マウス精密切り出肺スライスを用いた低酸素肺血管収縮のビデオモルフォメトリクス解析
2014年1月14日
低酸素肺血管収縮(HPV)は、肺胞低酸素肺灌流で換気に一致する重要な生理学的現象である。HPVに寄与する主要な血管セグメントは、口腔内動脈である。ここでは、直径20~100μmのマウス肺血管のHPVの分析プロトコルについて説明します。
この手順の全体的な目標は、内径が 20 から 100 ミクロンの肺内動脈をミラーリングする低酸素性肺血管収縮を分析することです。これは、最初に肺の気道を低融点のarosで満たすことによって達成されます。2番目のステップは、バイブレーターを使用して、孤立した肺を200ミクロンの厚さのスライスにカットすることです。
次に、アロスを摂氏37度、温かい培地でインキュベーションすることにより肺切片から除去し、これを正常酸素ガスで泡立てます。そのため、セクションは流体中をゆっくりと移動します。次に、個々の肺切片を超融合チャンバーを介して流れに移し、続いて断面動脈の血管反応性のビデオ形態測定分析を行います。
最終的に、さまざまな治療に応じた血管の管腔領域の変化が評価されます。胸膜下微小血管の生体内顕微鏡検査のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、孤立した近位肺動脈の血管張力の測定であり、直径が20〜100マイクロメートルの肺内動脈のVA反応性の定量的分析を可能にすることです。手順を実演するのは、Anna Goldenberg とこのラボの 2 人の技術者をペットにすることです。
子宮頸部脱臼でマウスを殺した直後に、腹腔を開き、腸のループを脇に動かし、出血のために大きな腹部血管を切断します。次に、細いハサミを使って横隔膜を貫通します。これにより、胸膜腔への空気の侵入の結果として肺が崩壊します。
ダイヤフラムを下胸部開口部から取り外すために切断を続けます。次に、肋骨と鎖骨を横方向に切ります。胸郭の腹側部分を取り外すには、胸腺を取り出します。
シリンジに温かい灌流バッファーを入れます。次に、心臓の左心室に小さな穴を開けます。灌流バッファーの流出を調整し、肺が白く見えるまで右心室を介してゆっくりと肺血管系を灌流します。
次に、気管から唾液腺、小さな筋肉、結合組織を切除します。気管を周囲の結合組織から切り離し、食道と気管の間に縫い綿を挿入して、後で結紮します。次に、マイクロハサミを使用して、隣接する2つの気管軟骨の間の気管の上部に小さな穴を開けます。
シリンジに摂氏37度の温かく低融点のアグロスを充填した後、柔軟なプラスチックカニューレに接続し、カニューレから空気が除去されるまでプランジャーをゆっくりと押し込みます。カニューレを気管の小さな穴に挿入し、縫製綿で慎重に所定の位置に固定します。次に、ゆっくりと気道をアロスで満たし、肺を観察します。
最初に、右肺が拡張し始め、次に左肺が拡張します。30〜40秒後、充填が完了し、両方の肺がin vivoの状況に匹敵する容量(約1.2〜2.0ミリリットル)に膨らみます。性別、年齢、体重にもよりますが、エッグローズは、手術中に固まらないように十分に速く注射することが重要ですが、肺を損傷するほど速くはありません。
肺が同時に満たされた後、プラスチック製のカニューレを引き出し、アロスの漏れを防ぐために、気管を縫製綿で結紮します。その後、結紮糸の上の気管を切断し、胸部からブロック上の肺と心臓を切り離すために、臓器を氷冷のヒープリンガーバッファーに移してアグロを固化させます。瞬間接着剤を使用して、シャンパンコルクの一部をバイブレーターの標本ホルダーに取り付けて、肺組織のスキューバックとして機能します アグロスが固まった後、個々の肺葉を分離します。
次に、瞬間接着剤、試料ホルダーに1つのローブ。小さなアスナー内動脈の断面を取得するには、右肺の頭蓋葉を取り、末梢からスライスした新鮮なカミソリの刃を備えたビブラートを使用して、肺葉を200ミクロンの厚さのスライスに切断し、門面をホルダーに瞬間接着します。より大きなプレアサー動脈の断面を取得するには、左肺の門をシャンパンコルクに合わせ、この向きで葉をホルダーに接着し、アロスを除去するために周辺からスライスします。
臓器切片を摂氏37度の約200ミリリットルで満たされたガラスビーカーに移します。MEMはビーカーを加熱キャビネットに入れ、正常酸素ガスで泡立てて、肺の部分が媒体内でゆっくりと動くようにします。約2時間後、空気中に充満するアロスプラークが肺組織から除去され、切片がビーカーの底に沈殿します。
肺内動脈のビデオ形態測定解析では、1つの肺切片を、顕微鏡に取り付けられ、1.2ミリリットルの正常酸素ガスで満たされた超融合チャンバーを流れる流れに移します。MEMです。チャンバーの下部にある肺部分を、プラチナリングに接続されたナイロン弦で固定します。チャンバーにノルモキシックガス媒体の灌流を開始します。
10倍対物レンズを備えた位相差顕微鏡を使用して、内径が20〜100ミクロンの肺切開動脈の肺切片をスキャンします。妥当な候補血管が見つかったら、20 x 対物レンズを使用してプレアスナー血管の写真を撮るか、ここに示すように 40 x 対物レンズを使用して血管の内径を測定するためのアスナー内動脈の写真を撮ります。実験を開始する前に、実験全体を通して毎分断面の動脈の写真を撮るようにソフトウェアを設定します。
撮影をトリガーした後、正常酸素ガス培地でチャンバーの灌流を10分間続けます。次に、肺部分をU 466 19で流れなしで10分間浴し、管腔面積が少なくとも30%減少した血管のみを使用して動脈の収縮性を分析します。薬物を正常酸素ガス培地で10分間洗い流します。.
