Name: 自由水泳弱電気魚の長期的な行動の追跡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-06T13:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 学ぶ 弱電気魚の自由水泳行動を長期追跡する方法。電気器官放電と体の位置・姿勢を同期計測し、自発的行動を非侵襲的に観察できます。神経科学と行動生物学の研究に応用可能です。

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この作品は、寛大に自然科学とカナダの工学研究評議会（NSERC）と健康の研究（CIHR）のカナダの協会によってサポートされていました。

この手順では、大学オタワの動物管理委員会の要件を満たしています。利害の競合が宣言されていない。下記の機器や材料のメーカーとモデルのための材料および試薬の表を参照してください。カスタム書かSpike2とMATLABスクリプト、およびサンプル·データは、補足ファイルで提供されています。 1。水槽と隔離室のセットアップ<ol><li> 抗 V リブレーションの床 。下から上（ 図1A）にゴムパッド、音響発泡スチロール、船舶用合板パネル、ポリウレタンフォームパッドを積層して防振面（2.1 MX 2.1メートル）を構築。水槽の縁をサポートするために、合板パネルの4木製スタッド（5センチメートル×10センチ）横たわっていた。 </li><li> 床暖房 。 （ 図1Dの下部を参照）を熱傾斜フォームパッドの上に電気的にシールドされた発熱体を築く。金属を加熱素子を覆う電気シールド用LICメッシュ。 </li><li> 空間的なタンク 。 （ 図1Aを参照）1.3センチメートルに厚い強化ガラスパネル、L字型のアルミフレームと水族館·グレードのシリコーンを使用して広く浅い水槽（1.8 MX 1.8 MX 30センチメートル）を構築。高い結像コントラスト（プロトコル3を参照）を提供するために、白地の大きなシートでタンクの下面を覆う。 </li><li>アクリルシート（0.64センチメートル厚いマットホワイト、）で作られた（22.5センチ）の壁を設置することにより（ 図1（b）参照 ）、中央·アリーナ（1.5メートル直径）に水槽を分割し、4隅の区画。 <ol><li> 4湾曲した壁部を作成し、4コーナー区画から中央アリーナを分離するために、シリコンコーキングを使用してタンク底部に取り付けますに熱を加えることにより、曲げ4アクリルシート（22.5センチ×102.7センチメートル）。ゲートのインストールのために湾曲した部分の間に20センチのスペースを残す。 </li><li> 4重壁のWIをインストールして別々の隣接コーナーコンパートメントこのようなハイドロフォンなど水中のセンサーのための余分な電気的絶縁や場所を提供する第15cmのギャップ。 </li></ol></li><li> 4電動ゲートを組み立てて、コーナーのコンパートメントと中央のアリーナの間にそれらをインストールしてください。 <ol><li> 図1Cに示すように、4つのドアフレームを組み立てる。各ドア枠に6ウェル（0.64センチメートル深い）を作成し、ナイロンドングリナット（0.64センチメートル直径スレッド）を埋め込むとエポキシで固定します。 </li><li>アクリルゴムシートから4ドアパネルをカットし、ロック機構のためのアクリルゴムパネルに6つの穴（0.64g直径1cm）を作成します。シリコンコーキングを使用して、アクリル系、ゴムのパネルに参加します。 </li><li>アクリルをインストールすると、ドアフレームにドアパネルに参加するヒンジ。 </li><li>マウントされます（ 図1C参照 ）サーボモータに腕を振って、ドアフレームの上に取り付けます。ドアパネルにスイングアームをリンクするためにケーブルタイでのループを作る。 </li><li> GA上にゲートアセンブリを配置するpsの湾曲した壁部との間に作成され、シリコーンコーキングを使用してそれらを固定する。 </li><li>サーボコントローラにすべてのサーボモータを接続し、アクティブなUSB延長ケーブルを介して電源とコンピュータに接続します。サーボコントローラに供給された制御ソフトウェアを使用してゲートをテストする。 </li><li>シリコーンは硬化した後、ナイロンネジですべてのゲートをロックし、一度に1室を充填することにより水密性を確認してください。 </li></ol></li><li> 隔離室 。 （ 図1D参照 ）水槽を囲み、光、音、電気的ノイズの外部ソースをブロックする隔離室を構築します。 <ol><li> 3壁パネル（2 MX 2 MX 5cm）にし、4ドア·パネル（1.9 MX 0.95 MX 5センチ）を作る。各パネルには、矩形の枠を作成するために、アルミ成形品（5センチメートル×2.5 cm）の参加とアルミフレームの白い波形プラスチックパネルをリベット。パネル内の音響グラスファイバーバットを記入し、黒波形プラスチックパネルとの緊密な。</li><li>防振床に3壁パネルをインストールし、インストールしてピアノは壁パネルに4ドア·パネルに参加するヒンジ。 </li><li>アルミメッシュとの隔離室を囲むと、グランドはファラデーケージを作成するためにすべての側面に噛み合っている。 </li></ol></li><li> 湿度制御 。加熱から過剰な湿気の蓄積を除去するために、低騒音、排気ファン（ 図1Fの一番上）をインストールします。