Name: 使用ハチノスツヅリガモデル生物として研究するレジオネラ·ニューモフィラ感染症 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 学ぶレジオネラ・ニューモフィラの病原性解析法。ハチノスツヅリガ幼虫を用いた感染実験で、細菌の増殖と血球への侵入を可視化し、マウスモデルに代わる倫理的・効率的な研究手法を確立する。

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1。 Lの準備感染のニューモ <ol><li>チャコール酵母エキス（CYE）プレート（2g / Lの活性炭、10g / Lの酵母エキス13 g / Lの寒天、10g / LのN-（2 - アセトアミド）-2 - aminothanesulfonic酸（ACES）を、調製1 g / Lのα-ケトグルタル、0.4グラム/ LのL-システイン塩酸及び0.25グラム/ Lのピロリン酸第二鉄、pHは6.9）。 注：必要に応じて、プレートをCYEする（6μg/ ml）を、カナマイシンを追加（25μg/ mlの）および/またはクロラムフェニコール。 <ol><li>すべてのL.を実施ローカルルールに準拠した微生物安全キャビネット（MSC）でのバイオセーフティ封じ込めレベル2（BSL-2）でのニューモ作品。 </li></ol></li><li>ストリークL. CYEプレート上-80℃のグリセロールストックからのニューモ </li><li> 37℃で4日間プレートをインキュベート 注：4日間のプレートのインキュベーションは、大幅にLの病原性を増加Gのニューモ 3日間のインキュベーションの上mellonella。 </li><li>ある日、感染の前に、1ループFUを再懸濁予め温め1ml中の細菌のllの（いくつかのコロニーを含む）（37℃）酵母エキス（AYE）ブロスをACES及び分光光度計を用いて600nmで（OD 600）での吸光度を測定する。 </li><li>最終OD 0.1の600に（必要に応じて抗生物質）の新鮮な3ミリリットルのAYE文化を接種する。 <ol><li>メディアはメディアだけの無菌性を確保するための制御が含まれる。 </li></ol></li><li> 21時間、200rpmで振盪インキュベーター中で37℃で培養する。 注意：細菌は、感染38対数期後に成長しなければならない。 21時間成長させることは実験を標準化することを可能にする。 注：タンパク質誘導に必要な場合には、一晩イソプロピル0.5 mMのβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を追加します。 </li><li> 600（細菌がポスト指数増殖期、OD 600 2.5〜3にする必要があります）外径を測定します。 </li><li>無菌のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）中で1×10 9 CFU / mlのを与えるために、細菌培養を希釈する。 ノート：以前の結果に基づいて、1のOD 600が 1×10 9 CFU / mlに相当するが、これは、異なるL.のために確認されるべきであるニューモ株 。 注：プラスミドからのタンパク質の誘導が必要な場合は、接種物にIPTGを1 mMのを追加します。 </li><li>予想されるCFUが接種物中に存在していることを確認するための対照としてセクション9で説明したように接種物プレート。 </li></ol> 2。幼虫の調製<ol><li>十分なG.を購入商業的供給者からmellonella幼虫 。幼虫は5 番目か（長さ約2〜3センチメートル間）6 番目の齢の段階で出荷され、すぐに使用に適している。 注意：幼虫は、以前に39記載されているか、リア記述する方法を。 注：幼虫は2週間まで室温で保存することができ、食品を必要としない。すぐに蛹化の兆しを見せて任意の幼虫を捨てる。 </li><li> PLACで幼虫のための容器を準備します10センチメートルペトリ皿の底に10cmの濾紙の輪をING。 </li><li>無愛想な先端ピンセットを使用して、ペトリ皿にほぼ同様の大きさの10の健康な幼虫を置く。 注：不健康な茶色やしみを見昆虫を廃棄します。健康な幼虫を均一にクリーミーな暗い色落ちのない分野で着色し、裏返した場合にすぐに自分を正しくすることができますされています。 </li></ol> 3。 Gの感染mellonella幼虫 <ol><li>表面に、濾紙の輪をテーピングによる注射プラットフォームを準備します。 </li><li>安全に注射プラットフォームを作成するために、ろ紙に水平P1000チップをテープで固定します。これは、無菌である必要はない。 </li><li> 70％エタノールを吸引し、少なくとも10分間インキュベートすることによって20μlのマイクロシリンジを殺菌する。 <ol><li>注入しながらパンク証拠手袋を着用し、 </li></ol></li><li>数回吸引し、滅菌水を排出することにより、任意の残留エタノールを除去します。 </li><li> USI注射器、吸引L.10μlのngのニューモ 1×10 9 CFU / mlのサスペンション。 </li><li> P1000チップの上に曲げ、1幼虫を取り、慎重に、しっかりと再びオンにします。 </li><li>幼虫の正面、右腹脚にわたって注射器の先端を置きます。 </li><li>優しく、それは幼虫の中にあることを確認しながら、腹脚に針の先端を挿入し、スムーズにシリンジの内容のすべてを注入します。 注：注射器が正しく挿入されている場合は、チャンバー内にそれを配置するだけで、注射器を使って幼虫をピックアップすることが可能なはずである。 <ol><li>注射後、数秒間の幼虫を観察します。幼虫は数秒後にクロールを開始しますが、流体を排出しないでください。 </li></ol></li><li> 10 7 CFU L.による感染;簡潔には数時間感染後の幼虫を観察するニューモ 130b は最初の5-8時間のPI内の任意の症状が発生することはありませんので幼虫は黒/グレーのこのポイントの前に、T回っている場合は、彼は実験を中止すること。 注意：1 mMのIPTGで幼虫の接種は、実験の過程で、幼虫の生存率には影響しません。 </li><li>同様にして、幼虫の死亡率を分析するための対照として機能するD-PBSを注射した10幼虫を含む条件あたり10幼虫の合計を注入する。 </li><li>テープペトリ皿を閉じ、二次格納容器内の場所。 </li><li>実験期間中、37℃で標準的な細菌培養器で培養する。 </li></ol> 4。化学阻害剤と幼虫の前処理<ol><li>セクション3.1から3.6で説明したように、感染前に、注射のために幼虫を準備します。 </li><li>前にサイトカラシンDの100μMの溶液10μlを注入、10幼虫の腹脚を残しました。 注：阻害剤を、幼虫への損傷を低減するために、細菌懸濁液異なる腹脚に注入される。 </li><li>対照として、10幼虫へのDMSO 10μLを注入。 </li><li>で幼虫をインキュベート4時間37℃に。 </li><li>フロントにセクション3で説明したように、WT Lの1×10 7 CFUのいずれかで右腹脚前処理幼虫を注入ニューモまたはPBS対照。 </li></ol> 5。幼虫の死亡率の分析<ol><li> 18時間後の感染（PI）で、死亡率のためのすべての感染した幼虫を調べる。 </li><li>死亡率を確認するには、幼虫を裏返し、足の動きを探すために鈍な先端ピンセットを使用し、健康的な幼虫はすぐに彼ら自身を正しくする必要があります。色素沈着は、感染に対する強い免疫反応を示している。どんな動きがある場合は、として生きて数える。 </li><li>死者と生きている幼虫のレコード番号。 </li><li>選択した他のすべての時点で、このプロセスを繰り返します。 注意：インキュベーションは、3日以上継続すると、蛹を見ることができる。任意の蛹を取り外し、で凍結安楽死させる - 20℃の変態が発生する前に。 </li></ol> 6。血リンパの抽出<ol><li>ランダムに選択して3このような5および18時間のPIとして選択された時点で14ミリリットルチューブに幼虫と場所、 </li><li>幼虫の脚部の移動が見られなくなるまで、5〜10分間氷上で、このチューブを配置します。 </li><li>ペトリ皿に、麻酔した幼虫を置き、、メスを用いて、幼虫の尾の近くに2つのセグメント間の切開を行います。 </li><li>体液を収集するために1.5mlの滅菌遠心管に幼虫を絞る。 <ol><li>少なくとも3個体由来のプール血リンパ。一つの幼虫はサイズに応じて血リンパの15〜50μlの間で提供します。 注：血リンパ抽出中には、サンプルの汚染の可能性をもたらし、腸を破壊する非常に簡単です。細菌をプレーティングしかし、抗生物質の選択は、常に必要となります（離れて腸からの）尾部の近くに幼虫を切断することにより汚染を減少させる。 茶色と凝固を回すから体液を防ぐために、プロセスの収集後10分以内に血リンパ：注意してください。 </li></ol></li><li>死んだ幼虫を確保するために、20℃で一晩 - で新しい14ミリリットルファルコンチューブ、シール、所定の位置に幼虫の体を捨てる。 </li><li>死んだ幼虫をオートクレーブローカルルールに従って廃棄してください。 </li></ol> 7。血球生存率の決定<ol><li>上記のような体液を抽出します。 </li><li> 0.02％の20μlの96ウェルプレートの1ウェル中のPBS中（V / V）トリパンブルーを用いて抽出血リンパ液20μlを混ぜる。 </li><li>室温で5分間インキュベートする。 </li><li>血球計数器にロード血リンパ液10μlをし、（青ではない）生細胞を数える。 </li><li>誤差を小さくするために三重に各サンプルを数える。 </li></ol> 8。免疫蛍光顕微鏡用に抽出血球処理<ol><li> 24ウェルプレート10〜15ミリメートルのガラスカバースリップ上に少なくとも3幼虫やピペットから抽出されたプールされた体液を混ぜる。 注意：血球、ガラスに付着することができるようにカバーガラスは、治療を必要としません。 </li><li> D-0.5mlのを追加します。PBSおよび上下にピペットでよく混和すること。 </li><li>エアロゾル気密遠心プレートホルダーを用いて室温（RT）で500×gで10分間プレートを遠心分離する。 </li><li>血球が付着していることを確認するために倒立顕微鏡を用いて各ウェルを調べます。 </li><li>上清を除去し、慎重にプレート2〜3倍の揺れやピペットでD-PBSを除去し、ウェルの壁に0.5ミリリットルのD-PBSを加えることによって、細胞を3回洗浄する。 </li><li> PBS中の4％（v / v）のパラホルムアルデヒド（PFA）0.5mlを添加することによって細胞を固定。 </li><li>室温で20〜30分の間に細胞を培養する。 </li><li>以前のように、D-PBSで細胞を3回洗浄する。 </li><li> 0.5ミリリットルの15mMのNH 4 Clが残留PFAを急冷し、室温で15分間インキュベートし、PBS中に追加します。 </li><li> D-PBSで細胞を3回洗浄する。 注：この段階では、カバーガラスを4℃で一晩保存することができる</li><li> PBS中の0.5 mlの0.1％トリトンX-100を添加し、細胞を透過するようにRTで5分間インキュベートする。 </li&gt; <li>溶液（2％（PBS中w / v）のBSA）で1時間ブロッキングするためのブロック。 </li><li>メーカー指定の希釈でブロッキング溶液で希釈した一次抗体と暗闇の中で、室温で1時間インキュベートする。 </li><li> PBSで3回洗浄します。 </li><li>上記のような細菌の可視化のための二次抗体およびDAPIで1時間インキュベートする。 </li><li> PBSで3回洗浄します。 </li><li>スライドガラス上にマウント試薬の1滴を使用してカバースリップをマウントします。 </li><li>完全にマウントソリューションを乾燥させるために、室温で暗所で一晩インキュベートする。 </li><li>画像は、蛍光顕微鏡上を摺動する。 </li></ol> 9。細菌CFUの定量化<ol><li>腸内細菌叢による汚染を避けるために、プレートをCYE 100μg/ mlのスペクチノを追加します。L.ニューモ株 130bは40をスペクチノは当然抵抗力がある。 </li><li>血リンパの抽出の前に、1.5ミリリットル遠心管の重量を量る。 </li><li>セクション6で説明したように血リンパを抽出し、秤量トンに置くubes、5 mg / mlのジギトニンの1μLを加え、よく混ぜると血球を溶解し、室温で5分間インキュベートする。 </li><li>血リンパでチューブを再秤量し、抽出された体液の重量を決定する。 </li><li>無菌AYE培地で血リンパの10倍連続希釈を行う。 </li><li>ペンを使用して、6等しいセクターやラベルにCYEプレートのベースを分割します。 </li><li>プレートの各セクションにあるプレートの各希釈液25μlを3滴（最も希薄で始まる）。 </li><li> 37℃で一晩最大限のふたで培養する</li><li>滴が十分に乾燥したら、上のプレートを回すと、少なくともさらに2日間、37℃でインキュベートする。 </li><li>各希釈でコロニーを計数することにより抽出された細菌を定量化し、抽出された体液の量に正規化する。 </li></ol> 10。競争指数（CI）の決定<ol><li>両株のブロス培養中とCYE寒天プレートPRIOにも同様に成長していることを確認競争力のあるインデックスを試みるR。 </li><li>セクション1で説明したように、WTまたはカナマイシン耐性変異細菌懸濁液を調製し、1:1の割合で混ぜます。 <ol><li> CYEスペクチノへの接種物（100μg/ ml）をし、CYEスペクチノ/カナマイシンプレート段階希釈</li></ol></li><li>幼虫に感染し、上記のように適当な時点で体液を抽出する。 </li><li>血リンパを抽出し、CYEスペクチノとCYEスペクチノ/カナマイシン上に段階希釈をメッキすることにより生菌数を決定します。 </li><li> CI =（変異出力/ WT出力）/（変異接種材料/ WT接種）を次のように競争力指数（CI）を計算します。 </li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

レジオネラ·ニューモフィラ感染のガレリアmellonella幼虫モデルは、病因のin vivo研究に有用なツールです。ここでは、マクロファージの感染の多くの局面では、G.で要約することができることが示されている毒性および細菌の複製ドット/ IcmをT4BSSの役割とドット/ ICM-エフェクターSIDCの局在を含むmellonellaモデル 。さらに、我々は、アクチン重合の化学的阻害剤が著しくmacophages 47で得られた結果を模倣し、細菌の内在化を幼虫の死亡率を引き起こすのに必要とされるという証拠を支持し、幼虫の死亡率を減少させることを実証する。以前は、L.間の病原性のばらつきが実証されている他の感染モデルにおいて見ニューモフィラ株はG.で確認できmellonellaおよびポスト指数増殖期の病原性因子の誘導は、細菌の病原性に必要である<suそのGを確認したP&gt; 36、 mellonellaは、L.に適したモデルです。 ニューモウイルス感染 。 LのCFUを決定単独あるいは混合感染で感染幼虫からのニューモフィラを大幅モデルの有用性を向上させます。以前は、いくつかの要因は、感染29,48-51の1つ以上のモデルにおける細菌の複製に微妙な効果を有することが発見されている。幼虫は適応免疫系を有していないが、先天性免疫応答の存在は、微妙な表現型を増幅するのに役立つことができる単独でのマクロファージと比較して、より強力な選択を提供する。したがって、これらの株は、おそらく大幅に幼虫の死亡率には影響しませんが、それらはGに細菌の複製やフィットネスの低下示し得る、可能性があるmellonellaモデル 。だけでなく、Lの複製幼虫におけるニューモフィラ 、我々は後半、感染の大幅な血球減少を示している。 Lとニューモはまた、細菌の複製の間接的な測定として役立つことができる血球減少を測定し、その複製サイクルの終了時に宿主細胞を溶解することが期待される。最近の結果は、この絵が最初に37を belivedよりも複雑であることを示唆しているが、血球の枯渇は以前、感染3,52昆虫の死亡率と相関している。最近では、幼虫の飢餓を53免疫応答の抑制を介して感染に対する感受性の増加をもたらすことが示されている。ここに記載されたアッセイでは、幼虫は試験期間のために供給されていなかったし、それが供給された幼虫がLに応答する方法も知られていないニューモウイルス感染 。 G.の利点の一つモデル生物としてmellonellaは、感染した幼虫からの血球の抽出および定量が容易である。前回の動画は、しかし、METの昆虫54,55から血球を抽出するための様々な方法が示されているここで紹介するHODはシンプルで即時処理に適しています。一度抽出し、血球を容易に定量免疫蛍光のために使用される、透過電子顕微鏡またはフローサイトメトリー36 56または培養し、感染流すことができるエクスビボ 3感染に対する細胞の応答を詳細に調査することを可能にする。