次に、流量が少なくならないように、resを10分間適用して動脈を拡張します。再度、毎分6ミリリットルの流量で10分間の正常酸素ガス媒体で洗浄し、続いて毎分0.7ミリリットルの流量で10分間洗浄して薬物を除去する。次に、肺切片を高低酸素ガス培地で40分間インキュベートします。
また、低酸素ガス混合物を、追加のチューブセットを介して灌流チャンバーの空域に流します。正常酸素ガス媒体で20分間洗浄して低酸素媒体を取り出し、チャンバーの空域に低酸素ガスから正常酸素ガスの流れに切り替えて、容器の生存率を確認します。実験の最後に、U 466 19を灌流チャンバーに適用し、流さずに20分間インキュベートして血管収縮を誘発します。
これらの手順を新鮮な肺切片で繰り返して、別の血管の血管反応性を測定します。断面動脈の画像を画像解析プログラムにロードして解析を開始します。次に、カーソルを使用して、血管の管腔領域の輪郭を描きます。
手乾燥は、血管壁に付着した血液細胞などによるアーチファクトを避けるために必要です。同様の方法で断面画像の解析を続けます。インキュベーションチャンバーを通る流れの1つの条件が別の条件に変更された場合は、すべての画像を分析する必要がありますが、条件が変化しない場合は、他のすべての画像を分析すれば十分です。
低酸素性肺血管収縮は、断面の気管支のすぐ近くを走る断面のASIN前動脈のこれらの位相コントラスト画像で観察できます。写真は、測定の開始時、測定終了時のグラフの円で示される時間点で撮影され、U 466 19 RAへの曝露終了時に、低酸素ガス媒体で30分または40分後にRAへの曝露終了時、およびU 466 19の最終適用後、血管反応性は、断面の管腔領域の相対的な変化として記録されます時間に対する動脈。実験開始時の面積は100%と定義され、血管収縮は初期面積に対する相対的な値として与えられます。
この場合、低酸素症への曝露は、低酸素反応のより明確な提示のために管腔面積の60%の減少を誘発します。血管反応性がテストされた実験の初期段階はここでは示されておらず、低酸素への曝露直前に得られた値は100%に設定されていますこれらの研究で調べられた他のタイプの血管は、肺胞中隔のガセットに位置するASIN内動脈です。この一連の実験では、ミトコンドリアA TP感受性カリウムチャネルの非選択的オープナーであるシダルが、小さなアスナー内動脈の低酸素肺血管収縮に及ぼす影響を分析します。
スライスを低酸素培地でインキュベートします。50マイクロモルのシダルコントロールが存在しないか存在下では、インキュベーションは正常酸素ガス培地で行われ、正常酸素または低酸素症または低酸素症とシダールに対する反応をより明確に提示します。.正常酸素または低酸素ガス培地への曝露直前に得られた値は100%として設定されています松果体に曝露された動脈は、添加物なしで低酸素培地でインキュベートされた動脈と同様に、面積の減少を示さない。
正常酸素媒体では、管腔領域の変化は検出できません。50マイクロモルシダルの有無にかかわらず、低酸素ガス媒体に曝露された小さなASIN内動脈の記録は、SEMプラスまたはマイナスのSEMとして提示されます。このグラフでは、低酸素インキュベーションの開始時の値に対する相対データが示されています。
血管反応性は検出できません。低酸素ガスに曝露された肺切片では、U 466 19によって誘発される松果体血管収縮を含む培地は、薬物の影響を受けません。このビデオを見た後、ミラー精度を準備する方法、肺スライスを切断する方法、およびそれらを使用して、肺胞中隔のガスにある直径20〜40マイクロメートルの小さなアジア内動脈のVA反応性を定量的に測定する方法、および直径が40〜100マイクロメートルのより大きなプレアテナ動脈のVA反応性を定量的に測定する方法をよく理解しているはずです。 これは、ブロンキとブロンキオリに隣接して実行されます。
概要
この記事では、直径20から100 μmの範囲のマウスの肺血管における低酸素性肺血管収縮（HPV）を分析するためのプロトコルを紹介します。この方法では、肺を低融点アガロースで満たし、肺をスライスし、血管反応性を評価するためにビデオモルフォメトリック分析を行います。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 生理学
- 血管生物学
背景
- 低酸素性肺血管収縮は、肺胞低酸素時に肺の灌流と呼吸を一致させるために重要です。
- 小葉内動脈はHPVにおいて重要な役割を果たします。
- HPVを理解することで、肺血管疾患に関する洞察が得られます。
- この研究は、小肺動脈におけるHPVを定量的に分析する方法に焦点を当てています。
研究目的
- マウスモデルにおけるHPVを分析するための信頼性の高いプロトコルを開発する。
- 肺内動脈の血管反応性を評価する。
- 分離された肺動脈における血管張力を測定するための既存の方法を改良する。
使用された方法
- 肺を低融点アガロースで満たす。
- 肺を200ミクロン厚の断面にスライスする。
- アガロースを除去するために肺断面をインキュベートする。
- 断面化した動脈のビデオモルフォメトリック分析を行う。
主な結果
- 直径20-100 μmの肺内動脈の成功的な可視化。
- 様々な処置に対する血管反応性の定量的評価。
- この方法が従来の技術に比べて有利であることの証明。
- HPVの生理学的メカニズムへの洞察。
結論
- 開発されたプロトコルにより、マウスモデルにおけるHPVの詳細な分析が可能になります。
- この方法は、低酸素に対する肺血管反応の理解を深めます。
- 将来の研究では、この技術を基に治療的介入を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables quantitative assessment of hypoxic pulmonary vasoconstriction in murine intra-pulmonary arteries, a key mechanism in matching perfusion to ventilation. By providing access to vessels 20-100 μm in diameter that are inaccessible to conventional techniques, it supports mechanistic de-risking in pulmonary vascular target validation. The approach delivers reproducible, shear-stress-free vasoreactivity data that can inform early discovery decisions for hypoxia-modulating compounds.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses targeting hypoxic pulmonary vasoconstriction pathways in physiologically relevant arterial segments.
