Name: 培養細胞における小胞体サブドメインの可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 43 s
Description: 学ぶ 培養細胞における小胞体サブドメインの可視化手法。GFP標識タンパク質を用いた共焦点顕微鏡とFRAP技術により、小胞体内のタンパク質動態と超微細構造変化を解析する方法を解説します。

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著者らは、この記事の出版物でのヘルプとサポートのための伊Filareteに感謝しています。またTECNAI G2、透過型電子顕微鏡を使用するためのセントロEuropeoのディNanomedicinaに感謝したいと思います。

1。 ER蛍光タンパク質を用いて、プラスミド、細胞培養、およびトランスフェクション<ol><li>この研究で使用したプラスミドは、ラットシトクロムbのERアイソフォームのテール領域へのC-末端で融合GFPの拡張バージョンで構成され（5）リンカー配列を介して（bと（5）ここでは略す）。テール領域（5）は、アップストリームおよびダウンストリームの極性配列が隣接する17残基のTMD（膜貫通ドメイン）、（UPSとDPS）​​などのネイティブBのトリプシン切断の後に結合した膜のまま、全配列（Pro94-Asp134）が含まれています。リンカーは、[（グリシン）4セリン] 3、続いてmycエピトープから構成され、全体のcDNAを哺乳動物発現ベクターのpCDNA3-Hind3でののXba1部位に挿入される。このプラスミドの構造の詳細は、それがGFP-ER 16とも呼ばれる、以前の刊行物に記載されている。 </li><li> 10％フェタを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でCOS-7細胞を増殖させるLのウシ血清、2mMのL-グルタミン、37℃でインキュベーター中で1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび10％CO 2。 </li><li>トランスフェクション。製造者によって記載されているように、プレート3×10 5 6ウェルプレート中の丸いガラスカバースリップ上の細胞とは、次の日に、JetPEIシステムとトランスフェクト。我々の場合に、JetPEI：2:1のDNA比は、70〜80％のトランスフェクション効率をもたらす最適なJetPEI / DNA比は、使用されるプラスミドおよび細胞株に応じて、最大のトランスフェクション効率を確立するためにテストされていることに留意されたい。 </li></ol> 2。ライブ蛍光走査型共焦点顕微鏡<ol><li>生細胞イメージング。トランスフェクトされた細胞を10％FBS、2mMのL-グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、25mMのHEPESを補充したW / OフェノールレッドDMEMで充填された24mmカバースリップ用スチール培養細胞チャンバ内に播種したカバースリップを置く退色からサンプルを防ぐために、50μg/ mlのシクロヘキシミドおよび1:100 OxyFluor。 SP5共焦点microscopd個の GFP-ERは、488nmレーザー及び50分の525バンドパス発光フィルターを用いて可視化した状態で温度制御されたCO 2インキュベーター（37℃、5％CO 2）を備えた電子は、生細胞イメージング実験のために使用される。 </li><li> （FRAP）を光退色後蛍光回復。 OSER構造に対応する、関心領域（ROI）を描き、それは（試料で5.5〜6μWに対応する、30 mWのアルゴンレーザーの100％）の20回の反復と488nmの組み合わせを使用し、405nmの漂白（30 mWのダイオード405のレーザーの60％が、サンプルで11.6μWに相当する）我々の経験では、効率的かつ迅速な光退色につながる、レーザーが。 </li><li> 10分（画素時間= 1.61秒/ピクセル）のための単一フレームごとに10秒を取ることによって、漂白されたROI内の蛍光の回復を記録します。 </li><li> （フリップ）の光退色の蛍光損失。 OSER構造に対応するROI、上述したように漂白剤を描く。漂白は、30秒毎に繰り返される、とポスト漂白画像は30分（画素時間= 1.61秒/ピクセル）ごとに10秒を記録している。 </li><li> FRAPやFLIP分析。すべての画像は、ImageJソフトウェア（使用して分析する<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.htmlを</a> ）。 FRAP実験では、漂白されたROIの蛍光回復を経時的に測定され、常に経時的に一定であることがチェックされる漂白細胞の総蛍光に対して標準化。 </li><li> FLIP実験のために、漂白OSER外と細胞全体をカバーするROIを描画します。経時的に蛍光強度を測定し、撮像自体による蛍光の低下を補正するために前記未漂白のセルに描かれたROIの蛍光レベルに正規化する。 </li><li>全ての実験では、ROIの蛍光強度から（細胞の外側の領域で決定した）バックグラウンドシグナルを差し引く。最後に、Grのを使用して結果をプロットaphPad Prismソフトウェア。 </li></ol> 3。透過型電子顕微鏡を用いて超微細構造解析試薬の多くの毒性を考えると、すべての手順は、適切なラボを着て行われるべきである。ヒュームフードの下のコートと手袋。 <ol><li>ペトリ皿からカバースリップを除去した後、室温で10分間、0.1 Mカコジル酸緩衝液、pH7.4中で濾過し、2％グルタルアルデヒドを用いて単層として皿の底の上に成長した残りの細胞を固定する。 </li><li>テフロンスクレーパーを用いて細胞をこすり落とし、1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに転送します。 10分間9,000 gでの遠心分離により細胞をペレット化。上清を除去し、新鮮な固定を追加し、4℃で一晩のまま</li><li>次いで、室温で1時間カコジル酸緩衝液中の1％四酸化オスミウム溶液で後固定し、緩衝液でペレットを洗浄する。 </li><li>ミリQ水で洗い流し、とした一括染色エン20〜60の間分間蒸留水中1％酢酸ウラニル。 </li><li>エタノールシリーズ（70％、80％、90％、100％、10分ごとに、100％）の増加でサンプルを脱水し、プロピレンオキシド（15分毎）​​で二回簡単に洗浄する。 </li><li> （2時間から一晩）、プロピレンオキシド+エポン（1:1）の混合物中にサンプルを浸潤する。 </li><li>少なくとも24時間60℃で硬化さエポンエポキシ樹脂に埋め込む。 </li><li>セクション60から70ナノメートルの厚さの部分を取得するために45°のダイヤモンドナイフを装備したウルトラライカUC6を使用して手動でトリミングされた樹脂圏。 300メッシュ銅グリッド上のセクションを収集します。 </li><li>酢酸ウラニル（20分）の飽和溶液でグリッド上のセクションを染色し、クエン酸鉛（7分）、徹底的に再蒸留ろ過された水でそれらを浸漬することによってグリッドを洗浄し、それらを室温で乾燥させます。 </li><li>染色されたグリッドはTECNAI G2透過型電子顕微鏡を用いて観察し、画像がボットを使用して捕捉される（一般的には6,000-39,000 Xの範囲）異なる最終倍率でOMマウントされたCCDカメラ。 </li></ol>

