信号の消光と干渉22,23のコントロールを必要とした。アッセイは、大容量の従来の「ベンチトップ」化学を用いて行うことができるか、スループットの向上はなく、おそらく、より高い測定誤差と、マイクロプレートベースのプロトコルで使用することができる。 EEASの蛍光検出のためのいくつかの広く引用プロトコルが土壌24にありますが、多くのラボでは、多くの場合、不注意や違いによる、これらのプロトコルに微妙な変化を採用実験装置や試薬中のS。一見プロトコルの詳細の小さな違いを強く測定さEEAS 25,26および標準化された酵素の欠如は、異なる研究室間のアッセイを校正することがやりがいに影響を与えることができる。このように、EEAアッセイの標準化を促進するための詳細なプロトコルの普及のための重要な必要性がある。 我々のプロトコルにおいては、土壌試料は、pH緩衝液で土壌試料を組み合わせ、ブレンダーでホモジナイズすることにより調製される。スラリーは、次いで、C-、N-、P-またはリッチ目的の特定の研究課題に応じて選択された基質、蛍光標識の非限定的な量を接種する。酵素アッセイの土壌スラリーを使用すると、基板拡散の制限を最小化するための対照として機能します。蛍光部分は、それらがそれらのそれぞれの基質から切断されるまで急冷され、蛍光色素は、基板10bから放出されるように、このようにして酵素活性を検出することができるY酵素触媒反応。時間を通じて増加した蛍光強度は、酵素触媒反応の速度を反映している。 蛍光酵素アッセイの一般的な概念は、蛍光分子（蛍光色素）と結合した合成基質が、土壌サンプル27に添加されることである。酵素触媒基質分解の際に、結合は、蛍光色素と基板との間に分割します。基質から遊離蛍光色素が、その結果、酵素活性の間接的評価として使用され、色素の蛍光強度を検出するためにマイクロプレートリーダーを用いて定量することができる。遊離色素が異なる波長の光を吸収した後に一つの波長の光を放出するように簡単に説明すると、蛍光定量が達成される。蛍光強度は、励起および検出の両方が可能なプレートリーダーにより記録される。酵素活性は、その後、公知の蛍光色素conceに基づいて定量することができるアッセイにおいて使用される基板の特定の部分のために、蛍光の蛍光強度の標準希釈曲線を参照するとともに、基板のntrations（ すなわち、合成基質の既知量を土壌試料に添加）（ すなわち、4 -メチルウンベリフェロン（MUB）または7 -アミノ-4 - メチルクマリン（MUC））。 （酵素活性の定量化に関する特定の詳細のためのプロトコルのセクションを参照してください）​​。 実験室土壌酵素アッセイは、微生物群集機能を評価するために有用であるが、ユーザーが10を認識するべきであるいくつかの技術的な限界がある。蛍光アッセイは、光にさらされたときに不純物および/ ​​または多くの蛍光化合物の不安定性によって引き起こされる干渉に苦しむことができるので、蛍光基質25を取り扱う際には注意が必要である。土壌スラリー中の土壌粒子および/ ​​または有機材料はまた、クエンチング効果26として知られている蛍光強度を妨げることができる。さらに、実験室での酵素アッセイは、実験室条件下での潜在的EEASを評価しています。in vitroアッセイは、基板拡散と豊かさが非限定されている条件の下でEEASを測定する。したがって、これらのアッセイによって提供されるデータは、10 その場の土壌条件の下EEASのために良いプロキシできない場合があります。全体的に、酵素活性は、土壌の種類が類似している相対的な比較のために非常に有用である。物理的または化学的特性が異なる土壌の中で活性を比較するために、このメソッドを使用するときしかし、注意が必要です。これは、土壌の種類や温度差が急激にその場で酵素反応速度での状態を変化させることができるという事実によるものである。別の制限は、比較的少数の基質が（自然環境と比較して）市販されていることである。さらに、酵素アッセイのために使用される合成基質は、比較的単純である（易溶性）を正確に存在するか、ご利用できます土壌の基板を表していない可能性がその場での E。考慮すべきもう一つの要因は、土壌のスラリーを使用すると、 その場で条件2 で下にアクティブになっていない（ つまり、有機物や粘土で固定化された）いくつかの安定化酵素の活性を取り入れるということです。実験室での酵素アッセイは、土壌（酵素回転率）中の酵素や土壌の酵素を生産している特定の微生物種に関する情報の持続性に関する情報を提供していません。

