Nonexpertsための系統学の実用ガイド

本記事の総合的な目的は、DNAまたはタンパク質配列から信頼性の高い系統樹を再構築することです。これはまず、NCBIのblastプログラムを用いて類似配列を特定し、次にそれらの類似配列をアライメントさせることで達成されます。

次に、アライメントから最適な進化モデルを決定します。最後のステップは、アライメント済み配列から系統関係を推定することです。最終的に、この段階的なパイプラインを用いて、ユーザーが配列データから信頼性の高い系統樹を構築する方法を示します。

この手法は、未知の配列の同一性と機能を推定することで、多様な分野における重要な疑問の解決に寄与します。Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）のオンライン版を利用するには、国立生物工学情報センター（NCBI）のBLASTウェブサーバーにアクセスしてください。その後、適切なBLASTプログラムを選択してください。

ここに示されているような FASTA 形式のテキスト配列をクエリボックスに入力します。検索に使用する適切な blast プログラムを選択し、blast をクリックします。出力はデフォルトで HTML 形式となり、入力したテキスト配列に最も類似した配列が表示されます。

次のセクションでは、WindowsおよびMacでのローカルblast実行ファイルの使用について説明します。Mac向けのBlastローカル実行ファイルに関するセクションへ直接スキップすることも可能です。Windowsマシンでblastコマンドラインプログラムを実行するには、NCBIのblastウェブサイトから適切なWindows用実行ファイルをダウンロードしてください。

Blastプログラムのインストール後、PCの環境変数を次のように設定します。PCのスタートボタンをクリックし、「コンピューター」を右クリックして、「プロパティ」をクリックします。新しいウィンドウで「システムの詳細設定」を選択し、新しく表示されたポップアップの「詳細設定」タブにある「環境変数」ボタンをクリックします。

次に、ユーザーセクションのユーザー変数で「new」ボタンをクリックします。新しく表示されたポップアップに、変数名として「path」を入力し、ここに表示されている変数値を入力します。次に、NCBIのウェブサイトから毎日更新されている事前フォーマット済みのBLASTデータベース、または特定の生物のゲノムをダウンロードします。

次に、「スタート」をクリックし、検索バーにCMDと入力してMS-DOSプロンプトを開き、NCBI blastフォルダに移動します。ここに示すMake blast DBコマンドを使用してデータベースを作成します。FASTA形式のタンパク質テキスト配列をDBフォルダに挿入し、testという名前のクエリタンパク質配列を作成します。

次に、テストタンパク質に最も類似した配列を特定するため、blast P クエリコマンドを用いてデータベースを照会します。以下のセクションでは、Mac ユーザー向けに同様の手順を説明します。Windows ユーザーは、セクション 5 の「多重配列アライメントの作成」まで読み飛ばしてください。

Macでblastコマンドラインプログラムを実行するには、NCBI FTPサイトにリモートアクセスして、適切なMac用実行ファイルをダウンロードしてください。具体的には、Finderを開いて「ターミナル」を検索し、ターミナルウィンドウにNCBI FTPサイトのFTPアドレスを入力します。名前とパスワードに「anonymous」と入力し、次に「CD blast/executables/latest」と入力してください。

LSと入力して実行ファイルの一覧を表示し、システム要件に適合する最新バージョンを以下のコマンドを入力してダウンロードします。次に、ダウンロードしたファイルを展開します。これで、シェルがこのディレクトリを検索できるように、blast実行ファイルのバイナリの場所をパスに追加します。

コマンドを確認する際は、NCBIのウェブサイトから、あらかじめフォーマットされたBLASTデータベースまたはゲノムをダウンロードしてください。CD genomesと入力してゲノムディレクトリを検索します。次に、目的のゲノムまたは配列を以下のようにダウンロードし、quitと入力してFTPサイトを終了します。

次に、Make Blast DB命令を入力してデータベースを作成します。binフォルダにFASTA形式のクエリ配列を挿入し、blast Pクエリコマンドでデータベースを照合して、テスト配列データに最も類似した配列を探索します。一般的に使用される多重配列アライメント（MSA）プログラムの一つにT-Coffeeがあります。T-CoffeeのサイトにあるクエリボックスにFASTA形式の配列データを入力すると、出力結果において類似した残基が色分けで表示されます。