<ol><li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li>
<li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+architecture%3A+structures+in+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li>
<li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li>
<li>Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-directional+protein+transport+between+the+ER+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bi-directional protein transport between the ER and.</a> 20, 87-123 (2004).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).</li>
<li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li>
<li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubic+membranes%3A+a+legend+beyond+the+Flatland%2A+of+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li>
<li>Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+ER%3A+experimental+approaches+and+current+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic ER: experimental approaches and current questions.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).</li>
<li>Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptor+causes+formation+of+ER+cisternal+stacks+in+transfected+fibroblasts+and+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 12, 327-342 (1994).</li>
<li>Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li>
<li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li>
<li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li>
<li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li>
<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+faces+of+protein+misfolding%3A+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li>
<li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP%2C+photoactivation%2C+photoconversion%2C+and+FLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このホワイトペーパーで説明プロトコルおよびイメージングのアプローチは、生細胞の小胞体内に常駐トランスフェクションしたTAの蛍光タンパク質の分布や移動性を調査するために使用されてきた。我々はまた、超微細構造解析により、この細胞内区画のアーキテクチャにこれらのタンパク質の過剰発現の効果を分析した。 生細胞の共焦点イメージングおよび電子顕微鏡法の組み合わせが表すタンパク質の動的な特性を調査する非常に強力な手段であり、タンパク質機能に関する重要な情報を提供することができる。記載された方法は時間がかかり（仕事の典型的には3日間）ではなく、画像収集及び分析のための多くのユーザーフレンドリーなソフトウェアアプリケーションの開発は、比較的単純な、生細胞イメージングベースの光退色ができる。 これらの技術の主な限界は、蛍光融合タンパク質の使用であるため、蛍光タグは、目的のタンパク質の適切な折り畳みおよび/またはアセンブリに影響を与えることができる。また、過剰発現は、トランスフェクション、蛍光タグ化タンパク質の挙動を変更することができ、したがって、...

