マウス精密切り出肺スライスを用いた低酸素肺血管収縮のビデオモルフォメトリクス解析

本手順の目的は、内径20～100 µmの肺内動脈における低酸素性肺血管収縮を解析することです。まず、肺の気道に低融点アガロースを充填します。次に、振動切片機を用いて、摘出した肺を厚さ200 µmの切片に切断します。

次に、ノルモキシックガスをバブリングした37 °Cの温MEDIUM中でインキュベートし、肺切片からarosを除去します。これにより、切片が液体中でゆっくりと移動します。その後、個々の肺切片をフロースルー式超灌流チャンバーに移し、横断切断された動脈の血管反応性をビデオ形態計測分析により評価します。

最終的に、異なる処理に応じた血管内腔面積の変化を評価します。胸膜下微小血管の生体内顕微鏡観察などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、分離した近位肺動脈における血管緊張を測定することで、直径20から100 µmの肺内動脈のVA反応性を定量的に分析できる点にあります。本手順のデモンストレーションは、Anna Goldenbergと当研究室の技術者2名が行います。

頚椎脱臼によりマウスを安楽死させた直後、腹腔を開き、腸管を脇に寄せてから腹部の大血管を切断して放血させます。次に、微細剪刀を用いて横隔膜を貫通させます。これにより、胸膜腔に空気が流入し、肺が虚脱します。

切開を続け、横隔膜を下胸口から切り離します。次に、肋骨と鎖骨の外側を切断します。胸郭の腹側部分を取り除くため、胸腺を取り出します。

温めた灌流バッファーをシリンジに充填します。次に、心臓の左心室に小さな穴を開けます。灌流バッファーの流出量を調整し、肺が白くなるまで右心室から肺血管系をゆっくりと灌流します。

次に、気管から唾液腺、小筋、および結合組織を取り除きます。気管を周囲の結合組織から切り離し、後の結紮のために食道と気管の間に縫い糸を挿入します。その後、マイクロシザーを使用して、隣接する2つの気管軟骨の間の気管上部に小さな穴を開けます。

37 °Cに加温した低融点アガロースをシリンジに充填し、フレキシブルプラスチックカニューレに接続して、カニューレ内の空気が抜けるまでプランジャーをゆっくりと押し込みます。カニューレを気管の小さな穴に挿入し、縫い糸で注意深く固定します。次に、気道にアガロースをゆっくりと充填し、肺を観察します。

まず右肺が膨張し始め、続いて左肺が膨張します。30〜40秒後には充填が完了し、両肺は生体内に近い体積である約1.2〜2.0 millilitersまで膨らみます。性別、年齢、体重によって異なりますが、処置中に凝固が進みすぎないよう十分に速く、かつ肺を損傷させない程度の速度で卵白液を注入することが重要です。

両肺に同時に充填した後、プラスチックカニューレを抜き、縫い糸で気管を結紮してアグロスの漏出を防ぎます。続いて、結紮部位より上の気管を切断し、肺と心臓を胸部から一塊として取り出します。アグロスを凝固させるため、臓器を氷冷したヘップスリンガー緩衝液に移します。凝固には数分かかるため、その間に待機します。バイブレーターの試料ホルダーに、肺組織の固定用支柱として使用するシャンパンコルクの破片を瞬間接着剤で取り付けます。アグロスが凝固した後、個々の肺葉を分離します。

次に、超強力接着剤を用いて、肺葉1つを試料ホルダーに固定します。小型の intra asner 動脈の横断面を得るには、右肺の頭側葉を準備し、肺門面をホルダーに接着させます。新品のカミソリブレードを装着した振動切片作成装置（ビブラトーム）を用い、周辺部から切断して、肺葉を 200 micron の厚さの切片にします。より大きな pre aser 動脈の横断面を得るには、左肺の肺門をシャンパンコルクに合わせて、この方向で肺葉をホルダーに接着し、その後、周辺部から切断して aros を除去します。

臓器の切片を、約200 mLの37 °Cに温めたMEMを満たしたガラスビーカーに移します。ビーカーを恒温機に入れ、常酸素ガスをバブリングして、肺切片が培地中でゆっくりと動くようにします。約2時間後には、肺組織から空気の気泡が除去され、切片がビーカーの底に沈殿します。

肺動脈のビデオ形態計測解析を行うため、肺切片1枚を、顕微鏡上に設置され1.2 millilitersの常酸素ガス飽和MEMを満たしたフロースルー超灌流チャンバーに転送します。ナイロン糸でプラチナリングに接続し、肺切片をチャンバーの底部に固定します。その後、常酸素ガス飽和培地によるチャンバーへの灌流を開始します。