<table><tbody><tr><td>試薬:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-メチルウンベリフェリル&-D-グルコピラノシド(AG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9766</td><td>糖分解</td></tr><tr><td>4-メチルウンベリフェリル&-D-グルコピラノシド(BG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3633</td><td>糖分解</td></tr><tr><td>4-メチルウンベリフェリル&-D-セロビオシド(CB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6018</td><td>セルロース分解</td></tr><tr><td>L-ロイシン-7-アミド-4-メチルクマリン塩酸塩 (LAP)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>L2145</td><td>タンパク質分解</td></tr><tr><td>4-メチルウンベリフェリル N-アセチル-&β;-D-グルコサミニド (NAG)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>M2133</td><td>キチン分解</td></tr><tr><td>4-メチルウンベリフェリルリン酸 (PHOS)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>M8883</td><td>リン無機化</td></tr><tr><td>4-メチルウンベリフェリル-&β;-D-キシロピラノシド(XYL)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>M7008</td><td>ヘミセルロース分解</td></tr>4<tr><td>-メチルウンベリフェロン(MUB)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>7-アミノ-4-メチルクマリン(MUC)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A9891</td><td></td></tr><tr><td>50 mM酢酸ナトリウム無水緩衝液</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S210-500</td><td>酸性および中性土壌</td></tr><tr><td>50mMトリスベースバッファー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP154-1</td><td>基本的な土壌</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Scienceware 使い捨てピペッティング・リザーバー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>14-512-65</td><td>ピペッティング・リザーバー</td></tr><tr><td>電子;エッペンドルフXplorer;8チャンネル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-684-265</td><td>8チャンネルピペット、範囲:50-1,200 &mu;l</td></tr><tr><td>ティプワン 101-1,250 &mu;l 拡張長さのナチュラルチップ</td><td>USA Scientific</td><td>1112 - 1720</td><td>96 チップ (960 チップ) ホットプレートの 10 ラック</td></tr><tr><td>; 加熱面: 10 インチ x 10 インチ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-100-100SH</td><td>ラボディスクマグネチックスタープレート</td></tr><tr><td>ワーリングブレンダー</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>14-509-7P</td><td>2スピード;1 L(34オンス)ステンレス鋼容器</td></tr><tr><td>ブランドディスペンシェットIIIボトルトップディスペンサーフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>13-688-231</td><td>ディスペンサー;範囲:5-50 ml</td></tr><tr><td>ウィートンユニペンス&mu;P 蠕動ポンプ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-683-7</td><td>オプションのディスペンサー</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド マグネティックスターバー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>1451363SIX</td><td>土壌スラリーアファーブレンドパイ</td></tr><tr><td>レックスガラスボウルワールド</td><td>キッチン</td><td>5304218</td><td>パイレックス 10オンスリムドカスタードカップ</td></tr><tr><td>コスター 96ウェルブラックソリッドプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-200-590</td><td>プレートリーダーステップに使用</td></tr><tr><td>Costar 96 ウェルアッセイブロック</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-700</td><td>V-bottom; 2 ml; 滅菌済み</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc 96 ウェルキャップマット</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-387-93</td><td>角型ウェル用滅菌済み 96 ウェルキャップマット</td></tr><tr><td>深井戸プレート用ホルダー付き遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>3121</td><td>Centra-GP8 (このモデルは販売終了)</td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200シリーズ多機能マイクロプレートリーダー</td><td>Tecan</td><td>30016058</td><td>Plateリーダー(このモデルは販売終了しています)</td></tr></tbody></table>

潜在的な土壌菌体外酵素の活動のハイスループット蛍光測定

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

土壌や他の環境中の微生物は、それらがエネルギーと栄養素同化することができるように有機高分子を解重合し、加水分解する外酵素を産生する。土壌微生物の酵素活性を測定することは、土壌生態系の機能のダイナミクスを理解する上で非常に重要です。蛍光酵素アッセイの一般的な概念は、合成C-、N-、又は蛍光色素と結合したP-に富む基質が土壌試料に添加されることである。ときはそのまま、標識された基質は、蛍光を発しない。酵素活性は、蛍光色素は、それらが蛍光を発することができ、それらの基質から切断されると蛍光の増加として測定される。酵素測定は、モル濃度または活性の単位で表すことができる。このアッセイを行うために、土壌スラリーは、pH緩衝液で汚れを組み合わせることによって調製される。 pH緩衝剤（典型的には50 mM酢酸ナトリウムまたは50mM Tris緩衝液）は、最高の土壌のSAと一致するように、バッファの特定の酸解離定数（pKa）のために選択されるmpleのpHは。土壌スラリーは、蛍光標識の非限定的な量（ すなわち、C-、N-又はP-リッチ）基板を用いて接種する。アッセイにおいて土壌スラリーを使用すると、酵素と基質の拡散に制限を最小限に抑えるのに役立つ。従って、この基質制限、拡散速度、土壌pH条件の相違のためのアッセイ対照、したがって（サンプルあたり）酵素濃度の差の関数としての潜在的な酵素活性率を検出する。 蛍光酵素アッセイは、典型的には、分光光度（ すなわち比色）アッセイより敏感であるが、不純物や光にさらされ、多くの蛍光化合物の不安定性に起因する干渉が発生することがよくあり、そのように蛍光基質を処理する際には注意が必要です。基板は、限定されていない場合も同様に、この方法は、実験室条件下​​で電位酵素活性を評価する。クロスを表すデータを解釈する際には注意が必要ですその場での土壌の種類や温度などの異なる温度や土壌の種類とサイトの比較は、酵素反応速度に影響を与えることができる。

土壌細胞外酵素活性の潜在的な速度を測定するために、蛍光色素に結合している合成基質を土壌試料に添加される。蛍光色素は、より高い蛍光基質分解を示す酵素触媒反応によって基質から放出される酵素活性を測定する。

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

この手順の全体的な目的は、土壌中の細胞外酵素が標的基質を分解する最大潜在速度を定量化することです。まず、現場の含水土壌と緩衝液をブレンダーで混合し、次に混合サンプルをディープウェルサンプルプレートおよびディープウェル標準プレートにピペッティングすることでこれを達成します。ディープウェルプレートをインキュベートおよび遠心分離した後、各ウェルから250 µLを、黒色のフラットボトムプレートの対応するウェルに移します。96ウェルプレートを用います。その後、3枚のプレートをフルオリメーターで読み取り、得られたデータを解析します。最終的に、潜在的な土壌細胞外酵素活性は、酵素触媒反応によって基質から蛍光色素が放出される速度によって決定され、蛍光強度がより高いほど、基質の分解が進んでいることを示します。この手法の既存の手法に対する主な利点は、ディープ96ウェルマイクロプレート形式を活用することで、多数のサンプルの酵素活性を測定できる点にあります。私たちは、他のプロトコルをディープウェルプレート形式に適応させることで、標準的なマイクロプレートに比べてサンプル量を増やすことができると考え、本手法を考案しました。