使用ハチノスツヅリガモデル生物として研究するレジオネラ·ニューモフィラ感染症

この手順の全体的な目標は、ワックス蛾ガレリアメラノーマの幼虫を使用して、細菌性病原体レジオネラニューモフィラの病因を分析することです。はじめましょう。これは、次の72時間の間に注射によって幼虫をlニューモフィラ株に感染させることによって達成されます。

幼虫の死亡率の誘導は、可動性の喪失によって示され、黒い色素沈着の幼虫の出現は、さまざまな時点で血リンパのために犠牲になります。次に、血リンパ液を播種して細菌を列挙し、昆虫細胞を視覚化します。最終的に、細菌の増殖の解析と免疫蛍光顕微鏡の使用により、in vivo感染中に確立された細胞内ニッチレジオネラ菌と株間の病原性の違いについての洞察が得られます。

レジオネラ菌マウスおよび細胞培養モデルに対するこの技術の主な利点は、倫理的により受け入れられ、多細胞生物の多数のレジオネラ菌株の迅速かつ費用対効果の高い分析を可能にすることです。私の研究室の博士課程の学生であるハーディングは、常にバイオセーフティでL Pneumophilaをバイオセーフティーで研究しています 地域のルールに従って微生物安全キャビネットの封じ込めレベル2で、最初に細菌プレートを4日間インキュベートします。次に、幼虫に感染する前日、Resusは、1ミリリットルの予温YEブロスにいくつかのコロニーを含む細菌で満たされた1つのループを懸濁し、懸濁液の吸光度を600ナノメートルで測定します。

次に、0.1のOD600で新鮮な3ミリリットルのYE培養物を接種します。培養物を摂氏37度で200 RPMのシェーカーで21時間インキュベートし、指数関数後までインキュベートして、感染に使用できるようにします。懸濁液の吸光度を600ナノメートルで測定します。

次に、培養物を希釈して、ミリリットルあたり10億CFUを与えます。DPBSでは、先端が鈍いピンセットを使用して、10センチメートルのペトリ皿の底に円形の10センチメートルの濾紙を置き、Gメラノーマの幼虫用の容器を準備します。ほぼ同じサイズの健康な幼虫10匹を濾紙の上に置き、不健康な茶色またはしみのある昆虫を捨てます。

健康な幼虫は、暗い変色の領域がなく、均一にクリーミーな色をしており、すぐに自分自身を書くことができます。裏返した場合は、濾紙を安全キャビネットにテープで留めて注入プラットフォームを準備します。次に、P1000チップを濾紙にテープで貼り付けます。

次に、70%エタノールを吸引し、シリンジを70%エタノールで少なくとも10分間インキュベートすることにより、20マイクロリットルのマイクロタイターシリンジを滅菌します。滅菌水を数回吸引して排出することにより、シリンジから残留エタノールを取り除きます。.次に、1ミリリットルあたり10億CFUのLニューモフィラ懸濁液を10マイクロリットル吸引します。

幼虫を1匹取り、優しく、しかししっかりと取ります。オンにします。その背中はP1000の先端に曲がっています。

シリンジの先端を幼虫の右前脚の上に置きます。次に、針の先端をプロレッグにそっと挿入します。針が幼虫の内側にあり、滑らかであることを確認してください。

10マイクロリットルのボーラスをすべて注入します。シリンジが正しく挿入されていれば、シリンジだけで幼虫を拾い上げ、チャンバーに移すことができるはずです。条件ごとに合計10匹の幼虫を注入し、DPBSのみをコントロールとしてさらに10匹の幼虫を注入します。

注入プロセスは、手順の中で最も技術的に困難であり、練習が必要になります。最後に、皿をテープで閉じ、二次封じ込めに置きます。実験期間中、摂氏37度で保管してください。

死亡率は、感染後数ポイントで分析する必要があります。.感染した幼虫の死亡率を調べるには、鈍い先端ピンセットを使用して幼虫を裏返し、脚の動きを探します。健康な幼虫はすぐに自分自身を書くべきです。

