生分解性高分子粒子のリンパ節内注入

本手順の全体的な目的は、直接注入法を用いてバイオマテリアルワクチン粒子をリンパ節に導入することである。まず、二重乳化法を用いて脂質安定化ポリマー粒子を合成する。次に、粒子を洗浄し、サイズ、積載量、封入効率、または安定性などの材料特性を測定する。

次に、マウスの尾根にトレーサー色素を投与し、リンパ節に色素が排出された後に可視化できるようにします。最後のステップは、標識されたリンパ節を特定し、その部位に少量のポリマー粒子を注入することです。組織学的検査、免疫蛍光染色、および共焦点顕微鏡を用いて、鼠径リンパ節における粒子の存在と分布を確認することができます。

リンパ節への直接注入をバイオマテリアルを用いたワクチン接種と組み合わせることで、リンパ節微小環境におけるワクチン成分の組み合わせと投与量を厳密に制御でき、これらの組織内でのカーゴの制御放出が可能になります。すべてのワクチンが効果を発揮するためには、リンパ節に到達する必要があります。したがって、バイオマテリアルおよび組み込まれた免疫シグナルが局所のリンパ節シグナリングにどのように影響するかを定義することは、これらの事象を全身性の免疫応答に結びつける上で重要です。

この知見は、従来の経路で投与されるバイオマテリアルワクチンの機能メカニズムをより深く理解するのに役立ちます。バイオマテリアルのリンパ節内投与は、リンパ節の組織化に対するバイオマテリアルの影響を研究するためのツールとなるだけでなく、がんや自己免疫疾患を標的とした新しい治療用ワクチンや免疫療法の開発への応用機会も提供します。マイクロ粒子を調製する場合、ポリマー脂質およびその他の水不溶性カーゴを含む有機相を、氷上で12 wattsで超音波処理します。

水と油のエマルションを作成するために、500 µLの蒸留H2O、または1 mgのペプチドタンパク質またはその他の水溶性カーゴを含むH2Oを加えます。30秒間撹拌を続けます。バイアルを上下左右に、撹拌チップの周囲でゆっくりと揺らし、完全に乳化させます。

次に、水中油型エマルションを40 mLのH2Oに加え、16,000 RPMで3分間ホモジナイズして、水および水中油型エマルションを調製します。続いて、マグネチックスターラーを加え、一晩撹拌して過剰な溶媒を除去します。エマルションを40 µmのナイロンメッシュセルストレーナーを通して50 mLのコニカルチューブ centrifuge で5分間遠心分離し、上清を捨て、粒子のペレットを1 mLの水で再懸濁させ、懸濁した粒子を1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移します。

5分間の遠心分離により粒子を回収します。レーザー回折法または光散乱法で粒子径を測定します。分画セルに添加した水の量が高精度の調整およびブランク測定に十分であることを確認してください。粒子懸濁液10 µLを分画セルにピペッティングします。

粒子径分析計のコンパートメントドアを閉じてください。次に、PLGAの粒子径を測定します。屈折率は1.60を使用してください。

ソフトウェアインターフェースを使用し、投与の1日前に個数基準で粒子径を算出します。IACUC承認済みの動物実験プロトコルに従ってマウスを麻酔します。足指を用いて麻酔深度を確認してください。

ピンチ反射を確認し、呼吸をモニターして、呼吸数が分間100～120回であることを確認します。尾の付け根と後肢の被毛を剃ります。動物の腹側から、後肢の関節のすぐ上の背側にかけて、側面に沿って被毛を除去します。

染料の注入ごとに、マイクロピペットを用いて10 µLの染料溶液をマイクロ遠心チューブに移し、31Gの針を通じて10 µLすべてを1 mLインスリン用注射器に吸い上げます。次に、注入の間隔を空けて、尾の付け根の両側に染料溶液を10 µLずつ皮下注射します。残っている毛を除去するために、低刺激性の除毛クリームを塗布してください。

後肢と腹部の間の領域を必ずコーティングしてください。3分後、温かいH₂Oをつけた手袋をはめた手で、除毛クリームを皮膚に優しく擦り込みます。すぐにこの操作を繰り返し、余分な除毛剤を取り除いてください。

次に、柔らかい布またはペーパータオルを温水で濡らし、マウスの下半身を一方向の動作で拭きます。マウスをヒートランプの下に置いて回復させ、その後、少なくとも12時間は飼育に戻します。麻酔をかけたマウスを検査し、各鼠径リンパ節にトレーサーまたは色素が導入されていることを確認してください。

リンパ節は、後ろ腿と腹部の近くに暗い点として観察されるはずです。次に、各注入に必要な注入濃度になるように、粒子を蒸留水で再懸濁します。マイクロピペットを使用して、10 µL の粒子溶液をマイクロ遠心チューブに分注します。

1 mLシリンジに取り付けた31ゲージのインスリン針で、10 µLすべてを吸引します。染色の済んだリンパ節周囲の皮膚を、針を皮膚に対して90度の角度に保持しながら taut に引っ張ります。皮膚を1 mmの深さまで貫通させます。

リンパ節の目に見える腫れを確認しながら、全量をゆっくりと注入します。マウスをヒートランプの下で回復させ、その後、飼育ケージに戻すか、追加の試験を実施します。まず、粒子の合成と粒度分布を確認してください。

エマルション溶媒蒸発合成プロトコルは、最終的なエマルションを視覚的に検査することで定性的に評価できます。生成されたエマルションは、目視で凝集物のない均一な懸濁液である必要があります。粒度分布は、レーザー回折法または動的光散乱法によって確認でき、粒子サンプルは単峰性の分布を示す必要があります。

粒子合成のさらなる定性的評価は、蛍光ペプチドや親油性染料などの1つ以上の蛍光貨物を組み込むようにプロトコルを変更することで達成できます。染料を用いて、粒子注入のためのリンパ節の場所を特定し、標的にすることができます。トレーニング期間中、マウスを安楽死させ、染料注入後に剖検を行うことで、リンパ節の位置に習熟させることができます。感染したリンパ節のT細胞領域およびB細胞領域における粒子の分布は、切片化および染色を行ったリンパ節の共焦点顕微鏡観察によって確認します。

粒子径などの粒子特性の違いは、注入後、蛍光顕微鏡によるイメージングを用いてリンパ節内で観察することができます。この手法を習得すれば、2日間で完了させることが可能です。1日目に粒子の合成と動物の準備を行い、2日目に粒子の洗浄、特性評価、およびリンパ節内注入を実施します。

このビデオを視聴することで、マウスの鼠径リンパ節を可視化し、そこに注入するためにトレーサーや染料をどのように使用するかについて、十分な理解が得られるはずです。この手法により、バイオマテリアルを用いたワクチンキャリアを、従来では不可能であったレベルの制御精度で、外科手術なしにリンパ節へ直接送達することが可能になります。バイオマテリアルのリンパ節への直接送達により、科学者やエンジニア、免疫学およびワクチン開発の研究者は、バイオマテリアルワクチンと免疫シグナルのリンパ節における根本的な相互作用を探索することができ、これらの材料が免疫を刺激し形成するメカニズムに新たな知見をもたらすでしょう。