この手法を用いることで、微生物の生理機能と生態系スケールのプロセスの関連性をより詳細に結びつけることが可能になります。この手法には多くの細かなニュアンスやサンプル操作があり、記述された手順だけでは理解することが困難なため、視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。本手法は、土壌微生物が環境の変化にどのように反応し、その生理学的反応が分解や栄養塩サイクルなどの重要な生態系プロセスにどのような影響を与えるかなど、微生物生態学および土壌生物地球化学の分野における主要な疑問を解決するのに役立ちます。また、本手法は土壌有機物の分解、栄養塩サイクル、および陸上生態系に関する知見を提供できるだけでなく、海洋および淡水系にも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、ピペッティングの技術や、本プロトコルにおける時間的制約に苦労することがあります。さらに、この手順で生成される膨大なデータ量は、初めて使用する方にとって負担となる場合があります。アッセイのセットアップを開始するには、3枚のディープウェルプレートに、「sample」、「MUB standard (4-methylumbelliferone)」、「MUC standard (7-amino-4-methylcoumarin)」とそれぞれラベルを貼ってください。各標準物質と基質を、行ごとに配置された、ラベル付きの清潔な別々のリザーバーに分注します。次に、テキストプロトコルに従い、適切なMUB標準物質をMUB標準プレートの対応するウェルにピペットで分注します。同様の操作をMUC標準物質に対して行い、MUC標準プレートの対応するウェルに分注して、土壌スラリーを調製します。各土壌試料について、現場湿潤状態の土壌2.75 gramsを量り取り、ブレンダーに加えます。50 millimolarバッファーを91 milliliters加え、強設定で1分間撹拌します。ブレンダーの内容物を、スターバーを入れた、8チャンネルピペットと同等以上の幅がある清潔なガラスボウルに注ぎます。土壌スラリーは、ボウルに注ぐ前に約1 mmのストレーナーでろ過してもよい。ボウルを撹拌プレートの上に置き、土壌スラリーを混合する。その後、800 µLの土壌スラリーをサンプルプレートの第1列にピペットで分注する。MUB標準プレートおよびMUC標準プレートの最初の列についても同様に行います。土壌サンプルの合間に、ブレンダー、スターラープレート、および撹拌子を脱イオン水またはバッファーで洗浄してください。この工程を各土壌サンプルについて繰り返します。以降のサンプルについても、順次次の列に移動して分注します。次に、サンプルプレートの対応するウェルに適切な基質をピペットで加えます。テキストプロトコルに記載されている通り、テストする各培養温度に対してサンプルプレートを準備してください。ディープウェルプレートをプレートマットで密封します。溶液が十分に混ざるまで、密封した各プレートを手で反転させます。テキストプロトコルに記載されている必要なインキュベーション時間に従って、プレートを適切なインキュベーターに入れます。開始時間を0時として記録し、各インキュベーション期間の終了時に適切なインキュベーション時間を記録してください。密封したプレートを約2,900 Gで3分間遠心分離します。遠心分離後、インキュベートしたディープウェルプレートの各ウェルから250 µLを、対応する黒色の平底96ウェルプレートのウェルに分注します。インキュベートしたディープウェルプレート1枚につき、黒色プレート1枚を使用します。使用するフローロメトリックプレートリーダーの製造元の指示に従い、インキュベートしたディープウェルプレートから黒色の平底96ウェルプレートの対応するウェルへサンプルを移すことが重要です。励起波長を365 nanometersに、蛍光波長を450 nanometersに設定してください。標準プレートのいずれかをロードし、フルオリメーターをオートゲインに設定してプレートを読み取ります。次に、ゲインを手動設定に切り替え、最適値から5刻みの次の低い数値まで値を下げます。各標準プレートについて、プレートごとに2回ずつ測定を繰り返します。次に、サンプルプレートをロードします。ゲインをオートに設定し、サンプルプレートを測定します。その後、各標準プレートの最高ゲインに合わせるため、サンプルプレートを手動で再測定してください。まず、MUBおよびMUC標準品の標準曲線蛍光データをスプレッドシートに入力し、データ解析を開始します。各サンプルのマイクロモル濃度をマイクロモル量に変換します。標準曲線の蛍光データから、MUBおよびMUC標準濃度の傾き、y切片、およびR²値を算出します。各サンプルの許容されるR²値は0.98を超えていなければなりません。標準曲線は、蛍光読み取り値を従属変数に、標準濃度を独立変数にとった散布図で可視化できます。サンプルと基質を加えた生の蛍光データを新しいスプレッドシートに入力してください。また、各試料の培養時間と土壌乾燥重量をあわせて記録し、各試料の蛍光値から対応する標準曲線の切片値を差し引き、それを対応する標準曲線の傾きで除します。