これは大幅にモデルの柔軟性が向上します。 G.においては、免疫蛍光ための一つの注意点mellonellaはG.に対して検証抗体の供給が限られているmellonellaタンパク質 。しかし、研究は幼虫タンパク質57とヒトの免疫関連タンパク質に対する抗体に対する抗体の生成を実証しているが、Gを認識することが見出されたmellonellaタンパク質は11 G.上の免疫蛍光の可能性を実証mellonella血球 。 Gの使いやすさmellonella感染は可能性の迅速な、ミディアムスループットスクリーニングを可能にし種々のレジオネラ種および株の病原性を比較するために使用され、さらに、そのような接着分子58または他のモデルにおいて病原性のために必要とされる2型分泌系59は 、以前に同定された病原性因子を分析するために使用することができる。また、このモデルの使用は、分泌され、転位エフェクタータンパク質を含む新規な病原性因子の同定およびさらなる特徴付けを可能にする。近年、L.のホスホリパーゼC活性を示されたニューモはGの役割を担っているmellonella病原 60ドット/ ICMのエフェクタータンパク質SDHAは、病原性37に必要であること。加えて、我々は最近、G.において観察される表現型の間に相関があることが実証されているmellonellaおよびA / Jマウス系統37。 これは、環境原生動物および単細胞宿主とムリを補完するために、このツールの価値を強調NEの感染モデル。 G.幼虫ゲノム配列が利用可能となり、より多くの遺伝学的ツールが確立されるとmellonellaモデルは、将来的にはさらに多くの貴重になります。この方向でのステップは、免疫関連のトランスクリプトーム61と鱗翅属 62で遺伝子サイレンシングを進めるためのイニシアチブの形成を詳細に最近の出版が含まれています。 G.を使用することによりmellonella幼虫は、L.の病因を研究するために使用することができる細菌の病原性の単純、迅速な読み出し回数を有するニューモ 。これらのアッセイの確立とLの広いスクリーニングニューモ株および血清群は、この新しいツールの有用性を増加し、Lの我々の理解に貢献していきますニューモ病因。

感染の動物モデルは、細菌の毒性因子の決定に非常に貴重なことが証明されている。しかし、無脊椎動物のモデルは、感染の伝統的な哺乳動物モデルに対する実行可能な代替手段としてますます注目を集めている。ワックス蛾の幼虫は、 ハチノスツヅリガはますます1グラム陽性菌およびグラム陰性菌2,3およびいくつかの病原性真菌4,5を含む重要なヒト病原体の数を研究するために使用されています。昆虫モデルを使用すると、無脊椎動物、G.として、伝統的な哺乳動物モデルに比べて多くの利点を有しているmellonellaは哺乳動物モデルの倫理的な制限を受けない。また、幼虫は容易に維持することができる麻酔なしで注射により感染させ、化学的阻害剤6による前処理を受け、C 7 37℃でインキュベーションを維持する。興味深いことに、Gのいくつかの微生物の病原性との間に良好な相関MELlonella、感染の哺乳動物モデルは、2,8を確立されている。 Gの免疫系の増加理解mellonellaも、このモデル生物の特性を支援しています。哺乳類に見られるような昆虫が適応免疫システムを持っていませんが、抗菌ペプチド9の生産を含む洗練された携帯電話や上腕骨の防御を持っています。血球、細胞の防御の主要なメディエーターであり、アールGの体液（または血液）に見られる最も多くの細胞タイプmellonella 10、これらの細胞は、プロの食細胞であり、両方が取り上げおよび食作用リソソームコンパートメント10,11に分解菌や細菌の侵入を中心に根粒を形成し、物理的に細菌の複製12を制限することで、ヒトマクロファージや好中球に類似した機能を実行します。 レジオネラ·ニューモフィラ、重度pneumoniの原因となる呼吸器病原体である（レジオネラ症）など13高齢者や免疫低下などの影響を受けやすい集団では。 レジオネラは、それが淡水アメーバ14,15の様々な種の病原体である場合には、両方の環境と人工の水源に普遍的に見られる。 レジオネラが生存し、宿主細胞16〜20に275以上のエフェクタータンパク質を移行することが4分泌系（T4SS）を入力ドット/ Icmを（細胞小器官の輸送に欠陥/細胞内増殖）として知られる多タンパク質複合体を利用することによって、これらの専門的な食細胞内で複製されます。これらのタンパク質は、 レジオネラ菌を含む液胞（LCV）の創出につながる、正常な宿主細胞貪食経路を破壊するのに役立つ。 LCVは、リソソームとの融合を回避し、代わりに粗面ER 21,22に似た特殊な区画内に生じた小胞体（ER）由来の小胞を、募集しています。L.ニューモは偶然の人間の道と考えられているフィブリノゲン、それはアメーバ内で複製することができ、同じ戦略は、また、ヒトの肺胞マクロファージ23における複製を可能にする。 哺乳動物宿主は、マウスおよびモルモット24,25を含むヒトレジオネラ感染症のモデルとして特徴付けられている。しかし、マウス系統の大部分は軽度、自己制限感染24を現像近交系アルビノA / Jマウスを除いて、 レジオネラ感染に耐性である26。モルモットモデルはより密接にヒトの疾患25に似ているが、突然変異体およびコストの増加がないことは、その使用27を落胆。さらに、いくつかの無脊椎動物モデルは、 線虫などのレジオネラ·ニューモフィラ感染のために開発されている、 キイロショウジョウバエ29および30〜32アメーバのいくつかの種を28 エレガンス 。しかし、これらのモデルは、Cの弱点、病原性を持っている虫 </em&gt;システムは、このモデルの有用性を制限する、28ドット/ ICM-依存しません。 