- Operational Value: Provides quantitative luminal area measurements as a functional readout for target engagement and pathway modulation.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by isolating contractile responses in intra-acinar and pre-acinar arteries under controlled hypoxic conditions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized lung slice preparations suitable for compound screening against hypoxic vasoconstriction endpoints.
- Quantitative Output: Delivers time-resolved luminal area changes enabling EC50/IC50 determination for vasoactive compounds.
- Scalability: Uses precision cut lung slices to allow parallel testing of multiple arterial cross-sections per lung lobe.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models a core physiological mechanism implicated in pulmonary hypertension and ventilation-perfusion mismatch.
- Translational Continuity: Bridges ex vivo vascular reactivity to in vivo hypoxic responses through measurable arteriolar tone.
- Mechanistic De-risking: Clarifies contribution of specific arterial segments (intra-acinar vs pre-acinar) to overall hypoxic response.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing quantitative vasoreactivity data that informs hit-to-lead progression in pulmonary vascular programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of hypoxic signaling pathways in arterial subtypes using videomorphometric luminal area as a primary readout.
- Screening: Enables assay development for compounds modulating HPV via standardized, reproducible vessel preparation and imaging.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (luminal area %) that allow comparison across treatment conditions and compound concentrations.
- Translational Research: Connects ex vivo arteriolar responses to pathophysiological mechanisms of hypoxic pulmonary vasoconstriction in lung disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating vascular reactivity across multiple compounds and genetic models in pulmonary discovery.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in HPV by enabling direct observation of vasoconstriction in resistance-sized pulmonary arteries.
- Operational Value: Standardizes vascular reactivity assessment through controlled agarose filling, sectioning, and superfusion conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early efficacy and specificity data for hypoxia-targeting compounds.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on validated arteriolar responsiveness in disease-relevant segments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine lung dissection, agarose perfusion, and vibratome sectioning.
- Depends on phase contrast microscopy and image analysis software for luminal area quantification.
- Necessitates standardized gas control systems for normoxic/hypoxic medium perfusion and airway gassing.
- Involves optimization of slice incubation and washout periods to ensure agarose removal and vascular viability.
- Limited to ex vivo acute responses; chronic remodeling or structural changes require complementary models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:44
Isolation of Murine Lungs and Preparation of Precision Cut Lung Slices
6:05
Videomorphometric Analysis of Intrapulmonary Arteries of Precision Cut Lung Slices
8:50
Analysis of Vasoreactivity and Graphic Presentation
9:30
Results: Hypoxia-induced Vasoconstriction of Pre-acinar and Intra-acinar Arteries
12:42
Conclusion