色素沈着は、感染に対する強い免疫反応を示しています。少しでも動きがある場合は、幼虫をさまざまな時間に生きていると数えます。3匹の幼虫をランダムに選択し、14ミリリットルのチューブに入れます。

脚の動きが観察されなくなるまで、チューブを氷の上に5〜10分間置きます。次に、幼虫をペトリ皿に移します。次に、メスを使用して尾の近くの2つのセグメントの間に切開を行い、各幼虫の血リンパを収集します。

腸内細菌による汚染を防ぐために、切開部を腸から遠ざけてください。幼虫から血リンパを絞り出して、滅菌済みの1.5ミリリットルの遠心分離チューブに入れます。1匹の幼虫は、15〜50マイクロリットルの血リンパを与えます。

さて、血リンパは10分以内に使用されなければならず、さもなければそれは昆虫の生存能力を決定するために凝固します。彼は、20マイクロリットルの血リンパ液と20マイクロリットルのトライアンブルー溶液を96ウェルプレートの1ウェルで混合し、この方法で3ウェルをロードします。反応液を室温で5分間インキュベートします。

次に、反応ごとに10マイクロリットルを使用して、ヘモサイトメーターで生存可能な非青色細胞をカウントします。顕微鏡検査のために血球を処理するため。血リンパコレクションを24ウェルプレートの10〜15mmガラスカバースリップにピペットで移します。

次に、0.5ミリリットルのDPBSを追加し、血リンパを穏やかによく混合します。エアロゾルタイト遠心分離機プレートホルダーを使用して、プレートを室温で500Gで10分間遠心分離します。次に、倒立顕微鏡を使用して各ウェルを検査し、細胞が付着していることを確認します。

次に、上清を取り除き、ウェルの壁に0.5ミリリットルのDPBSを追加して細胞を3回慎重に洗浄します。プレートを数回揺り動かし、DPBSを吸引します。固定と染色の詳細については、テキストプロトコルに記載されています。

細菌性CFUを定量するには、無菌YE培地で血リンパ液を10倍に連続希釈します。次に、SPECTマイシンを含むCYEプレートのベースを6つの等しいセクターに分割します。プレートの各セクションで最も希薄な希釈から始めて、各希釈液の25マイクロリットルを3滴プレートします。

これらのプレートをインキュベートし、後でコロニーを数えます。Gメラン幼虫は野生型に感染し、ICM欠損症であった。Lニューモフィラ株 1,000万CFUの株1 30 Bに感染すると、24時間以内に100%の死亡率が得られました。

しかし、機能的なICM T 4 SS分泌系を持たないデルタA株は、細菌の取り込みがその病因に重要であるかどうかを判断するための毒性物質でした。このモデルでは、幼虫を細胞Dで前処理し、その後、阻害剤のみで感染させた治療は24時間後の生存に影響しなかったが、前処理された感染幼虫は対照と比較して有意に高い生存率を示した。明確に定義されたLCV局在化エフェクターのフラグメントを発現するgMelan Legionellaのエフェクタータンパク質の発現を検証し、細胞内局在を決定するため。

SID Cを4つに融合させ、末端HAタグを使用して幼虫に感染させ、顕微鏡で分析して細菌の複製を追跡しました キネティクス幼虫は感染後数ある時点で犠牲にされ、抽出された血リンパのグラムあたりのCFUは、5時間での最初の浸漬後に決定されました、野生型細菌のCFUは増加します。ただし、デルタ株は複製を受けず、18時間でクリアされます。感染した昆虫から細胞を抽出し、感染後5時間でトライアンブルー排除法を用いて生存細胞をカウントしたところ、差はありませんでした。

Incyteは株間でカウントします。しかし、18時間までに野生型の血中濃度は大幅に低下しましたが、デルタAに感染した幼虫ではそうではありませんでした。このin vivoの結果は、Lニューモフィラが細胞内で複製し、その後それらを溶解することを示唆しています。

このビデオを見た後、幼虫、抽出物、血液、リンパ液、およびプロセスに感染する方法をよく理解しているはずです。彼はレジオネラ菌の病因のさまざまな側面を分析するためにサイト化します。