ショウジョウバエモデルは、細菌の病原性因子が29とが、このモデルが十分に特性決定されていない有望であると思われる調査において有効であることが証明された。単細胞アメーバLの環境のホストであるニューモ分子レベル33での病原性因子の作用を調べるための理想的には、しかしながら、そのようなカスパーゼ34と 、感染に対する哺乳動物宿主細胞応答のいくつかの重要なメディエーターを欠いている。既存のモデルの弱点は、哺乳動物の実験に関連するコストが高く、倫理的な問題に加えて、他の適切なモデル生物29,35の検索につながっている。 我々は最近らは、G. mellonellaは、L.に適したモデルです。 ニューモ病因36,37。このプロトコルに感染するために使用される実験技術の詳細Gを ING mellonella幼虫は、幼虫の道徳を分析し、計数および免疫蛍光のために血球を抽出し、実行可能なCFUでレプリケーションを決定することは、感染した幼虫からカウントします。

<table><tr><tbody><td colspan="4">材料/ 機器</strong</td></tr><tr><td>>ACES酵母抽出物(AYE)ブロス</td><td></td><td></td><td>4gエース、4g酵母抽出物、0.4g&#945;-ケトグルタル酸、pH6.9、400mlH2O、オートクレーブ、4ml鉄溶液*、4mlシステイン溶液* </td></tr>*<tr><td>木炭緩衝酵母抽出物(CYE)プレート</td><td></td><td></td><td>をオートクレーブした後、滅菌成分を追加してください上記のように、0.6 gの活性炭と6 gの寒天</td></tr>滅菌<tr><td>鉄溶液(ピロリン酸第二鉄)</td><td>Sigma</td><td>P6526</td><td>0.6 mM溶液、滅菌ろ過</td></tr><tr><td>滅菌システイン溶液</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td>3.3 mM溶液、滅菌ろ過</td></tr><tr><td>G.メロネラ(ワックスワーム)</td><td>Livefood UK</td><td>W250</td><td></td></tr>抗<tr><td>HA-テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)</td><td>Sigma</td><td>H9037</td><td></td></tr><tr><td>抗<>レジオネラ LPS</td><td>ケンブリッジバイオサイエンス</td><td>PA1-7227</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギIgG Alexa488</td><td>ジャクソン免疫リーチ</td><td>711-485-152</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル &#946;-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>シグマ</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコスリン酸緩衝生理食塩水 (D-PBS)</td><td>シグマ</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>寒天</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム (NH4Cl)</td><td>Σ</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液</td><td>Σ</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>ジギトニン</td><td>Σ</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>サイトカラシン D</td><td>バイオモルインターナショナル</td><td>BML-T109-0001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[ヘッダー]</td></tr><tr><td colspan="4">Material</td></tr><tr><td>Microtiter シリンジ</td> シ<td>グマ</td><td>24544</td><td></td></tr><tr><td>セルカウンター、ダブル、改良型 ノイバウ</td><td>アーVWR</td><td>631-0926</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>機 遠心分離</td><td></td><td></td>プレート用</tr> <tr><td>蛍光顕微鏡</td><td></td><td></td><td>必要な蛍光色素に適した</td></tr><tr>フィルターを備えた顕微鏡<td>倒立顕微鏡</td><td></td><td></td><td>生細胞計数用 </td></tr><tr><td>耐パンクグローブ</td><td>タートルスキン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用<em&gt;ハチノスツヅリガ</em&gt;モデル生物として研究する<em&gt;レジオネラ·ニューモフィラ</em&gt;感染症

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