少なくとも2メートル離れて記録サイトからの排気ファンを配置し、隔離室と排気ファンとの間に空気ダクトを取り付けます。 </li><li>日常監視し、水槽の水と動物の状態を維持する。 <ol><li> 10cmの深さ、100μS/ cmの導電率と水又は塩原液（レシピクヌーセン33を参照）加えてpHを7.0で一定に水の条件を維持する。 pHが6.5以下になると粉砕した珊瑚の袋を追加します。 </li><li>クリーニングのために浅瀬で動作することができ、垂直水槽のフィルタをインストールする通気目的（ 図1Fの下）。フィルターを外し、記録セッション中に、中央のアリーナの外にそれらを取る。 </li><li>ゴムひもで吸盤上に取り付けることにより、タンクの底にライブミルワームを提供します。録音中に浮遊プレイの制御不能な送を防止するために、このようなblackwormsなどのフリーフローティング餌を避けてください。 </li></ol></li></ol> 2。 EODの追跡<ol><li> 電極の取り付け 。 8黒鉛電極を組み立てて、同じように中央のアリーナの湾曲した壁のスペースにそれらを。 <ol><li>さ（長さ15センチメートル、火星カーボン2ミリメートルタイプHB）のリード線を描く取得し、リードの外部コーティングを剃り落とす。 </li><li>同軸ケーブル（RG-174）の8 10cmのセグメントをカットしたグラファイト棒の一方の端の周りにケーブルコアをラップし、熱収縮に強く、安定した電気的接続のためにそれらの上にチューブを適用します。両端（左図2A）のBNCジャックコネクタを接続します。&lt;/李&gt; <li>テーピングで壁に電極を配置し、シリコーンから保護するために、電極表面上にマスキングテープの薄いストリップを適用します。永久に電極を保持し、シリコーンが硬化（ 図2A右）の前に、すべてのテープを削除するには、シリコンコーキングを適用します。 </li></ol></li><li>アンプ部に各電極からの距離を測定し、長さで同軸ケーブル（RG-54）を切断することにより8ケーブルアセンブリをビルドします。ケーブルの両端にBNCプラグコネ​​クタを取り付けます。 </li><li>アンプユニットに全ての電極を配線するケーブルアセンブリを使用してください。差動で2 90°指向の電極を組み合わせることで増幅する（ 図2B参照 ）、ファラデーケージにそれらを接続することにより、すべての同軸シールド線を接地してください。 </li><li>信号飽和限界以下のアンプゲインを設定し、ノイズを除去するバンドパスフィルタ（200Hzの-5 kHz）を適用する。 40 KS /秒で4つの記録電極対をデジタル化。 </li><li> オンライン信号処理。命令は、Spike2ソフトウエアのために書かれており、パラメータ設定がGymnotus種のために最適化される。 （概要について図2Cを参照してください）。 <ol><li>追加DCが全ての記録チャンネルにプロセス（τ= 0.1秒）を取り外します 。 </li><li>すべての録音チャンネルにRECTIFYプロセスを追加。 </li><li>すべての4つの録音チャンネルを合計することによって、仮想チャネルを作成します。 </li><li>は、RMS（二乗平均平方根を追加することで、EODパルスあたりの単峰エンベロープを抽出<img alt="" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50962/50962_clip_image002.gif" width="70px" />明確パルスタイミングを決定するために、EODサイクルごとに単一のピークを生成するための仮想チャネル）の処理（τ= 0.25ミリ秒）。 </li><li> 仮想チャネルからrealmarkチャンネルを作成し、すべてのEODパルスWIをキャプチャするために、適切なしきい値を設定した後、時間とピーク振幅の値を記録パルス欠落thout、誤検知を回避しながら。 </li><li> 瞬時周波数モードにrealmarkチャンネルのチャンネル表示オプションを設定することで、リアルタイムで瞬時EOD率を監視します。 </li><li> realmarkチャンネルを複製することによって、リアルタイムでの魚の動きを監視し、 波形モードへの表示オプションを設定します。 </li><li> realmarkチャネル （0.01秒のサンプリング周期）から仮想チャネルを作成することにより、EOD振幅の傾きのRMSから活動レベルを定量化し、スロープ（τ= 0.25ミリ秒）とRMS（τ= 0.5秒）プロセスを追加。 </li><li> MATLABの形式にSpike2ソフトウェアでrealmarkチャンネルをエクスポートします。 </li></ol></li></ol> 3。同期されたビデオトラッキング<ol><li>背景シーンを作成します。 <ol><li>マットホワイトカウンターフィルムで覆うことにより、水面に反射をキャストし、任意のオブジェクトを非表示にします。 </li><li>白いマットをインストールカメラと通気孔を非表示にするには、15センチメートル天井の下波形プラスチックパネル。 </li><li>カメラのキャリブレーションのための白い大きな紙に印刷グリッドパターン、コントラストの高いバックグラウンドを提供するために、タンクの下に置きます。 </li></ol></li><li>光源を取り付けます。 <ol><li>入手したIR LEDが点灯して、ノイズを低減するために、組み込みのファンを取り外します。