潜在的な土壌菌体外酵素の活動のハイスループット蛍光測定

この手順の全体的な目的は、土壌中の細胞外酵素が標的基質を分解する最大潜在速度を定量化することです。まず、現場の含水土壌と緩衝液をブレンダーで混合し、次に混合サンプルをディープウェルサンプルプレートおよびディープウェル標準プレートにピペッティングすることでこれを達成します。ディープウェルプレートをインキュベートおよび遠心分離した後、各ウェルから250 µLを、黒色のフラットボトムプレートの対応するウェルに移します。

96ウェルプレートを用います。その後、3枚のプレートをフルオリメーターで読み取り、得られたデータを解析します。最終的に、潜在的な土壌細胞外酵素活性は、酵素触媒反応によって基質から蛍光色素が放出される速度によって決定され、蛍光強度がより高いほど、基質の分解が進んでいることを示します。

この手法の既存の手法に対する主な利点は、ディープ96ウェルマイクロプレート形式を活用することで、多数のサンプルの酵素活性を測定できる点にあります。私たちは、他のプロトコルをディープウェルプレート形式に適応させることで、標準的なマイクロプレートに比べてサンプル量を増やすことができると考え、本手法を考案しました。この手法を用いることで、微生物の生理機能と生態系スケールのプロセスの関連性をより詳細に結びつけることが可能になります。

この手法には多くの細かなニュアンスやサンプル操作があり、記述された手順だけでは理解することが困難なため、視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。本手法は、土壌微生物が環境の変化にどのように反応し、その生理学的反応が分解や栄養塩サイクルなどの重要な生態系プロセスにどのような影響を与えるかなど、微生物生態学および土壌生物地球化学の分野における主要な疑問を解決するのに役立ちます。また、本手法は土壌有機物の分解、栄養塩サイクル、および陸上生態系に関する知見を提供できるだけでなく、海洋および淡水系にも適用可能です。

一般的に、この手法に不慣れな方は、ピペッティングの技術や、本プロトコルにおける時間的制約に苦労することがあります。さらに、この手順で生成される膨大なデータ量は、初めて使用する方にとって負担となる場合があります。アッセイのセットアップを開始するには、3枚のディープウェルプレートに、「sample」、「MUB standard (4-methylumbelliferone)」、「MUC standard (7-amino-4-methylcoumarin)」とそれぞれラベルを貼ってください。

各標準物質と基質を、行ごとに配置された、ラベル付きの清潔な別々のリザーバーに分注します。次に、テキストプロトコルに従い、適切なMUB標準物質をMUB標準プレートの対応するウェルにピペットで分注します。同様の操作をMUC標準物質に対して行い、MUC標準プレートの対応するウェルに分注して、土壌スラリーを調製します。

各土壌試料について、現場湿潤状態の土壌2.75 gramsを量り取り、ブレンダーに加えます。50 millimolarバッファーを91 milliliters加え、強設定で1分間撹拌します。ブレンダーの内容物を、スターバーを入れた、8チャンネルピペットと同等以上の幅がある清潔なガラスボウルに注ぎます。

土壌スラリーは、ボウルに注ぐ前に約1 mmのストレーナーでろ過してもよい。ボウルを撹拌プレートの上に置き、土壌スラリーを混合する。その後、800 µLの土壌スラリーをサンプルプレートの第1列にピペットで分注する。

MUB標準プレートおよびMUC標準プレートの最初の列についても同様に行います。土壌サンプルの合間に、ブレンダー、スターラープレート、および撹拌子を脱イオン水またはバッファーで洗浄してください。この工程を各土壌サンプルについて繰り返します。

以降のサンプルについても、順次次の列に移動して分注します。次に、サンプルプレートの対応するウェルに適切な基質をピペットで加えます。テキストプロトコルに記載されている通り、テストする各培養温度に対してサンプルプレートを準備してください。

ディープウェルプレートをプレートマットで密封します。溶液が十分に混ざるまで、密封した各プレートを手で反転させます。テキストプロトコルに記載されている必要なインキュベーション時間に従って、プレートを適切なインキュベーターに入れます。開始時間を0時として記録し、各インキュベーション期間の終了時に適切なインキュベーション時間を記録してください。

密封したプレートを約2,900 Gで3分間遠心分離します。遠心分離後、インキュベートしたディープウェルプレートの各ウェルから250 µLを、対応する黒色の平底96ウェルプレートのウェルに分注します。インキュベートしたディープウェルプレート1枚につき、黒色プレート1枚を使用します。

使用するフローロメトリックプレートリーダーの製造元の指示に従い、インキュベートしたディープウェルプレートから黒色の平底96ウェルプレートの対応するウェルへサンプルを移すことが重要です。励起波長を365 nanometersに、蛍光波長を450 nanometersに設定してください。

標準プレートのいずれかをロードし、フルオリメーターをオートゲインに設定してプレートを読み取ります。次に、ゲインを手動設定に切り替え、最適値から5刻みの次の低い数値まで値を下げます。各標準プレートについて、プレートごとに2回ずつ測定を繰り返します。

次に、サンプルプレートをロードします。ゲインをオートに設定し、サンプルプレートを測定します。その後、各標準プレートの最高ゲインに合わせるため、サンプルプレートを手動で再測定してください。

まず、MUBおよびMUC標準品の標準曲線蛍光データをスプレッドシートに入力し、データ解析を開始します。各サンプルのマイクロモル濃度をマイクロモル量に変換します。標準曲線の蛍光データから、MUBおよびMUC標準濃度の傾き、y切片、およびR²値を算出します。