レジオネラ·ニューモフィラ 、レジオネラ症という重症肺炎の原因物質は、感染し、肺胞マクロファージ内で複製されます重要なヒト病原体である。その病原性はレジオネラを含む液胞（LCV）として知られている複製許容空胞を確立することが不可欠であるドット/ IcmをIV型分泌系（T4SS）に依存します。L.ニューモウイルス感染は、新規感染モデルを検索するにはつながるが、ほとんどのマウス系統が許容されないマウスでモデル化することができます。我々は最近、ワックス蛾ハチノスツヅリガの幼虫がLの調査に適していることが示されているニューモウイルス感染。G. mellonellaは、ますますヒト病原体の感染のモデルとして使用され、良好な相関は、昆虫および哺乳動物モデルにおいて、いくつかの細菌種の病原性との間に存在する。幼虫の免疫防御の重要な構成要素は、血球、専門職である取ると侵略者を破壊ら食細胞、。L.ニューモは 、感染LCVを形成し、これらの細胞内で複製することができる。ここでは、L.を分析するためのプロトコルを実証するGのニューモ病原性感染L.を成長させる方法など、mellonellaモデル 、 ニューモは 、阻害剤を用いた幼虫を前処理幼虫に感染し、定量化し、免疫蛍光顕微鏡用の感染細胞を抽出する方法。我々はまた、競合アッセイにおける細菌複製、フィットネスを定量化する方法について説明します。これらのアプローチは、L.において重要な要因を決定するために、変異体の迅速なスクリーニングを可能にするこの複雑な病原体の我々の理解を助けるための新しいツールを記述したニューモ病原性、。

ここでは、G.ことが実証されているmellonellaはLを研究するためのモデルを使用して簡単に、適切であるニューモウイルス感染 。以前は、示されているようL.マクロファージ、アメーバや哺乳動物モデルにおけるニューモ病原性は、ドット/ ICMの分泌系41-43の存在に依存する。G. mellonella幼虫は、上記のように感染させ、野生型（WT）およびドット/ ICM-欠損株の病原性を比較した。 Lの10 7 CFUでの感染ニューモフィラ株 130bは、24時間後の感染（π）以内に100％の死亡率をもたらした。しかし、L.機能的なドット/ IcmをT4SS分泌系を持っていないニューモΔDOTA株は、（ 図1）、このアッセイにおいて非病原性であった。これは、L.ことを実証しているGのニューモ病原性mellonellaは、特性のために、このモデルが適し、ドット/ ICMのエフェクターの転座に依存これらのタンパク質の機能。 最近、サイトカラシン処理による食作用の阻害は、酵母カンジダ·アルビカンス 6による感染に敏感に幼虫の増加したことが示された。 Lとニューモフィラ、それが細菌の取り込みは、このモデルでは、その病因に重大であるかどうかを判断することが決定された、細胞内の病原体である。幼虫は、その後、WT Lの10 7 CFUに感染し、37℃で4時間、100μMのサイトカラシンD（シッド）10μlの前処理した単独の阻害剤を用いた24時間のパイトリートメントで監視ニューモ 130Bおよび死亡率は、幼虫の生存率に影響を及ぼさなかった。しかし、前処理し、感染した幼虫は、DMSO処理、感染した昆虫（ 図2）と比較して有意に高い生存率（P = 0.0066、対応のないt検定）を表示。シッド処置の効果を、48時間π（結果は図示せず）によって廃止され、これは、G.中の薬物の半減期であってもよいmellonella。これは、L.の取り込みを示していますG.にニューモmellonella血球は、細菌の病原性の重要な側面です。 発現を検証し、G.におけるエフェクタータンパク質の細胞内局在を決定するためにmellonella、血球を抽出し、免疫蛍光顕微鏡用に処理した。幼虫4 N-末端HAタグに融合明確に定義されたT4SSエフェクタ、SIDC 41から918までの断片を発現するWT及びΔDOTA L.ニューモフィラ 130b は 、感染させた。このエフェクターは、ホスホイノシチド-4 -リン酸結合ドメイン44を介してLCVに結合することが実証された。抗HA（赤）と抗レジオネラ （緑）抗体を用いて、4HA-SIDC 41から918（ 図3）感染した血球にLCVに局在。この局在は、以前アメーバ細胞性粘菌であり、cを確認哺乳類マクロファージ44,45に示されているこのモデルのomparability。 病原性のためのタンパク質の重要性は、通常、野生型および突然変異細菌の増殖速度を比較することによって決定される。感染の経過にわたって細菌の複製動態を追跡するために、三幼虫体液を収集し、プールし、（0、5、18、及び24時間のπ）各時点で屠殺し、抽出された体液のCFU/0.1g決定した。 5時間のPI、WT細菌のCFUの初期ディップがしかし24時間のPIまで上昇した後、ΔDOTA株はレプリケーションを受けておらず、18時間のPI（ 図4）でクリアされる。 Lの能力T4SS依存的にマクロファージの溶解を引き起こすニューモ長いしかしながら全く同様の研究は、in vivoで実施されていない、46は実証されている。循環血球の濃度は5、18で決定し、そして24時間πは幼虫を感染させたWTまたはΔ <eM&gt; DOTAのL. pneumophilaの130bは、感染した昆虫や生細胞から抽出された血球は、トリパンブルー排除法を用いてカウント。 5時間のPIで株間の血球数に差は（ 図5）見られなかった。しかし、18時間のPIでΔDOTA、感染した幼虫はそこではない、WTにおける血球濃度の有意な低下があったが、。この違いは、免疫蛍光によって見られるように、細胞内細菌の存在と合わせ血球数の低下は、示唆している24時間のPIで持続し、そのL.ニューモフィラ、細菌が複製のいくつかのラウンドを受けることができるように、それらを溶解し、血球内に複製します。 <img alt="図1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig1.jpg" /> 図1。 