ファラデーケージの外に配置され、電流直流安定化電源でLEDを駆動。 </li><li> IRは、暗闇の中でイメージング用ライト、およびテストの魚に日周光サイクルを駆動する白色LEDライトをLEDにインストールします。間接的で均一な照明（ 図3A）を達成するために、天井に向けて直接的全ての光源。 </li><li>白を駆動することにより、日周光周期を調節するタイマー制御スイッチ（HRオフon/12 例えば 12時間）とLEDが点灯します。 </li></ol></li><li>直接水族館の上にカメラを設置。 <ol><li> NIRに敏感なカメラを取得、またはIRブロッキングfilteを削除レンズ組立体の後方に着色ガラスの薄いシートを壊すことによってrを視野角は、画像全体の中央アリーナに十分な幅であることを確認してください。 </li><li>天井パネルの中央にある小さな視聴穴を開け、穴の真上にカメラを置きます。 </li><li>光源はグレアを生成する場合、レンズの周りに白い輪ガードを取り付けます。 </li></ol></li><li>時間同期録画を行います。 <ol><li>時刻同期パルス（1ミリ秒の持続時間、10秒周期）を生成するために4つのタンクのコーナーの一つにIR LEDを配置する。直列に負荷制限抵抗（1kΩの）を追加し、デジタイザハードウェアのデジタル出力ポートからIR LEDを駆動します。 </li><li>利用可能な場合は、カメラにバンドルされているビデオ録画ソフトウェアを使用してください。最高記録品質（ 例えば可逆圧縮）およびサポートされている最高の解像度を選択します。 </li><li> EODの記録を開始する直前に録画を開始し、録画直ちにを停止EOD記録後直ちに。 </li><li>記録後、直線的に第一及び信号デジタイザとビデオ記録によって捕捉最後の光パルスの間を補間することによって、デジタイザ時間単位に画像フレーム番号に変換する。 </li></ol></li><li>自動画像追尾 命令は、MATLABの画像処理ツールボックスのために書かれており、その機能を利用している。カスタムMATLABスクリプトは、自動化された画像トラッキングについては、この提出が設けられている。 <ol><li> ビデオをインポートします 。使用して、MATLABワークスペースに直接録画ファイルをインポート」Videoreaderを 。 読む 」機能を。 </li><li> 2つの画像フレームを合成して合成背景画像を作成する。別のフレームからの同じ領域の空き画像（ 図3（b）参照 ）を用いて動物が占有する画像領域を交 ​​換してください。 </li><li> αを除外するために、中央競技場の周りに円形マスクを描画することで追跡するために画像領域を指定するREAの外側（ 図3Bの下）、および強度差の最小しきい値を設定する定数（R int型 ）を掛けます。背景以下の- （R INTは 1）例えば、RINT設定 = 0.85は強度変動15パーセント=を抑制します。 </li><li> 画像減算 。差分画像（=ΔIMk）を得るために、背景画像（IM = 0）から、画像フレーム（IM = k）を減算する。負でない整数として画像強度値を記憶する符号なし整数の数値精度を使用する。 </li><li> graythresh関数から決定された強度閾値を適用することにより、セグメントの差分画像を。 bwmorph機能を使用してバイナリ画像をきれいにし、regionprops機能を使用して、すべてのBLOB領域を計算した後、動物に対応する最大のBLOBを選択します。 </li><li>重心と主要な方向Aを決定regionprops関数を適用し、x軸と長軸を整列させるために画像を回転することによって最大のブロブのXIS。重心（ 図3Dの上）での頭と尾の部分に画像を分割する。 </li><li>ヘッド部の長軸を決定し、X軸（ 図3D左下）と整合する画像全体を回転させます。頭と尾の部分の周りにフィットバウンディング·ボックスはregionprops機能を利用して長軸に平行である。 </li><li>左、中央、バウンディングボックスの右側の垂直エッジ（ 図3Dの底に緑の点）でのブロブの中央値はy座標を決定し、そして5の特徴点（ヘッドチップ、半ば頭、中央体に割り当てる、半ば尾、尾の先端）。 </li><li>その前のフレームから決定され、動物の重心を中心とした画像フレームをクロップした後、連続したフレームを処理します。 </li><li>手動で最初のフレームのためのヘッドの向きを割り当て、ドット積betweを使用二つの連続フレームからの配向ベクトルエン自動的に頭の向きを決定する。その結果を検査し、不正に割り当てられた場合は、手動でヘッドの向きを反転させます。 </li></ol></li><li>それは神経質な外観を持っている場合、ヘッドチップを接合することにより、動物の軌跡をプロットし、中央値と平均値フィルタを用いて平滑化する（n = 3）であった。背景画像との軌跡を重ね、5つの特徴点（ 図2Eを参照）を使用して、魚の中線を補間する。 </li><li>瞬時EODレート（100 Hzのサンプリングレート）と平均（0.0625秒の時間窓）をリサンプリングすることにより、各撮像時の平均EOD率を計算する。時間を一致させたEOD率から求めた擬似色で軌跡をプロットした（ 図2F参照 ）背景画像に重ね合わせる。 </li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