各サンプルの許容されるR²値は0.98を超えていなければなりません。標準曲線は、蛍光読み取り値を従属変数に、標準濃度を独立変数にとった散布図で可視化できます。サンプルと基質を加えた生の蛍光データを新しいスプレッドシートに入力してください。

また、各試料の培養時間と土壌乾燥重量をあわせて記録し、各試料の蛍光値から対応する標準曲線の切片値を差し引き、それを対応する標準曲線の傾きで除します。標準直線の式を用いて、試料のマイクロモル数に、土壌懸濁液に使用したバッファー量である91 millilitersを乗じます。得られた値を、試料固有の培養時間および土壌乾燥重量で除します。

最後に、得られた値に1000を掛け、目的の単位に換算します。結果は、周囲の気候条件下にある土壌と、二酸化炭素濃度上昇および加熱処理にさらされた土壌を比較した実験的な気候研究から示されています。ここに示されているのは、草原の加熱および二酸化炭素濃縮サイトにおける対照区と処理区での潜在的な細胞外酵素活性（EEA）です。この例では、土壌深さ0〜5 cmにおける潜在的な炭素、窒素、およびリンの酵素獲得活性の分析において、実験的処理による差は見られませんでした。

しかしながら、土壌深さ5〜15 cmでは、いくつかの潜在的なEEAに有意な差が見られました。例えば、炭素分解酵素であるβ-1,4-グルコシダーゼおよびβ-D-セロビオヒドロラーゼは、周囲の気候条件のプロットと比較して、二酸化炭素濃度上昇および加熱処理プロットにおいて低い値を示しました。また、窒素およびリンの無機化酵素についても、土壌深さ5〜15 cmにおいて、周囲の気候条件と比較して処理プロットで低い値となりました。

炭素、窒素、またはリンの循環ポテンシャルを持つすべてのEEAの合計を算出しプロットすることは、土壌の炭素、窒素、および／またはリンの循環ポテンシャルに関するより広範なパターンを観察するために有用なアプローチとなり得ます。この例では、炭素循環ポテンシャル活性を表すために、β-1,4-グルコシダーゼ、β-D-セロビオヒドロラーゼ、β-キシロシダーゼ、およびα-1,4-グルコシダーゼのポテンシャルEEAの合計を算出しました。また、窒素循環ポテンシャル活性を表すために、β-1,4-N-アセチルグルコサミダーゼおよびL-ロイシンアミノペプチダーゼの合計を算出しました。

ホスファターゼは、潜在的なリン循環活性の指標として用いられた。土壌深さ5〜15 cmにおいて、全炭素、窒素、およびリンの循環に関する潜在的なEEAは、周囲の気候条件のプロットと比較して、二酸化炭素濃度上昇および加熱処理のプロットで低くなる傾向が見られた。しかし、この傾向が有意であったのは全窒素およびリンの循環活性のみであり、土壌EEAは処理プロット間で有意な差は認められなかった。

土壌深さ0～5cmにおいて。結果は、土壌深さに反応した処理区間における酵素活性および機能群の対照的な傾向を示唆しており、潜在的EEAの比率は微生物の栄養要求量を評価する一つの方法となります。ここで、土壌酵素、土壌幾何学的構造、炭素対窒素比、炭素対リン比、または窒素対リン比の活性は、土壌深さ0～5cmにおいて処理区間で有意に異なります。

しかしながら、潜在的な酵素の炭素対リン比および窒素対リン比は、二酸化炭素濃度上昇および加熱処理区においてより高い値を示しました。5〜15 cmの土壌深さにおける周囲の気候条件と比較して、温度は土壌のEEAに強い影響を及ぼす可能性があります。しかし、一般的なラボアッセイでは、土壌酵素は単一の温度で測定されており、それはin C twoの温度条件に一致しない場合があります。

Aranプロットは活性化エネルギーを可視化するために用いられ、x軸にケルビンに変換した温度の逆数、y軸に酵素活性の対数をプロットして作成します。活性化エネルギーは一般的に、化学反応を触媒させるために必要な最小エネルギーと定義されており、ここでは酵素触媒反応の温度感受性の指標として用いています。活性化エネルギーが高いほど、酵素の温度感受性が高いことを示します。

同様に、活性化エネルギーはQ10（温度係数）に直接対応します。2つの土壌深度における両方の処理区において、炭素、窒素、およびリンの細胞外酵素活性（EEA）における潜在的な酵素反応速度の温度係数値を評価したところ、EEAの温度感受性は、いずれの土壌深度においても処理区間で有意な差がないことが示されました。習熟すれば、96穴マイクロタイタープレートへの12サンプル分の接種を30分以内で完了できます。

さらに、規定のインキュベーション時間が経過した後、通常は30分以内にプレートを遠心分離し、移送して、再びウロメーターで測定することが可能です。この操作を行う際は、ピペッティングを一定に行うことが重要です。ピペッティング時に気泡が混入すると、結果に悪影響を及ぼします。

土壌形成後の土壌機能における土壌微生物群集組成の役割に関するさらなる疑問を解消するために、DNA抽出やシーケンシングなどの他の手法を用いることができます。この技術は、微生物生態学分野の研究者が陸上生態系における栄養塩サイクルや生物地球化学的プロセスを探索するための道を開きました。このビデオを視聴することで、潜在的な酵素活性を定量化する方法を十分に理解できるはずです。

さらに、気候や異なる生態系内の異なる土壌タイプなどの要因に対する、微生物の潜在的な反応を反映してデータを解釈できる必要があります。蛍光材料を扱う際は、蛍光基の光感受性を考慮し、光への曝露を最小限に抑えるための予防策を常に講じることを忘れないでください。