ジャガイモとニコティアナベンタミアナにおけるアグロインフィルトレーションとPVXアグロパネクチ

次の実験の全体的な目標は、病原体のエフェクターが植物の耐性タンパク質によって認識されるかどうかをテストすることです。これは、最初に植物の葉にアグロバクテリウムの液体培養物を感染させるか、PVXアグロ感染によって達成され、これにより植物組織にエフェクターが一過性に発現します。その後、植物を孵化させ、細胞死のスコアを付けます。

植物の耐性タンパク質による一過性発現欠損の認識に対する細胞死応答を示す結果が得られました。これらの手法は、分子マーカーを用いた遺伝学的研究などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、機能的なアッセイであることです。彼らは、耐性遺伝子が植物に存在するだけでなく、それが機能し、防御応答が活発に誘導されることも示しています。

これらの方法は、分子植物病理学における重要な質問に答えるのに役立ちます、例えば、ボット耐性とRAおよび重罪のAFI遺伝子を迅速に発見するなど、両方のゲノム配列の利用可能性は、実験室の博士課程の学生であるduによって実行される手順を実証しますジャガイモ植物を生成するために。in vitroの苗木を、シゲ、スクーグ、またはMS培地を多く含む滅菌プラスチック瓶に入れ、摂氏18度の気候チャンバーで、16時間、8時間の昼夜体制で2週間維持します。植物が成長すると、白い根はそれらを滅菌された土の鉢に移します。

これらの実験で使用した植物の規制された温室区画では、生後4〜5週間の種子で育てられたNCOAハマナと、in vitroで生成された生後4〜5週間のジャガイモ移植を使用します。アグロバクテリウム培養物を調製するには、まず50ミリリットルのチューブに10ミリリットルのYESB培地を充填し、1マイクロリットルのアセトフェノン、100マイクロリットルのMES、および適切な抗生物質を補充します。次に、目的の遺伝子を含むアグロバクテリウムの所望の菌株のグリセロールストックを20マイクロリットルにピペット

培養物を摂氏28度、200RPMで1〜2日間インキュベートし、OD600が約1.0になるようにします。細胞を3000 GSで10分間遠心分離して回収します。次に、スーパーナットを注ぎ、ペレットを再懸濁します。

作りたてのMMAミディアムからOD 600の0.3まで。細胞を穏やかにボルテックスして蘇生させ、2つの細菌株の共浸潤のために細胞を懸濁させます。培養物を1対1の比率で混合します。

培養物を室温で1〜6時間放置してから、植物に浸透させます。その間、浸透させる植物に菌株と実験の日付をラベル付けして、目の保護具を着用して浸潤を実施します。針のない1ミリリットルの注射器を使用して、アグロバクテリウム懸濁液を葉のパネルに慎重かつゆっくりと注入します。

交差汚染を避けるために、少なくとも3つの植物と植物ごとに3つの葉を注入して、三重の役割を果たします。浸潤の合間に手袋を交換または滅菌し、翌日まで植物に水をやらないようにしてください。浸潤の約3日後に接種し、0から100%のスケールで細胞死の植物をスコアリングし、ゼロは症状がないことを示します。

100%は、コンフルエンス細胞死と硬化症から細胞死の増加レベルまでの中間値を示します。生後2〜3週間でハマナ種子で育てた植物でPVXアグロ感染を行い、抗生物質を補給した3ミリリットルのYEBにin vitroで育てた2〜3週間齢のジャガイモを移植します。アグロバクテリウムのグリセロールストック20マイクロリットルを摂氏28度、200RPMでインキュベートし、OD600を約1.0にします。

各アグロバクテリウム株の約300マイクロリットルを抗生物質を含むLB寒天プレートに広げ、摂氏28度で1〜2日間インキュベートします。へらを使ってアグロバクテリウムを収集します。次に、葉に大量のバクテリアを接種します。

つまようじを培養物に浸し、それを使用して植物を突き刺します。葉は、植物ごとに葉、株ごとに3つの植物を通じて、各葉を複数の場所に接種します。接種から 2 週間後、各スポットを「はい」または「いいえ」として定性的に記録することにより、巨視的にスコアを付けます。

次に、応答するサイトの割合を計算し、表示されているコントロールと比較します。ここでは、接種後約3日後のエンドハマナと2種類のジャガイモ種、Solenium JI 3 49 dash threeとCV Desireeへのアグロ浸潤の代表的な結果を示します。アグロバクテリウム株AGL1株、Pビンを含むPVRG1個、R、3個AおよびPK7個、WG2個A、VR3個A、3A、陰性制御PIとR3個またはPK7個、WG2個A、VR3個Aの混合物を共浸潤した葉パネルには合流細胞死があり、この図では、PVXアグロ感染nと2つのジャガイモ種S、1カエ3のアグロ感染54ダッシュ1とS micro DOUM 360ダッシュ1は接種後約2週間で見せています。

ポジティブコントロールPGR 1 0 6 CRN 2を接種した部位では、細胞死が拡大しています。これは、Phytophthora Infestからの一般的な細胞死誘導遺伝子と、P Infestからの違法遺伝子をコードするPGR 1 0 6をコードしています。ネガティブコントロールPGR 1 0 6 empty Wellを接種した部位では、拡大する細胞死は観察されません。

この手順を試みることは、良質の植物材料を栽培することを覚えておくことが重要です。この技術は、分子植物病理学と植物育種の研究者にとって、ジャガイモや他の植物種におけるエフェクトオミクスの探索への道を開きました。このビデオを見れば、植物の缶遺伝子の効率的でロバストなハイスループット機能解析を行う方法について十分に理解できるはずです。