私たちの技術の重要性。要約すると、我々は最初の大水槽の建設やWEFによって生成自発的探索行動を観察する隔離室を説明した。次に、複数の電極対を用いてリアルタイムでEOD速度および無拘束魚からの移動状態を記録および追跡する技術を実証した。最後に、我々は、時間同期の方法で水を介して赤外線ビデオ記録技術、および上体位置姿勢を測定する画像追跡アルゴリズムを記載した。実験準備として、WEFは、アクティブな電気感覚のサンプリングレートに等しく容易に定量EOD率を示すことにより、アクティブな感覚誘導行動を調​​査するための重要な利点を提供しています。これらの技術の組み合わせは、拘束されていないWEFからの自然な行動の正確で信頼性の高い長期的な観察​​8を有効にすることができます。さらに、我々のセットアップの大部分は、FRを構築することができますOM建材や容易に入手、電子部品に広く利用できる。ここに記載された技術が開発され、近年、我々の実験の要件を満たすようにテストされている。したがって、我々は自由遊泳WEFからの自然探索行動の今後の研究のためにこれらの技術をお勧めします。 <p class="jove_...

背景 。動物の行動に関する定量的実験（ 例えば強制選択、ショック回避、T-迷路などが ）一般的に感覚運動技能、学習と記憶形成に関する特定の仮説を調査するために利用される。しかし、これらの制限の実験は、天然の動物の行動の豊かさの多くを欠場し、行動の基礎となる神経基盤の単純化モデルとなる可能性が高い。より自然な条件の下での実験は、それゆえ我々は、より完全に種の行動レパートリーを探ることのできる重要な補完である。自由に動く動物を含む実験は、しかし、このような動きによって誘発される記録の成果物として、それぞれの技術的な課題に対処する必要があります。刺激誘発反応とは異なり、自然発生探索行動を予測することはできません。このように実験対象は常に監視され、長期間にわたって追跡されなければならない。具体的な研究課題では、CANベスト厳選された生物および利用可能な技術的なツールによって対処する。例えば、そのような遺伝的にコードカルシウムセンサーとして光記録及び刺激技術1および2の光遺伝学正常に自由に遺伝モデル生物の3-5を移動させるために適用されてきた。代わりに、小型化された神経遠隔計測システムは、記録することができますし、小動物の6,7の移動を自由に刺激する。 電気魚 。 WEFの種は、彼らの身近に感知するために以上の長距離での通信を可能にする、電気オルガン放電（EODs）を生成します。 EODsの時間的なパターンは、自己の運動8,9、感覚刺激10,11、および社会的相互作用12,13等の異なる条件で異なります。連続的な擬似正弦波形を生成するための波型の種とは対照的に、パルス型WEF種は、離散的なパルス列を生成する。一般に、パルス型種展示MORE変数EOD率が波型種と比較し、そして動物のEOD率は密接に彼らの感覚周囲10,14の新規性の内容を反映している。パルス型の種はすぐに新たな感覚摂動（新規性応答10,11,14）への対応の単一パルス周期内でパルス間間隔（IPI）を短縮することができます。これらの魚の継続的な電気挙動は、外部からの制御不能な感覚刺激によって乱さすることができ、かつ、振動、音、電気、光などの刺激の異なる種類のトリガーノベルティ応答を知られている。そのため、特別な措置は、自由遊泳WEFの長期観察中に外部感覚刺激をブロックしたり、減衰させるように注意する必要があります。このように、EOD速度及び移動軌跡の変化は、具体的に実験者によって提示された刺激に起因し得る。 水槽と隔離室。そこで振動吸収材料の複数の層を置いたU大水槽（2.1 MX 2.1 MX 0.3メートル）NDER、光、電気的ノイズ、音と熱流束の外部ソースをブロックするために絶縁された筐体でタンクを囲んだ。 EOD率は、このように水温がしっかり南米WEFの種のために熱帯の範囲（25±1℃）に調節した、周囲の温度15,16によって異なります。私たちは、主に2次元（ 図1A）に制限されたWEFの空間探索行動を観察するために大きな浅い（10cmの水深）タンクを構築した。タンクは、空間的挙動を観察するために、中央の場に分配し、四隅の区画は、別々に、個々の魚（ 図1B）を収容する。各区画は、個人間の電気通信を防ぐために、防水建てられました。中央アリーナ動物のアクセスは4電動ゲートで外部からコントロールした。ゲートは、区画間に配置され、ロックされたときには、水密になったナイロンウィングナットで。 WEFは、金属に敏感に反応するので、全く金属部分は水中では使用されなかった。 EOD記録 。 EODsは17,18（Mormyrids中）単一または（Gymnotiforms中）の複数の空間的に分布電気器官の活性化によってステレオタイプのようにして生成される。髄ペースメーカーは、今度は前脳19から軸索投射を受ける間脳prepacemaker核、などの高次脳領域から直接、神経の入力を受け取るため、EOD率の一時的な変調は、より高いレベルの神経活動を明らかにすることができます。しかし、EOD時期は慎重に生波形記録から抽出され、動物の運動誘発性の歪みによってバイアスされていないする必要があります。 WEFによって生成される電界はダイポールとして近似することができるため、記録電極におけるEODパルス振幅は、動物、電極8,20間の相対距離と方向に依存する。動物の自己MOVEMエントは、このような動きは、異なる電極でのEODの振幅が（6月ら 8の図2（b）参照 ）は、揮発性の方法で経時的に変化させ、動物と電極との間の相対的なジオメトリを変更してください。