緑色蛍光タンパク質（GFP）およびそのスペクトル変異体、および蛍光顕微鏡の並行開発の発見は、細胞におけるタンパク質の挙動の調査のための完全に新しい道を開いた。なぜなら強烈な照明の下での蛍光を消火する蛍光体の本質的な能力のために可能であるような（FRAP）を光退色後蛍光回復と（フリップ）の光退色の蛍光損失などの技術は、共焦点生細胞イメージングトランスフェクトの使用に基づいている蛍光融合タンパク質1-3。彼らは広く、その機能4に関する重要な手がかりを明らかにすることができ、タンパク質の局在だけでなく、彼らの機動性と小胞輸送だけでなく、を評価するために使用されています。 真核細胞のユニークな特徴は、特定の脂質およびタンパク質の組成物を有する細胞内コンパートメントの存在である。細胞小器官は、物理的に絶縁のあるですがオピニオン、それらは互いに通信し、細胞の恒常性を維持するために、分子成分を共有する必要がある。分泌経路は、ERで合成されたタンパク質や脂質は、彼らがその機能を発揮する正しい最終目的地に到達することが保証されます。細胞内小器官はまた、分子（脂質）が直接コンパートメントとの間で交換することを可能にする動的接触部位に接続することができる。さらに、多くのタンパク質は大きなヘテロ複合体で組み立てまたは機能的に活性になるか、その最終的な目的地に輸送されるために特定の脂質種（脂質ラフト/マイクロドメイン）に関連している。これらの生物学的局面の全てが大きく、タンパク質の動力学的特性に影響を与えるため、適宜、以下に記載される技術を用いて調べることができる。 我々のグループは、ERのアーキテクチャとその異なるサブを研究するために、電子顕微鏡と組み合わせ広く使われているFRAPやFLIPを持ってドメイン。 ER、分泌経路の最初のステーションであり、タンパク質および脂質5選別において重要な役割を果たしている。それは、その個別のサブドメイン（ すなわち 、タンパク質および脂質生合成および輸送、タンパク質の折り畳み、Ca 2 +の貯蔵と放出、および異物代謝）その多くの異なる機能を反映して非常にダイナミックな細胞小器官である。それらは形態学的に、空間的、および機能的に別個であるものの、これらのドメインは、互いに連続しており、それらの相対存在量は、生理学的および病理学的条件下で、細胞内で改変することができる。最もよく知られ、ERの通常空間的に分離されたドメインは、核膜、および平滑、粗ERであるが、我々及び他のER構造は、種々の細胞型におけるより精巧なアーキテクチャおよび三次元の組織に存在することが実証されているまた、低酸素症、薬物などのストレス刺激により誘導することができる、生理学的条件下での組織投与、またはERに存在する膜貫通タンパク質2,6の過剰発現（およびその中の参考文献）。 また、最近、ヒト疾患1,7の細胞モデルにおいて、このような構造の存在が実証されている。彼らはまた、彼らのような彼らのアーキテクチャに基づいてkarmellae、ラメラ 、及び晶質ERとして知られているが、滑らかなERの積み重ね嚢から発信さが、それらは、2003年6で編成滑面小胞体（OSER）の集合的な名前を与えられたサイズは、変えることができる。細胞が尾アンカー（TA）ERに存在するタンパク質（Dの EGFP-ER）の細胞質ゾル領域に融合GFPをトランスフェクトされた後、 トランスでGFPの弱い二量化傾向が劇的にERの組織や構造を変更します。 FRAPやFLIPの実験は、D EGFP-ERはOSERs内に拡散して自由であることを示した、それが&lt;OSERに網状ERから移動し、 その逆もあるという事実/ em&gt;は凝集体が周囲の網状のERと連続していることを示しています。超微細構造解析は、私たちは、ナノスケールレベルでのOSERアーキテクチャと組織の詳細な説明と蛍光データを相関させることができました。OSERsは、常に滑らかなERの対になった嚢のスタックで構成されていますが、このような規則的に正弦波に配置などの空間組織のさまざまな形態を有することができる配列や渦巻き、または六角形の「クリスタ」管状の配列。これらの再配列は、それらが生理学的条件下9および10低酸素症、薬物治療11、および癌9として以下の応力下で細胞中に見出されているように、超微細構造のマーカーとして大きな可能性を有していてもよい立方晶の形態8に導く。 GFP融合タンパク質を使用して、この最初の実証の後、我々は薬理学的治療12、ASSEに応答してERドメインの増殖を分析するためにイメージング実験を用いカテゴリーセル13にオリゴマー化するため、およびその病原1,8に関連し得るER由来の細胞内凝集体の形成における変異、ALS TA-結合タンパク質の役割を調べるために蛍光タンパク質の傾向。これは、（多くの神経変性疾患において生じる14）は、細胞内凝集物の形成が毒性変異体タンパク質及び周辺セル構成要素15との間の相互作用を防止するように設計された保護メカニズムであり得ることが示唆されている。 以下は、そのC末端疎水性ドメインはERの膜に挿入され、それらの動的挙動の解析およびERドメインに対するそれらの過剰発現の効果を調査するための構築物の光学および電子顕微鏡法の組合せの説明である培養細胞におけるアーキテクチャ（実験プロトコルのフローについては図1を参照）。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコModified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'Modified Eagle Medium (DMEM) w/o phenol red</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM solution</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus Transfection</td><td>PP10110</td><td></td></tr><tr><td>OxyFluor</td><td>Oxyrase株式 会社。</td><td>OF-0005</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド グレード I</td><td>Σ Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム三水和物</td><td>Σ Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム 4% 溶液</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ウラニル二水和物</td><td>Σ Aldrich</td><td>73943</td><td>わずかに放射性</td></tr><tr><td>プロピレンオキシド</td><td>Σ-Aldrich</td><td>82320</td><td></td></tr><tr><td>EPON埋め込み培地キット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359-1EA-F</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸鉛</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>17800</td><td></td></tr><tr><td>ベンチトップ遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>スペクトル共焦点顕微鏡 </td><td>ライカマイクロシステム</td>ズ <td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>CO2 顕微鏡ケージインキュベーションシステム </td><td>OkoLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome </td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドナイフ </td><td>Diatome</td><td>Ultra 45 &deg;</td><td></td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡 </td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prismソフトウェア</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24mm用鋼製培養細胞チャンバー カバーガラス</td><td>バイオサイエンスツール</td><td>CSC-25</td><td></td></tr><tr><td>電子顕微鏡グリッド</td><td>電子顕微鏡 Science</td><td>G300Cu</td><td></td></tr></tbody></table>

