生分解性高分子粒子のリンパ節内注入

この手順の全体的な目標は、直接注射技術を使用して生体材料ワクチン粒子をリンパ節に沈着させることです。まず、脂質安定化ポリマー粒子をダブルエマルジョン法で合成します。次に、粒子を洗浄し、サイズ、貨物、積載、安定性などの材料特性を測定します。

次に、マウスの尾根にトレーサー色素を投与して、色素をリンパ節に排出した後の可視化を可能にします。最後のステップは、D標識リンパ節を特定し、この位置に少量のポリマー粒子を注入することです。組織学、免疫蛍光法、共焦点顕微鏡法を使用して、鼠径リンパ節内の粒子の存在と分布を確認できます。

リンパ節の直接注射とワクチン接種用の生体材料を組み合わせることで、リンパ節微小環境におけるワクチン成分の組み合わせと用量を厳密に制御し、これらの組織におけるカーゴの放出を制御することができます。すべてのワクチンが効果を発揮するためには、リンパ節に到達する必要があります。したがって、生体材料と組み込まれた免疫手がかりが局所リンパ節シグナル伝達にどのように影響するかを定義することは、これらのイベントを全身性免疫応答に結び付けるために重要です。

この知識は、生体材料ワクチンが従来の経路でどのように投与されるかをよりよく理解するのに役立ちます。生体材料のリンパ節内送達は、リンパ節の組織化に対する生体材料の影響を研究するツールとして機能しますが、このプラットフォームは、がんや自己免疫疾患を対象とした新しい治療ワクチンや免疫療法を開発するための応用機会も提供します。微粒子の場合、12ワットで氷上にポリマー脂質と他の水不溶性貨物を含む有機相が超音波処理されます。

水と油のエマルジョンを作成するには、500マイクロリットルの蒸留H2Oまたは1ミリグラムのペプチドタンパク質または他の水溶性貨物を含むH2Oを追加します。30秒間淫行を続けます。バイアルをエーターチップの周りで上下左右に静かに揺らして、完全な乳化を確保します。

今度は、16, 000 RPMで3分間均質化されたH2Oの40ミリリットルに水油エマルジョンを注ぐことによって、水エマルジョン中の水と油を準備します。次に、マグネティックスターバーを追加し、水エマルジョン中の水と油を一晩攪拌して、一晩で溶媒を除去した後、余分な溶媒を除去します。エマルジョンを40ミクロンのナイロンメッシュセルストレーナーに通して50ミリリットルの円錐管遠心分離機に5分間注ぎ、上清をデカントし、粒子のペレットを1ミリリットルの水に再懸濁し、懸濁した粒子を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。

5分間の遠心分離で粒子を収集します。レーザー回折または光散乱によって粒子サイズを測定します。彼女は、フラクションセルに添加された水の量は、フラクションセルに粒子懸濁液のピペット10マイクロリットルをアライメントし、ブランキングするのに十分なレベルにあります。

粒度分布分析器のコンパートメントドアを閉じます。次に、PLGAの粒子サイズを測定します。屈折率は 1.60 を使用します。

ソフトウェアインターフェースを使用して、注入の 1 日前に数値ベースで粒子径を計算します。iacucが承認した動物プロトコルに従ってマウスを麻酔します。つま先で麻酔の深さを評価します。

ピンチ反射テストと呼吸のモニタリングにより、毎分100〜120回の呼吸数を確保します。尾の付け根と後肢の毛を剃ります。動物の腹側から、後肢の関節のすぐ上の背側に向かって横方向に毛を取り除きます。

各色素注入について、マイクロピペットを使用して10マイクロリットルの色素溶液をマイクロセンターフュージチューブに移し、31ゲージの針を介して10マイクロリットル全体を1ミリリットルのインスリン注射器に吸引します。次に、注射の合間にローディングするために、テールベースの両側に10マイクロリットルの染料溶液を皮下注入します。マイルドな脱毛クリームを塗って、残った毛を取り除きます。

後ろ足と腹部の間の部分を必ずコーティングしてください。3分後、濡れた手袋をはめた手で温かいH two ohを使用し、脱毛クリームを肌にやさしくこすります。すぐに繰り返して、余分な脱毛剤を取り除きます。

次に、柔らかい布またはペーパータオルをぬるま湯で濡らし、マウスの下部を一気に拭きます。マウスをヒートランプの下に置いて回復し、少なくとも12時間保持します。麻酔をかけたマウスを検査して、各鼠径リンパ節への痕跡または色素の排出を確認します。

リンパ節は、後腿と腹部の近くの暗い斑点として見えるはずです。ここで、各注入に対して粒子を蒸留水に所望の注入濃度で再懸濁します。マイクロピペットを使用して、10マイクロリットルの粒子溶液をマイクロ遠心チューブに移します。

10マイクロリットル全体を1ミリリットルの注射器に取り付けられた31ゲージのインスリン針に吸引します。針を皮膚に対して90度の角度で、染色したリンパ節の周りの皮膚をぴんと張って引っ張ります。1ミリメートルの深さまで皮膚に浸透させます。

目に見えるリンパ節の肥大のために、全ボリュームモニタリングをゆっくりと注入します。マウスをヒートランプの下で回復させてから、保持状態に戻すか、追加のテストを実施します。まず、粒子の合成とサイズ分布を確認します。

エマルジョン溶媒蒸発合成プロトコルは、最終エマルジョンの目視検査によって定性的に評価することができます。生成。エマルジョンは、目に見える凝集体を含まない均質な懸濁液でなければなりません。部品の粒度分布はレーザー回折によって確認でき、動的光散乱粒子サンプルはモノモーダル分布を示す必要があります。

粒子合成のさらなる定性的評価は、蛍光ペプチドまたは親油性色素などの1つ以上の蛍光カーゴを組み込むようにプロトコルを変更することによって達成できます。染料を使用して、粒子注入用のリンパ節の位置を特定し、標的にすることができます トレーニング中、マウスは色素注入後に安楽死させ、剖検を行い、リンパ節の位置に精通することができます。感染したリンパ節のt細胞およびb細胞ゾーン内の粒子分布は、切片化および染色されたリンパ節の共焦点顕微鏡法によって確認されます。

サイズなどの粒子特性の違いは、注射後のリンパ節と蛍光顕微鏡によるイメージングで観察できます 一度習得すれば、この技術は2日間で完了することができます。粒子合成と動物の調製は初日に行われます。粒子洗浄の特性評価とリンパ節内注射は 2 日目に行われます。

このビデオを見れば、マウスの鼠径リンパ節を視覚化し、注入するために微量または色素をどのように使用できるかを十分に理解できるはずです。この技術により、生体材料ワクチンキャリアをリンパ節に直接非外科的に送達することができ、これまで不可能だった制御レベルを達成することができます。生体材料の直接リンパ節送達により、科学者やエンジニア、免疫学およびワクチン開発は、生体材料、ワクチン、免疫シグナルとリンパ節との基本的な相互作用を探求し、これらの材料が免疫を刺激し形成するメカニズムに新たな光を当てることができます。