電子オルガンの異なるセットからの相対的な寄与は、テール曲げて導入されたボディの長さと地元の曲率に沿ってそれらの位置に依存しているため、さらに、自己の運動もまた、記録されたEOD波形の形状を変更。 EOD振幅と形状の動きによって誘発される歪みは不正確で信頼できないのEODタイミング測定につながることができます。我々は、空間的に異なる位置に記録された複数のEOD波形を平均化することにより、かつ正確に自由遊泳WEFからEODタイミングを決定するために、エンベロープ抽出フィルタを追加することによってこれらの問題を克服した。加えて、我々の技術は、動物がEODの変化に基づいて、静止または能動的に移動しているかどうかを示すEOD振幅を測定する時間の経過とともに振幅（ 図2Eと2Fを参照してください）。我々は、コモンモードノイズを低減するために、記録電極対から差動増幅された信号を記録した。 EODパルスが不規則な時間間隔で生成されるため、EODイベントの時系列は、可変サンプリングレートを有する。選択肢の解析ツールによって必要な場合EOD時系列は、補間によって一定のサンプリングレートに変換することができる。 ビデオ録画 。 EOD記録は動物の総運動の活動を監視することもできますが、録画は、動物の体の位置と姿勢の直接測定を可能にします。近赤外（NIR）照明（λ= 800〜900 nm）のWEFsは暗闇の中で最も活発であり、その目はNIRスペクトル23,24に敏感ではないので、自由に魚21,22水泳の非摂動目視観察を可能にします。ほとんどのデジタル画像センサ（ 例えば CMOSまたはCCD）がwavelengtとNIRスペクトルをキャプチャすることができますフィルタ25をブロックする赤外線（IR）を除去した後800〜900 nmのHレンジ、。特定のハイエンド消費者向けのウェブカメラは、高精細、広視野角や画質に匹敵する、またはプロ級の赤外線カメラよりも優れて利用できる、はるかに大きなコストを生成することができ、良好な低照度感度を提供しています。また、一部の消費者向けのウェブカメラは、品質上の損失でビデオを圧縮することによって拡張された録画時間を許可する記録ソフトウェアにバンドルされています。ほとんどのプロ級のカメラは、デジタル化された信号と映像とのタイミングを合わせるために26時間の同期TTLパルス出力またはトリガTTLパルス入力を提供していますが、この機能は、消費者向けのウェブカメラで一般に存在しない。しかしながら、映像記録信号デジタイザとの間のタイミングを正確に同時に、カメラと信号デジタイザーで周期的に点滅IR LEDを撮像して一致させることができる。最初と最後のIRパルスタイミングを使用することができるs信号デジタイザ時間単位及びその逆に映像フレーム番号を変換するための2つのタイム較正​​マーカー。 照明＆背景 。水を介して、撮影は、水の表面での光の反射により、技術的に挑戦することができます。水面、水中、水上ビジュアルシーン、そして曖昧な視覚的特徴を反映するために、ミラーとして機能することができ、したがって水上記のシーンは、視覚的な干渉を防止するために特徴のないレンダリングしなければならない。画像の順序全体水槽では、カメラは水の上に直接配置される必要がある、そしてそれは、水面上での反射を防ぐために小さな視野穴の上の天井の後ろに隠されるべきである。光源が誤って投影される場合には更に、水の表面がグレア及び不均一な照明を生成することができる。間接照明は、天井に向かって光源を目指したことで全体の水槽の上に均一な輝度を達成することができますように、天井と周囲のWALlsが水面に達する前に、光線を反射して拡散することができる。カメラ（ 例えば 850 nmのピーク波長）のスペクトル応答と一致する赤外線照明器を選択してください。光源からの電気的ノイズは、LEDライトを使用し、ファラデーケージの外でDC電源装置を配置することによって最小限に抑えることができる。魚は近赤外波長で白色の背景によく対比さ以来、タンクの下に白い背景を配置します。同様に、隔離室の内面上に白色マットの使用は、均一で明るい背景照明を供給する。 ビデオトラッキング 。録画した後、自動画像追跡アルゴリズムは、経時的に、動物の身体の位置及び姿勢を計測することができる。ビデオトラッキングを自動的にのいずれか、すぐに使用できるソフトウェア（視点又はEthovision）、またはユーザープログラム可能なソフトウェア（またはOpenCVのMATLAB 画像処理ツール ）によって行うことができる。画像追跡の最初のステップとして、有効なトラッキングエリアは、（動作マスキング）の外側の領域を除外するために幾何学的形状を描くことによって定義される必要がある。次に、動物のイメージは、動物を含む画像から背景画像を差し引くことにより、バックグラウンドから単離する必要がある。差分画像は、重心と配向軸がバイナリモルフォロジー演算から計算することができるように、強度閾値を適用してバイナリ形式に変換される。 Gymnotiforms 27〜29と30〜32 Mormyridsでは、電子受容密度は、頭部領域の近くに最高であるため、任意の瞬間にヘッド位置が最も高く、感覚の鋭敏さの位置を示しています。頭部および尾部の位置が自動的に画像回転と境界ボックスの操作を適用することによって決定することができる。頭部および尾部端部は手動で最初のフレームで、二つの連続するフレームを比較から、それらの位置を追跡することによってそれらを定義することにより、互いに区別することができる。