L.の感染ニューモドット / ICM-依存幼虫の死亡率を誘導する。10幼虫をPBS単独または10に感染していた<s72時間、記録した幼虫の死亡時に37℃でインキュベートした野生型（WT）またはΔDOTAのL. pneumophilaの 130b の &gt; 7 CFU、アップ。 WTに感染し、すべての幼虫が24時間後に感染（PI）内の感染に屈し、しかし死亡はPBSのみを接種した幼虫やΔDOTA株では見られなかった。結果は、3つの別々の実験、±標準偏差の平均値である。 <img alt="図2" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig2.jpg" /> 図2。死亡率は、細菌の内在化に依存している。10 L.ニューモ幼虫（P = 0.0066、対応のないt検定）に減少顕著に発揮し、10 7 WT及び24時間のPI前処理した幼虫で監視死亡に感染し、37℃で4時間100μMのサイトカラシンD（シッド）10μlの前処理した死亡。結果は、MEAを表す条件あたり10幼虫と標準偏差±4つの独立した実験でのN。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig3.jpg" /> 図3。抽出された血球におけるエフェクタータンパク質の免疫蛍光画像。血球は、L.に感染した幼虫から抽出した5時間のPI細胞で4HA-SIDC 41から918を表現ニューモ 130B WTまたはΔDOTAは、核を可視化し、抗HA（赤）と抗レジオネラ （緑）抗体およびDAPI DNA染色（青）を用いて染色した。 4HA-SIDC 41から918は ΔDOTA、細菌のWTを取り巻く観察されたが、されなかった。スケールバーは5μm。 <img alt="図4" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig4.jpg" /> 図4。L.ニューモはG.内に複製メロドット/ ICM-依存的にネラ。幼虫がWTまたはΔDOTA L.ニューモフィラおよび0で、5、18、及び24時間のπで感染させされた3つの感染した昆虫から体液をプールCYEプレート上にプレーティングし、CFUを決定し接種物に抽出された体液の重量に正規化。 WT L. ΔDOTA株は18時間のPI結果内にクリアしている間、実験の過程で複製されたニューモ標準偏差±3つの別々の実験の平均値である。 <img alt="図5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig5.jpg" /> 図5。 WT L.による感染ニューモ重要な血球の破壊がもたらされる。血球が5で抽出された、18、およびWTまたはΔDOTAのL. pneumophilaの生細胞に感染した幼虫から24時間のPIは、血球計数器を使用してカウント。に違いない細胞の数は、しかし、18時間のPIで血球のわずか約15％がΔDOTA株と比較してWT株に感染した幼虫のままに株間5時間のPIで見られた。結果は、3つの別々の実験、±標準偏差の平均値である。

ワックス蛾ハチノスツヅリガの幼虫は、最近、 レジオネラ·ニューモフィラ感染を研究するためのin vivoモデルとして設立されました。ここでは、接種、細菌の病原性とレプリケーションの測定だけでなく、感染した血球の抽出と分析を含む幼虫にレジオネラ症の病因を特徴づける基本的な技術を実証する。

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

本手順の全体的な目的は、コクーン蛾 Galleria melanoma の幼虫を用いて、細菌性病原体 Legionella pneumophila の病原性を解析することです。まず、幼虫に L. pneumophila 株を注入して感染させ、その後 72 時間にわたって観察します。幼虫の死亡誘導は、運動性の喪失と黒色の色素沈着の出現によって示され、様々な時点で幼虫を犠牲にして血リンパを採取します。その後、血リンパをプレートに塗布し、細菌数の計測および昆虫細胞の可視化を行います。最終的に、細菌増殖の解析と免疫蛍光顕微鏡観察を用いることで、in vivo 感染中に Legionella が構築した細胞内ニッチや、株間の毒性の違いについての知見が得られます。レジオネラのマウスモデルや細胞培養モデルに対する本手法の主な利点は、倫理的に受け入れられやすく、多細胞生物を用いて多数のLegionella株を迅速かつ費用対効果高く解析できることです。手順を明確にするため、私の研究室の博士課程学生であるHardingが実演します。L. pneumophilaを扱う際は、地域の規定に従い、常にバイオセーフティーレベル2の微生物安全キャビネット内で作業してください。まず、細菌プレートを4日間培養します。次に、幼虫に感染させる1日前に、数個のコロニーを含む1ループ分の細菌を、あらかじめ温めておいた1 mLのAYEブロスに再懸濁し、懸濁液の600 nmにおける吸光度を測定します。次に、OD 600が0.1になるように、新しい3 mLのYE培地に接種します。培養液を37 °C、200 RPMのシェーカーで21時間、感染に使用できるよう対数増殖期以降まで培養します。懸濁液の600 nmにおける吸光度を測定します。次に、培養液を希釈して1 mLあたり10億CFUにします。DPBSを用いて、Gメラノーマ幼虫用の容器を準備します。鈍端ピンセットを使用して、10 cmのペトリ皿の底に直径10 cmの円形フィルターペーパーを配置します。ほぼ同じ大きさの健康な幼虫10匹をフィルターペーパーの上に置き、茶色に変色していたり斑点が見られたりする不健康な個体は廃棄してください。健康な幼虫は均一なクリーム色で、暗色の変色部位がなく、素早く泳ぐことができます。