位相差顕微鏡を用い、10倍対物レンズで肺切片を走査して、内径が20〜100 µmの動脈の横断面を探します。適切な候補血管が見つかったら、20倍対物レンズを用いてpre asner血管の写真を撮影するか、あるいはここに示すように、40倍対物レンズを用いてintra asner動脈の写真を撮影し、血管の内径を測定します。実験を開始する前に、実験全期間を通じて1分ごとに動脈の横断面の写真を撮影するようにソフトウェアを設定してください。

撮影を開始した後、チャンバーに常酸素ガスト medium を10分間灌流し続けます。次に、流速を止めた状態で肺切片を U 466 19 に10分間浸し、U 466 19 によって内腔面積が少なくとも 30% 減少した血管のみを用いて、動脈の収縮性を分析します。その後、常酸素ガスト medium で薬剤を10分間洗浄します。

次に、resを投与して10分間、低流量で動脈を拡張させます。再び、通常酸素ガス飽和培地を用いて6 mL/minの流速で10分間洗浄して薬剤を除去し、続いて0.7 mL/minの流速で10分間洗浄します。次に、肺スライスを高低酸素ガス飽和培地で40分間インキュベートします。

また、別のチューブセットを用いて、灌流チャンバーの気相に低酸素ガス混合気を流します。低酸素培地を除去するため、正常酸素ガス飽和培地で20分間洗浄し、チャンバー気相へのガスフローを低酸素から正常酸素に切り替えて、血管の生存能を確認します。実験の最後に、U 466 19を灌流チャンバーに投与し、フローを停止させた状態で20分間インキュベートして血管収縮を誘導します。

別の血管の血管反応性を測定するために、新しい肺切片を用いてこれらの手順を繰り返します。まず、横断切片にした動脈の画像を画像解析ソフトに読み込み、解析を開始します。次に、カーソルを使用して血管の内腔面積を囲みます。

血球が血管壁に付着することなどによるアーティファクトを避けるため、手の乾燥が必要です。同様の手順で断面画像の解析を継続します。フロースルーインキュベーションチャンバー内の条件を変更した場合はすべての画像を解析する必要がありますが、条件に変更がない場合は1枚おきの画像を解析すれば十分です。

横断切片にした気管支に近接して走行するpre ASIN動脈の位相差画像において、低酸素性肺血管収縮が観察されます。画像は、グラフ内の円で示された時点、すなわち測定開始時、測定終了時、U 466 19投与時、RAs曝露終了時、低酸素ガス充填培地中での30分または40分経過後、常酸素ガス充填培地での洗浄後、および最終的なU 466 19投与後に撮影されています。血管反応性は、横断切片にした動脈の内腔面積の経時的な相対変化として記録されます。実験開始時の面積を100%と定義し、血管収縮は初期面積に対する相対値として示されます。

本症例では、低酸素への曝露により管腔面積が60%減少しており、これにより低酸素反応がより明確に提示されています。血管反応性をテストした実験の初期段階はここでは示しておらず、低酸素曝露直前に得られた値を100%として設定しています。これらの研究で検討したもう一つの血管タイプは、肺胞隔壁の接合部に位置するASIN内動脈です。一連の実験では、ミトコンドリアATP感受性カリウムチャネルの非選択的開口薬であるsidalが、小型のASIN内動脈の低酸素性肺血管収縮に及ぼす影響を分析しています。

スライスを低酸素培地でインキュベートします。50 $\mu$M の sidal の有無にかかわらず、正常酸素 gast 培地でのコントロールインキュベーションを行い、正常酸素、低酸素、または低酸素に sidal を加えた条件に対する反応を明確に提示します。正常酸素または低酸素 gast 培地にさらす直前に得られた値を 100% と設定します。pineal にさらされた動脈は、添加剤なしの低酸素培地でインキュベートした動脈とは異なり、面積の減少を示しません。

正常酸素培地では、腔内面積に変化は認められません。50 µM の sidal 添加の有無にかかわらず、低酸素胃培地に曝露させた ASIN 内の小動脈の記録を、平均値 ± SEM として示しています。このグラフでは、低酸素インキュベーション開始時の値に対する相対的なデータを示しています。

血管反応性は検出されません。低酸素ガスに曝露された肺スライスにおいて、U 466 19によって誘導される松果体血管収縮を含む培地は、この薬剤の影響を受けません。このビデオを視聴することで、精密な準備方法、肺スライスの切断方法、およびそれらを用いて、肺胞中隔に位置する直径 20 から 40 µm の小型肺胞内動脈と、気管支および細気管支に隣接して走行する直径 40 から 100 µm の大型前肺胞動脈の血管反応性を定量的に測定する方法について、十分に理解できるはずです。