<table><tbody><tr><td>Aquarium Construction</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気シールドフロアヒーター</td><td>ThermoSoft Corp.、IL、USA</td><td>ThermoTile</td><td>www.thermosoft.com</td></tr><tr><td>強化ガラスパネル</td><td>ジェネリック</td><td></td><td>0.5 インチ厚く、水族館建設に使用</td></tr><tr><td>水族館グレードのシリコーン</td><td>ジェネリック</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>アクリルシート</td><td>一般</td><td></td><td>0.25インチ厚、つや消し白</td></tr><tr><td>天然ゴムシート</td><td>一般</td><td></td><td>0.25インチ厚</td></tr>サーボ<tr><td>モーターHTECHRCD Inc.、韓国</td><td>HS-325HB、180度回転</td><td>www.servocity.com</td><td></td></tr><tr><td>サーボモーターアームマウント</td><td>HITECHRCD Inc.韓国</td><td>56362ラージスプライン</td><td>www.servocity.com</td></tr><tr><td>サーボモーターコントローラー(6チャンネル)</td><td>Sparkfun</td><td>ROB-09664</td><td>Micro Maestro 6チャンネルUSBサーボコントローラー</td></tr><tr><td>アクティブUSB延長ケーブル</td><td>C2G</td><td>38990</td><td>12 m USB 2.0 Aオス⇔メス4ポートアクティブ延長ケーブル</td></tr><tr><td>排気ファン</td><td>Nutone</td><td>ILFK120</td><td>www.homedepot.com</td></tr><tr><td>垂直水族館フィルター</td><td>テトラ、ドイツ</td><td>ささやき内部パワーフィルター-40i</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>砕いた珊瑚</td><td></td><td></td><td>タンクのpHを上げるために使用 water</td></tr><tr><td>EOD Recording Setup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphite Electrodes</td><td>Staedtler, Germany</td><td>Mars Carbon 2-mm type HB</td><td>Shave the outer coating</td></tr><tr><td>Physiological Amplifier/Filter</td><td>Intronix, Canada</td><td>2015F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>同軸ケーブル</td><td>汎用</td><td>RG174</td><td>電極アセンブリ用</td></tr><tr><td>同軸ケーブル</td><td>汎用</td><td>RG54</td><td>配線用</td></tr><tr><td>RG-174</td><td>アンフェノール コネックス</td><td>112160</td><td>電極アセンブリ用</td></tr><tr><td>RG-54</td><td>アンフェノール コネックス</td><td>112116</td><td>配線用</td></tr><tr><td>信号デジタイザー ハードウェア</td><td>ケンブリッジ エレクトロニック デザイン、英国</td><td>パワーMKII 1401</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>信号デジタイザソフトウェア</td><td>Cambridge Electronic Design, UK</td><td>Spike 2. ver 7</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ビジュアルトラッキングセットアップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>白色LEDライト</td><td>IKEA、スウェーデン</td><td>DIODER 201.194.18</td><td>www.ikea.com</td></tr><tr><td>赤外線LEDライト(850 nm)</td><td>Scene Electronics、中国</td><td>S8100-60-B / C-IR</td><td>内蔵ファンを取り外す</td></tr><tr><td>USBウェブカメラ</td><td>Logitech Inc.、CA、USA</td><td>C910</td>赤外線<td>ブロッキングフィルターを取り外す電動</td></tr><tr><td>カメラ</td><td>Logitech Inc., CA, USA</td><td>Quickcam Orbit</td><td>Remove Infrared blocking filter ビデオ</td></tr><tr><td>録画ソフトウェア</td><td>Logitech Inc., CA, USA</td><td>Logitech Quickcam Software</td><td>Download from www.logitech.com</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks, MA, USA</td><td>2012a</td><td>画像処理ツールボックス</td></tr></tbody></table>