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

これらは強烈interorganelle分子のトラフィックにもかかわらず、彼らの独特の構成と機能を保持しているが、真核細胞での脂質とタンパク質が連続的に、細胞区画間で交換される。このホワイトペーパーに記載されている技術は、 生体内とその生理的な環境で、タンパク質や脂質の移動と人身売買を研究する強力な手段である。 （FLIP）の光退色で（FRAP）の光退色後の蛍光回復および蛍光損失が広くエキソ - エンドサイトーシス経路、オルガネラまたはサブコンパートメント間の連続性、タンパク質複合体の形成、およびタンパク質局在化を介して細胞内輸送を研究するための生細胞イメージング技術を用いている脂質ミクロドメインに、それらの全ては生理学的および病理学的条件下で観察することができる。これらのアプローチの限界は、主に蛍光性融合タンパク質の使用によるものであり、それらの潜在的な欠点は、過剰発現アーチファクトを含む細胞内のイオンと、タグ付きおよび天然のタンパク質のフォールディングおよびローカリゼーションの違いの可能性。最後に、光学顕微鏡（約200nm）の解像度の限界としてストレス下の細胞に由来することができERまたは特定のサブコンパートメントの微細構造の調査を許可していない（ すなわち低酸素症、薬物投与、膜貫通の過剰発現ER常在性タンパク質）または病理学的条件の下で、我々は超微細で培養されたトランスフェクトされた細胞の生細胞イメージングを組み合わせることは、透過型電子顕微鏡法に基づいて解析する。