幼虫が仰向けになった場合は、フィルターペーパーを安全キャビネットにテープで固定して注入プラットフォームを準備します。次に、P 1000チップをフィルターペーパー上にテープで固定します。次に、70%エタノールを吸入し、シリンジを70%エタノールに10分以上浸漬させることで、20 µLマイクロタイターシリンジを滅菌します。滅菌水を数回吸入・排出して、シリンジ内の残留エタノールを除去します。その後、10⁹ CFU/mLのL. pneumophila懸濁液を10 µL吸入します。幼虫を1匹取り、優しく、かつしっかりと保持します。P 1000チップの上で幼虫の背中を曲げます。シリンジの先端を幼虫の右前脚の上に置きます。次に、針の先端を前脚にゆっくりと挿入します。針が幼虫の内部にスムーズに入っていることを確認してください。10 µLのボラス量をすべて注入します。シリンジが正しく挿入されていれば、シリンジのみで幼虫を吸い上げ、チャンバーへ移送することが可能です。条件ごとに計10匹の幼虫に注入し、対照群として別の10匹の幼虫にDPBSのみを注入します。注入工程はこの手順の中で最も技術的に困難であり、習熟が必要です。最後に、ディッシュをテープで密閉し、二次容器に入れます。実験期間中、37 °Cで保存してください。死亡率は、感染後の複数の時点で分析する必要があります。感染した幼虫の死亡率を調べるには、鈍端ピンセットで幼虫を反転させ、脚の動きを確認してください。健康な幼虫は、すぐに自力で反転します。色素沈着は、感染に対する強い免疫反応を示しています。わずかでも動きがある場合は、各時間帯において幼虫を生存していると数えてください。ランダムに3匹の幼虫を選択し、14 milliliterチューブに入れます。チューブを氷上に5〜10分間置き、脚の動きがなくなるまで待ちます。その後、幼虫をシャーレに移します。次に、メスを用いて尾に近い2つの節の間を切開し、各幼虫から血リンパを回収します。腸内細菌による汚染を防ぐため、切開部位が腸に触れないようにしてください。幼虫から血リンパを絞り出し、滅菌済みの1.5 milliliter遠心チューブに回収します。幼虫1匹あたり、15から50 microlitersの血リンパが得られます。昆虫の生存能を判定するため、採取した血リンパは凝固する前に10分以内に使用する必要があります。96ウェルプレートの1つのウェルに、血リンパ20 µLとトリパンブルー溶液20 µLを混合します。同様に3つのウェルに分注してください。室温で5分間インキュベートします。次に、各反応について10 µLを用いて、ヘモサイトメーターで青色ではない生存細胞数を計測します。顕微鏡観察用にヘモサイトを処理するため、24ウェルプレート内の10〜15 mmのガラスカバーガラス上に、回収した血リンパをピペットで分注します。次に0.5 millilitersのDPBSを加え、緩やかな撹拌で血リンパをよく混ぜ合わせます。エアロゾル密閉型の遠心プレートホルダーを使用し、室温で500 Gにて10分間、プレートを遠心分離します。その後、倒立顕微鏡を用いて各ウェルを確認し、血球が接着しているかを確認します。次に、上清を除去し、ウェルの壁面に0.5 millilitersのDPBSを加えて、細胞を慎重に3回洗浄します。プレートを数回揺らし、DPBSを吸引して取り除きます。固定および染色の詳細は、テキストプロトコルに記載されています。細菌のCFUを定量するために、滅菌済みのYE培地を用いて血リンパを10倍段階希釈します。次に、SPECTmycinを含むCYEプレートの底面を6つの等しいセクターに分割します。プレートの各セクションに、最も希釈度の高いものから順に、各希釈液を25 µLずつ3滴的に播種します。これらのプレートをインキュベートし、後でコロニー数を計測します。G melan 幼虫に、野生型およびICM欠損 L pneumophila 株を感染させました。菌株 one 30 Bを10 million CFU感染させたところ、24時間以内に100%の死亡率となりました。しかし、機能的なICM T4SS分泌系を持たないdelta A株が、細菌の取り込みがその病原性に不可欠であるかを確認するために使用されました。このモデルでは、幼虫にcyto Dで前処理を行った後、感染させました。阻害剤のみによる処理は24時間後の生存率に影響しませんでしたが、前処理後に感染させた幼虫は、対照群と比較して有意に高い生存率を示しました。発現を検証し、well-definedなLCV局在エフェクターの断片を発現するg Melan Legionellaにおけるエフェクタータンパク質の細胞内局在を決定するために、以下の手順を行いました。幼虫への感染に使用し、細菌複製キネティクスを顕微鏡で解析するため、4つのHAタグおよび末端HAタグを融合させたSID Cを用いました。感染後の複数の時点で幼虫を犠牲にし、抽出した血リンパ1gあたりのCFUを測定しました。5時間目の初回測定後、野生型細菌のCFUは増加しました。しかし、delta a株は複製せず、18時間までに消失しました。感染した昆虫から血球を抽出し、トリパンブルー排除法を用いて生存細胞数をカウントしたところ、感染5時間後では差は見られませんでした。系統間でのIncyte数のカウントを行いました。しかし、18時間後までに野生型ではヘモリンパ濃度が著しく低下しましたが、delta A感染幼虫では低下が見られませんでした。このin vivoの結果は、L. pneumophilaが血細胞内で複製し、その後それらを溶解させることを示唆しています。このビデオを視聴することで、幼虫への感染、血リンパの抽出、および血球の処理を行い、レジオネラ pathogenesis のさまざまな側面を解析する方法について十分に理解することができます。

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