自由水泳弱電気魚の長期的な行動の追跡

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

長期の行動追跡は、発生頻度の少ないものを含めて天然の動物行動を捕捉し、定量化することができます。このような探査と社会的相互作用のような行動は最高の気ままな、自由に行動する動物を観察することによって調べることができる。弱い電気魚（WEF）ディスプレイ、電気オルガン放電（EOD）を放出することによって容易に観察探索および社会的行動。ここでは、同期EOD、身体位置、および長期間自由遊泳WEFの姿勢を測定するために3つの有効な技術を記載している。まず、光、音、振動などの感覚刺激の外部ソースをブロックするように設計された隔離室の内部に実験槽の構成を記載している。水槽は、4つの試験片を収容するために区画され、自動化されたゲートは、遠隔中央アリーナに対する動物のアクセスを制御した。第二に、我々は自由にWEF水泳より正確で信頼性のあるリアルタイムのEODタイミング測定方法を説明。動物の身体の動きに起因する信号歪みは、空間的および時間的平均化処理ステージで補正される。第三に、我々は非摂動夜行性動物の行動を観察する水中近赤外イメージングのセットアップについて説明します。赤外光パルスは、長い記録時間にわたってビデオ及び生理学的信号間のタイミングを同期するために使用した。私達の自動化されたトラッキングソフトウェアは、水生シーンで確実に動物の身体の位置や姿勢を計測する。組み合わせて、これらの技術は、自由に確実かつ正確な方法で、弱電気魚の水泳の自発行動の長期的な観察を可能にする。我々は我々の方法は、同様に探索や社会的行動との生理学的信号を関連付けることにより、他の水生動物の研究に適用することができると信じています。

EODの追跡結果彼らのユニークな位置と方向（ 図2Cの上部）から予想されるように異なった電極対から記録されたEOD波形は振幅と形状に変化した。複数の電極対の使用は、タンク内のWEFのすべての可能な位置および向きで強い信号の受信を確実にした。エンベロープ波形（ 図2C下 、緑のトレース）は常に正確（= IPI -1）パルス間の間隔と瞬時EOD率を決定するための信頼できる時刻のマーカーを務めEODサイクルごとに単一のピークを含んでいた。連続したEODピークが参加し、線形補間を一定の時間間隔（ 図2Dトップ 、黒のトレース）で、瞬時EOD率も同様に一定の時間間隔（ 図2D底 、ピンクの線）で補間されたされた。一定時間のリサンプリング手順は、時間同期が容易であること運動軌道とEOD信号をトゥイーンし、常にサンプリングされた時系列データのための分析ツールより多くから活用することができます。動物が残ります（ 図2Eトップ</s...

我々は、自由に同期して、感覚の内部に特別に設計された水槽の両方で正確かつ確実に、動物の電気器官吐出​​タイミング、上体位置姿勢を測定することにより、長時間にわたって弱電気魚の水泳の自発的挙動を研究するための技術のセットを記述隔離室。

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

この手順の全体的な目的は、自由に泳ぐ魚から生理学的信号とビデオを同期して記録することで、自発的な空間探索を記録することです。これは、感覚遮断チャンバーで囲まれた大型の実験水槽を構築することによって達成されます。次に、電気器官放電を正確かつ確実に測定するためのマルチチャンネル電気記録装置を構築します。赤外線ビデオカメラを用いて、動物の身体姿勢と軌跡を同期して追跡します。これにより、動物の身体運動と能動的な電気感覚サンプリング率との相互作用を示す結果が得られます。動物を拘束して外部刺激を与え誘発反応を導き出す既存の手法と比較した本手法の主な利点は、自由に振る舞う動物の自発的かつ自然な行動を非侵襲的に観察できる点にあります。この手法は、自己誘導的な探索行動における能動的センシングの役割など、神経病理学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。私たちは、パルス波型弱電気魚の自己誘導的な探索および空間学習における能動的な電気感覚サンプリングの役割を研究し始めた際に、初めてこの手法を考案しました。動作に伴う記録アーチファクトの発生や、水中での照明およびイメージングに伴う困難さがあるため、この手法を視覚的に提示することは極めて重要です。チャンバーは、熱勾配フォームパディングの上に電気的に遮蔽された加熱要素を備えた、防振台の上に設置されています。水槽は、中央アリーナと4つのコーナーコンパートメントで構成されています。各コンパートメントは、電気器官放電を追跡するための電動ゲートで仕切られています。中央アリーナの曲面に、8本のグラファイト電極を等間隔に設置します。ケーブルアセンブリを使用して、すべての電極をアンプユニットに接続してください。互いに90度の方向に配置された2本の電極をペアにし、差動増幅を行います。すべての同軸シールド線をファラデーケージに接続し、確実に接地させてください。Spike2ソフトウェアを使用して信号処理を調整し、すべての記録チャンネルにDC除去プロセスを追加します。次に、すべての記録チャンネルに整流プロセスを追加します。4つの記録チャネルすべてを合算してバーチャルチャネルを作成します。バーチャルチャネルに二乗平均平方根（RMS）処理を加えることで、EODパルスごとの単峰性エンベロープを抽出します。次に、このバーチャルチャネルからリアルマークチャネルを作成します。偽陽性を避けつつ、すべてのEODパルスを捉えられるレベルに閾値を設定します。EODレートをリアルタイムで監視するには、リアルマークチャネルのチャネル表示オプションを瞬時周波数モードに設定します。リアルマークチャネルを複製し、表示オプションをウェーブ4モードに設定することで、魚の動きをリアルタイムで監視します。EOD振幅勾配の二乗平均平方根（RMS）から活動レベルを算出するには、実マークチャン