一般的に使用されるもう一つのMSAプログラムはclusteral MSAであり、コマンドライン版のCLUSTERAL W、または様々なオペレーティングシステムに対応したグラフィカル版のCLUSTERAL Xとしてダウンロード可能です。次に、「file」タブを選択し、フォーマット済みの配列テキストとしてデータをclusteralプログラムに読み込ませます。その後、「load sequences」ボタンをクリックします。

次に「align」タブに切り替え、「do complete alignment」ボタンをクリックして、進化の最適適合モデルに合わせて配列をアライメントします。PROTTESTプログラムをダウンロードしてください。PROTTESTのダウンロードが完了したら、PROTTESTをダブルクリックして起動します。

PROTESTを起動したら、アライメントボックス内の「select file」をクリックして配列データをロードします。次に「start」をクリックしてプログラムを実行します。実行完了後、プログラムは配列推定の基準に基づいた最適なモデルを提示します。

Phi MLをダウンロードして起動した後、ファイル名とPYを入力して、ファイル形式の配列を入力シーケンスとして読み込みます。次に、yを入力してプログラムを開始します。MrBayesのウェブサイトからベイズ推論プログラムをダウンロードし、実行ファイルをクリックしてプログラムを起動します。その後、execute ファイル名.NEXと入力して、Nexus形式の配列データをプログラムに読み込ませます。

次に、進化モデルを設定し、実行する世代数を選択します。mc mcコマンドで解析を実行した後、sum Tコマンドを用いて系統樹を要約し、系統樹を表示します。ツリービュープログラムをダウンロードしてください。

最後に、より精度の高いアライメント、類似性の予測、あるいは系統樹を提供することを目的とした新しいソフトウェアが絶えずリリースされています。このビデオの概要では普及しているプログラムを紹介しましたが、視聴者の皆様には、さらに他のオプションを検討することを推奨します。blastアルゴリズムは、配列の類似性を持つ短い領域を探索するローカルアライメントを実行します。

アルゴリズムがクエリ配列から考えられるすべてのストレッチを検索し、これらの配列を最大限に拡張した後、アライメントの組み立てを行います。各クエリ配列ペアにおいて、e値はマッチの統計的有意性を示します。E値が低いほど、そのヒットの有意性は高くなります。

例えば、E値が0.05の配列アライメントは、この一致が偶然に起こる確率が100回に5回であることを意味します。BITスコアは、特定のスコアリングマトリックスを用いてアライメントの質を指標化したものです。BITスコアが高いほど、アライメントの質が良いことを示します。

多重配列アライメント（MSA）とは、アミノ酸、DNA、またはRNAからなる3つ以上の一次配列の配列アライメントのことです。ここに示されているMSA（T-Coffee）の出力では、類似した残基が色分けされています。アミノ酸アライメントの例として、Clustal Xを用いてアライメントされた6つのタンパク質配列のサンプルをここに示します。

プログラムprotestは、アミノ酸置換の最適合モデルを選定するために使用されます。データ内で、プログラムは解析中のモデルをリストし、プログラムの完了後に最適合モデルを表示します。Phi MLは、塩基配列またはアミノ酸配列のアライメントから最大尤度系統樹を推定します。このプログラムには多数の置換モデルが組み込まれており、樹形トポロジー空間を探索するためのさまざまなオプションと組み合わせて使用できます。

Mr.Bayesは、複数の進化モデルにわたるベイズ統計的CMC推論を利用して、系統関係を再構築します。プログラムの実行後、ここでは示しているように、特定のインターバルごとに進捗状況を確認できます。系統樹が生成されたら、そのトポロジーを視覚化する必要があります。

この図では、ツリービューウィンドウにfly.Baseのタンパク質のサンプルツリーが表示されています。ツリービューにはツリーエディタが含まれており、ユーザーはブランチの移動やツリーの再ルーティングを行うことができます。この操作を行う際は、各プログラムのユーザーガイドを注意深く読むことが重要です。

本プロトコルは、これらのプログラムがどのように機能するかを読者に紹介するための実践的な出発点を提供します。しかし、読者の皆様には、各プログラムに関連する多くの設定を実際に操作し、習熟することを推奨します。