標準直線の式を用いて、試料のマイクロモル数に、土壌懸濁液に使用したバッファー量である91 millilitersを乗じます。得られた値を、試料固有の培養時間および土壌乾燥重量で除します。最後に、得られた値に1000を掛け、目的の単位に換算します。結果は、周囲の気候条件下にある土壌と、二酸化炭素濃度上昇および加熱処理にさらされた土壌を比較した実験的な気候研究から示されています。ここに示されているのは、草原の加熱および二酸化炭素濃縮サイトにおける対照区と処理区での潜在的な細胞外酵素活性（EEA）です。この例では、土壌深さ0〜5 cmにおける潜在的な炭素、窒素、およびリンの酵素獲得活性の分析において、実験的処理による差は見られませんでした。しかしながら、土壌深さ5〜15 cmでは、いくつかの潜在的なEEAに有意な差が見られました。例えば、炭素分解酵素であるβ-1,4-グルコシダーゼおよびβ-D-セロビオヒドロラーゼは、周囲の気候条件のプロットと比較して、二酸化炭素濃度上昇および加熱処理プロットにおいて低い値を示しました。また、窒素およびリンの無機化酵素についても、土壌深さ5〜15 cmにおいて、周囲の気候条件と比較して処理プロットで低い値となりました。炭素、窒素、またはリンの循環ポテンシャルを持つすべてのEEAの合計を算出しプロットすることは、土壌の炭素、窒素、および／またはリンの循環ポテンシャルに関するより広範なパターンを観察するために有用なアプローチとなり得ます。この例では、炭素循環ポテンシャル活性を表すために、β-1,4-グルコシダーゼ、β-D-セロビオヒドロラーゼ、β-キシロシダーゼ、およびα-1,4-グルコシダーゼのポテンシャルEEAの合計を算出しました。また、窒素循環ポテンシャル活性を表すために、β-1,4-N-アセチルグルコサミダーゼおよびL-ロイシンアミノペプチダーゼの合計を算出しました。ホスファターゼは、潜在的なリン循環活性の指標として用いられた。土壌深さ5〜15 cmにおいて、全炭素、窒素、およびリンの循環に関する潜在的なEEAは、周囲の気候条件のプロットと比較して、二酸化炭素濃度上昇および加熱処理のプロットで低くなる傾向が見られた。しかし、この傾向が有意であったのは全窒素およびリンの循環活性のみであり、土壌EEAは処理プロット間で有意な差は認められなかった。土壌深さ0～5cmにおいて。結果は、土壌深さに反応した処理区間における酵素活性および機能群の対照的な傾向を示唆しており、潜在的EEAの比率は微生物の栄養要求量を評価する一つの方法となります。ここで、土壌酵素、土壌幾何学的構造、炭素対窒素比、炭素対リン比、または窒素対リン比の活性は、土壌深さ0～5cmにおいて処理区間で有意に異なります。しかしながら、潜在的な酵素の炭素対リン比および窒素対リン比は、二酸化炭素濃度上昇および加熱処理区においてより高い値を示しました。5〜15 cmの土壌深さにおける周囲の気候条件と比較して、温度は土壌のEEAに強い影響を及ぼす可能性があります。しかし、一般的なラボアッセイでは、土壌酵素は単一の温度で測定されており、それはin C twoの温度条件に一致しない場合があります。Aranプロットは活性化エネルギーを可視化するために用いられ、x軸にケルビンに変換した温度の逆数、y軸に酵素活性の対数をプロットして作成します。活性化エネルギーは一般的に、化学反応を触媒させるために必要な最小エネルギーと定義されており、ここでは酵素触媒反応の温度感受性の指標として用いています。活性化エネルギーが高いほど、酵素の温度感受性が高いことを示します。同様に、活性化エネルギーはQ10（温度係数）に直接対応します。2つの土壌深度における両方の処理区において、炭素、窒素、およびリンの細胞外酵素活性（EEA）における潜在的な酵素反応速度の温度係数値を評価したところ、EEAの温度感受性は、いずれの土壌深度においても処理区間で有意な差がないことが示されました。習熟すれば、96穴マイクロタイタープレートへの12サンプル分の接種を30分以内で完了できます。さらに、規定のインキュベーション時間が経過した後、通常は30分以内にプレートを遠心分離し、移送して、再びウロメーターで測定することが可能です。この操作を行う際は、ピペッティングを一定に行うことが重要です。ピペッティング時に気泡が混入すると、結果に悪影響を及ぼします。土壌形成後の土壌機能における土壌微生物群集組成の役割に関するさらなる疑問を解消するために、DNA抽出やシーケンシングなどの他の手法を用いることができます。この技術は、微生物生態学分野の研究者が陸上生態系における栄養塩サイクルや生物地球化学的プロセスを探索するための道を開きました。このビデオを視聴することで、潜在的な酵素活性を定量化する方法を十分に理解できるはずです。さらに、気候や異なる生態系内の異なる土壌タイプなどの要因に対する、微生物の潜在的な反応を反映してデータを解釈できる必要があります。蛍光材料を扱う際は、蛍光基の光感受性を考慮し、光への曝露を最小限に抑えるための予防策を常に講じることを忘れないでください。

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