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは、麻痺したゼブラフィッシュの幼生の求心性ニューロンからの電気信号の記録を、側線神経節の近くにマイクロピペットを配置し、信号捕捉のための緩いシールを形成する方法を示しています。細胞外溶液は、この過程でニューロンの生存率を維持します。...

動けなくなったゼブラフィッシュ幼生における求心性ニューロンからの電気信号のモニタリング

ゼブラフィッシュの個体やグループを追跡できる3D自動ビデオシステムの使用について説明しています。応用例として、NMDA受容体拮抗薬MK-801がゼブラフィッシュの群れに及ぼす影響について検討します。...

自動3D追跡システムを使用して、成魚のゼブラフィッシュの個体群と群れを記録

ここで時間の長い期間にわたって動物を個別に追跡するためのプロトコルを提案する.コンピュータ...

Cohoused 水生動物の長期のビデオ追跡: ノルウェー オマール海老 (アカザエビ norvegicus) の毎日の歩行活動の事例

てんかんのゼブラフィッシュモデルにおける行動と生理学的解析

ここでは、行動と生体染色、メカノセンシング メキシコの血脈のシリーズの高スループット研究の手法を提示します。これらのメソッドは、動作研究実用的かつコスト効果の高い方法を提供するフリー ソフトウェアとカスタム...

行動追跡とメキシコの血脈の Neuromast イメージング

このプロトコルは、歩行動作とメキシコの血脈睡眠を定量化するための方法論を詳しく説明します。前の分析は、これら社会的収容魚の動作を測定するため拡張されています。このシステムは、睡眠と他の魚種の活動に関する研究に広く適用できます。...

睡眠とメキシコの血脈の自発運動の自動測定

自由に泳ぐ金魚の脳からの細胞外神経信号を記録するための新しい無線技術が提示される。記録装置は、マイクロドライブ、ニューラルデータロガー、防水ケースの2つのテトロドで構成されています。データロガーとそのコネクタを除くすべての部品はカスタムメイドです。...

自由に泳ぐ魚における可動テトロデスによるニューロンの無線電気生理学的記録

我々は、モデル脊椎動物の毛細胞系における運動コマンド中の、無毛ニューロン活動の変化をモニターするプロトコルを記述する。...

ゼブラフィッシュで泳ぐ後側面線の発泡性ニューロンの活動

脊髄損傷後の機能回復が可能な成体ゼブラフィッシュは、神経再生の先天的なメカニズムを解明するための最高のモデルシステムです。ここでは、脊髄再生の機能的読み出しとしての水泳持久力および水泳行動アッセイについて説明する。...

成体ゼブラフィッシュの水泳持久力と水泳行動の評価

光学的透明度は、ゼブラフィッシュの細胞生物学的および生理学的研究にとって大きな利点です。骨格筋および隣接組織の成長が全身の成長とどのように統合されるかについての新しい洞察を可能にする、個々の動物の細胞増殖を測定するための堅牢な方法が説明されています。...

電気的活動の変化を受けた個々の生きたゼブラフィッシュの骨格筋成長のリアルタイムおよび反復測定

多室社会的嗜好課題は齧歯類からゼブラフィッシュに応用され、モデル生物の社会的行動の研究を促進しています。このプロトコルは、ウェブカメラとオープンソースソフトウェアを用いてゼブラフィッシュの社会的嗜好を測定する低コストの3チャンバーオープンタンク課題を検証し、学部生の研究や教育に利用可能にします。...

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)における社会的嗜好を調査するための低コスト代替案:3室オープンタンク自由泳ぎ課題

学ぶ 弱電気魚の自由水泳行動を長期追跡する方法。電気器官放電と体の位置・姿勢を同期計測し、自発的行動を非侵襲的に観察できます。神経科学と行動生物学の研究に応用可能です。

自由水泳弱電気魚の長期的な行動の追跡

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