図2は、タンパク質の移動の例FRAP研究を示しています。 dは EGFP-ERタンパク質の移動度は、漂白OSERsに光退色後蛍光回復急速によって実証される。定量分析のために、半分の時間、モバイル画分は、以下の単一指数の式を当てはめることによって実験的に測定されたデータから導出された。 F（T）= F ポスト +（F REC-Fポスト ）（1-E-T /τ） F ポストは 、光退色後の蛍光シグナルであり、F rec視聴、登録時トン 、漂白後に到達し、時定数τ最大蛍光回復値である。 蛍光回復と、結果的に、タンパク質の移動度分析を変える可能性が飽和画素せずに画像を取得することの重要性に注意してください。それI常に焦点面での画...

私たちは、生きた細胞の共焦点イメージングにより、小胞体（ER）に常駐トランスフェクションし、蛍光タンパク質の分布や移動性を調査するために使用して画像化のアプローチについて説明します。また、超微細構造、この細胞内区画のアーキテクチャにその発現の効果を分析する。

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

本実験の全体的な目的は、トランスフェクションされた蛍光タンパク質が小胞体内でどのように分布し移動するかを調査し、その発現が超微細構造に及ぼす影響を評価することである。この目的を達成するため、培養細胞にGFPタグ付きの小胞体局在型テールアンカータンパク質を一過性にトランスフェクションさせる。トランスフェクション後、生細胞共焦点イメージングを行い、光退色後の蛍光回復（FRAP）および蛍光消失を評価する。フォトブリーチング（光退色）またはFRAPにおいて、透過型電子顕微鏡を用いて超微形態解析が行われます。得られたデータは、GFPタグ付きB5コンストラクトの発現が小胞体の組織および構造を劇的に変化させ、凝集体の形成を誘導することを示しています。ここで提示する方法は、タンパク質や脂質の移動および輸送など、基本的な細胞生物学的プロセスへの知見を提供できます。また、薬理学的治療への反応の検討、蛍光タンパク質やオリゴマー化の評価、あるいは筋萎縮性側索硬化症などの疾患において病原性と関連があると考えられる細胞内凝集体の形成における病原性変異タンパク質の役割の研究に利用することも可能です。本研究で使用したプラスミドは、リンカー配列を介して、ラットシトクロムB5のerアイソフォームのテイル領域にC末端で融合させた強化版GFPで構成されています。B5のテイル領域には、トリプシンによる切断後も膜に結合したままとなる全配列が含まれています。これには、上流および下流の極性配列に挟まれた17残基の膜貫通ドメインが含まれます。リンカーはMエピトープとそれに続くGLY four S3で構成されています。cDNA全体を哺乳類発現ベクターpcDNA3のHindIIIおよびXhoIサイトに挿入します。トランスフェクションの準備として、COS-7細胞をサプリメント添加DMEM中で37 °C、5% CO2にて培養します。トランスフェクションの前日に、6ウェルプレート内の丸型24 mmガラスカバースリップ上に3 × 10⁵ 個の細胞を播種します。メーカーの指示に従い、jet PEIシステムを用いて細胞にトランスフェクションを行います。ここでは、jet PEIとDNAの比率を2:1として使用します。これにより、通常70から80%のトランスフェクション効率が得られます。イメージングを行うまで、細胞を37°C、5% CO2条件下で24時間維持します。次に、ピンセットを使用して、トランスフェクトした細胞が載ったカバーガラスをイメージングチャンバーに移します。残りの細胞を保存するため、組織培養皿をインキュベーターに戻します。電子顕微鏡による超微細構造解析を行う場合、またはライブセルイメージングを行う場合は、スチール製セルカルチャーチャンバーにイメージング培地を2 mL加えます。サンプルの光退色を防ぐため、イメージング培地にはXi Fluorを添加します。タンパク質生合成によるA蛍光信号および結果としての全蛍光の増加を避けるため、翻訳阻害剤であるsmideの存在下で実験を行う必要があります。温度制御可能なCO2インキュベーターと、蛍光回復を行うための適切な光電子増倍管設定を備えた適切なレーザーを搭載した共焦点顕微鏡のステージ上に、イメージングチャンバーを設置します。光退色またはフラック（frack）の後、細胞にピントを合わせ、ピクセルの飽和を避けるように取得パラメータを設定します。また、画像取得による光退色を防ぐため、レーザー出力は可能な限り低く設定してください。イメージングパラメータの設定が完了したら、2個以上の細胞が含まれる新しい視野に移動します。各視野の細胞1つは未漂白のままにしておき、漂白した細胞の蛍光信号を正規化するための対照として使用します。漂白にあたっては、組織化された滑面小胞体（OSER）に対応する関心領域（ROI）を描画してください。効率的かつ迅速に光退色させるため、適切な反復回数を設定してイメージングプログラムで退色処理を行います。必要に応じて、488 nmと405 nmのレーザーを組み合わせて使用してください。実験の全行程（退色前、退色中、および回復期間を含む）において、10秒ごとに1フレームを10分間キャプチャするようにソフトウェアを設定します。すべての準備が整ったら、脱色とキャプチャを開始します。キャプチャが完了したら、新しい視野に移動してこのプロセスを繰り返します。各カバーにつき、4〜5つの視野をキャプチャしてください。次に、光退色またはフリッピングにおける蛍光損失を測定します。プログラムで、10分間、30秒ごとに10秒間の退色および退色後イメージングを繰り返すシーケンスを実行し、その後、新しい視野に移動するように設定します。OSER構造に対応するROIを描画し、解析のために前述と同様に退色とキャプチャを開始します。FRAPおよびFLIPの画像をImage Jソフトウェアにインポートします。まず、FRAP実験において、退色させたROIの蛍光回復を時間経過とともに評価し、次に細胞外の領域を選択して背景蛍光を決定し、その平均強度を時間経過とともに測定します。続いて、ROIの蛍光強度から背景信号を差し引きます。データを、時間経過とともに一定であるはずの漂白細胞の全蛍光強度で正規化します。次に、ここに示す単一指数関数式にフィッティングさせます。ここで、F postは光漂白後の蛍光信号、F recは漂白後に到達した最大蛍光回復値、Tは記録の最終時間、tauは記録の中間時間を表します。フリップ実験の解析では、漂白されたOSERの外側に、細胞全体をカバーするROIを設定し、その蛍光強度の経時的変化を測定します。フラック実験については、細胞外の領域を使用してバックグラウンドを減算します。また、イメージング自体によって引き起こされる蛍光強度の低下を補正するため、漂白されていない細胞に設定したROIの蛍光レベルでデータを正規化します。最後に、GraphPad Prismまたは同様のソフトウェアを用いて結果をプロットします。電子顕微鏡用の試料調製に使用する試薬の多くには毒性があります。したがって、以下の手順は、ドラフトチャンバー内でラボコートと手袋を着用して行ってください。光学顕微鏡観察用にペトリ皿からカバーガラスを取り外した後、皿の底に単層に増殖した残りの細胞を、室温で10分間固定します。次に、テフロンスクレーパーを用いて細胞を剥離させ、1.5 milliliter マイクロ遠心チューブに移し、9,000 ×g で10分間遠心分離して細胞をペレット化します。上清を除去し、新鮮な固定液を加えて、4 °C で一晩静置します。パステールピペットで固定液を穏やかに吸引し、Cateバッファーを加えてペレットを洗浄します。ペレットを乱さないよう、バッファーを加える際はチューブの側壁を伝わせて流し込みます。洗浄液を吸引し、Cateバッファーに溶解した1%四酸化オスミウム溶液を加え、室温で1時間後固定を行います。次に、Milli Q水で洗浄し、蒸留水で調製した1%酢酸尿素をマイクロ遠心チューブに直接加えます。20分から1時間かけて脱掩蔽を行い、70%、80%、90%、100%、そして再度100%の昇順エタノール系列で各10分間、サンプルの脱水を行います。その後、プロピレンオキシドでペレットを15分間ずつ2回洗浄します。プロピレンオキシドをプロピレンオキシドとEponの1:1混合液に置換して試料を浸透させ、少なくとも2時間から、必要に応じて一晩インキュベートします。次に、試料を包埋するため、細胞ペレットの断片をEponエポキシ樹脂があらかじめ満たされた包埋型に入れ、60 °Cで少なくとも24時間硬化させます。翌日、樹脂ブロックを45度のダイヤモンドナイフを備えたウルトラミクロトームに装着します。トリミングナイフを用いて、樹脂ブロックから試料が埋め込まれていない部分を手作業で切り出します。次に、ウルトラミクロトームを使用して、厚さ60〜70 nanometerの薄切片を作成します。切片を染色するため、300 meshの銅製グリッド上に回収します。グリッドを30 µLの飽和尿酸酢酸溶液の液滴上に置き、20分間インキュベートします。次に、milli Q水で3回洗浄し、リードシトレートの小滴上でさらに7分間インキュベートします。インキュベーション後、グリッドをmilli Q水に浸して十分に洗浄し、室温で乾燥させます。透過電子顕微鏡を用いて染色したグリッドを観察し、底部に取り付けられたCCDカメラを使用して、6,000から39,000倍の最終倍率で画像をキャプチャし、組織化された滑面小胞体におけるD-E-G-F-P ERの側方拡散を調査します。一過性 transfection を行った3枚のカバーガラスから7個の細胞を採取し、本ビデオで説明するようにFRAPで解析しました。このタイムラプスシーケンスに示すように、2つのOSER構造を退色させ、蛍光回復を時間経過とともに記録しました。退色から1分後に明確な蛍光回復が検出され、さらに4分後に信号のさらなる増加が認められました。これにより、回復半減期を決定し、D-E-G-F-P-E-Rの可動分率を定量化しました。撮影された画像は、こちらで確認できる通り、本ビデオで説明した方法で解析されました。退色領域の蛍光強度は時間とともに増加し、蛍光タンパク質が凝集物内で高い可動性を有していることが示されました。小胞体（ER）の異なるサブドメイン間の連続性を調べるため、このタイムラプスシーケンスに示すようにフリップ実験を行いました。黄色い矢印で示されたOSERの連続的な退色により、同一細胞内の他のERおよび他のOSER構造における蛍光が漸次的に減少します。赤い矢印は、蛍光信号が時間経過とともに一定である未退色の細胞の一部を示しています。これらのデータの定量分析により、網状のERが漸次的に急速に空くなることが明らかになり、凝集体がERの他の部分と物理的に連結していることが実証されました。これらの凝集体の微細構造を調べるため、高レベルのD-E-G-F-P ERを発現している細胞を透過型電子顕微鏡を用いて観察しました。この顕微鏡写真は、膜の凝集体を含む細胞質を低倍率で示したものです。この凝集体は、スタック状のcyiと波状の正弦波状膜で構成されています。ここで確認できる通りです。ミトコンドリアがOSER構造の周囲に集簇しているのが見られ、一方で矢頭で示されるリボソームは、最外層のcyiの膜にのみ付着しています。膜間の厚さ11 nanometerの電子密度の高い領域が、細胞質と連続していることに注目してください。OS ERは層状のerによって形成されており、これは扁平なer cyiの積層構造で、薄切切片では連続しているか、あるいは断片的に見えます。ここに示すように、積層の最外層の槽から小胞が出芽する様子が時折観察されます。以上のデータを総合すると、D-E-G-F-P ERを導入した培養細胞で観察された蛍光凝集体は、空間的に明確な3D幾何学構造を形成する、滑らかで扁平なER steriのパッチであることが示されました。本手順を行う際は、飽和ピクセルがない状態で全ての画像を撮影することが重要です。ピクセルの飽和は蛍光回復に影響を与え、結果としてタンパク質移動度の解析を歪める可能性があります。また、画像取得中の退色による蛍光強度の変動や、焦点面のわずかなずれを考慮するため、漂白領域（ROI）の蛍光信号を同一細胞の総蛍光量で必ず正規化してください。

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Research

JoVE Journal

Biology

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