Name: 培養細胞における小胞体サブドメインの可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 43 s
Description: 学ぶ 培養細胞における小胞体サブドメインの可視化手法。GFP標識タンパク質を用いた共焦点顕微鏡とFRAP技術により、小胞体内のタンパク質動態と超微細構造変化を解析する方法を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

著者らは、この記事の出版物でのヘルプとサポートのための伊Filareteに感謝しています。またTECNAI G2、透過型電子顕微鏡を使用するためのセントロEuropeoのディNanomedicinaに感謝したいと思います。

1。 ER蛍光タンパク質を用いて、プラスミド、細胞培養、およびトランスフェクション<ol><li>この研究で使用したプラスミドは、ラットシトクロムbのERアイソフォームのテール領域へのC-末端で融合GFPの拡張バージョンで構成され（5）リンカー配列を介して（bと（5）ここでは略す）。テール領域（5）は、アップストリームおよびダウンストリームの極性配列が隣接する17残基のTMD（膜貫通ドメイン）、（UPSとDPS）​​などのネイティブBのトリプシン切断の後に結合した膜のまま、全配列（Pro94-Asp134）が含まれています。リンカーは、[（グリシン）4セリン] 3、続いてmycエピトープから構成され、全体のcDNAを哺乳動物発現ベクターのpCDNA3-Hind3でののXba1部位に挿入される。このプラスミドの構造の詳細は、それがGFP-ER 16とも呼ばれる、以前の刊行物に記載されている。 </li><li> 10％フェタを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でCOS-7細胞を増殖させるLのウシ血清、2mMのL-グルタミン、37℃でインキュベーター中で1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび10％CO 2。 </li><li>トランスフェクション。製造者によって記載されているように、プレート3×10 5 6ウェルプレート中の丸いガラスカバースリップ上の細胞とは、次の日に、JetPEIシステムとトランスフェクト。我々の場合に、JetPEI：2:1のDNA比は、70〜80％のトランスフェクション効率をもたらす最適なJetPEI / DNA比は、使用されるプラスミドおよび細胞株に応じて、最大のトランスフェクション効率を確立するためにテストされていることに留意されたい。 </li></ol> 2。ライブ蛍光走査型共焦点顕微鏡<ol><li>生細胞イメージング。トランスフェクトされた細胞を10％FBS、2mMのL-グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、25mMのHEPESを補充したW / OフェノールレッドDMEMで充填された24mmカバースリップ用スチール培養細胞チャンバ内に播種したカバースリップを置く退色からサンプルを防ぐために、50μg/ mlのシクロヘキシミドおよび1:100 OxyFluor。 SP5共焦点microscopd個の GFP-ERは、488nmレーザー及び50分の525バンドパス発光フィルターを用いて可視化した状態で温度制御されたCO 2インキュベーター（37℃、5％CO 2）を備えた電子は、生細胞イメージング実験のために使用される。 </li><li> （FRAP）を光退色後蛍光回復。 OSER構造に対応する、関心領域（ROI）を描き、それは（試料で5.5〜6μWに対応する、30 mWのアルゴンレーザーの100％）の20回の反復と488nmの組み合わせを使用し、405nmの漂白（30 mWのダイオード405のレーザーの60％が、サンプルで11.6μWに相当する）我々の経験では、効率的かつ迅速な光退色につながる、レーザーが。 </li><li> 10分（画素時間= 1.61秒/ピクセル）のための単一フレームごとに10秒を取ることによって、漂白されたROI内の蛍光の回復を記録します。 </li><li> （フリップ）の光退色の蛍光損失。 OSER構造に対応するROI、上述したように漂白剤を描く。漂白は、30秒毎に繰り返される、とポスト漂白画像は30分（画素時間= 1.61秒/ピクセル）ごとに10秒を記録している。 </li><li> FRAPやFLIP分析。すべての画像は、ImageJソフトウェア（使用して分析する<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.htmlを</a> ）。 FRAP実験では、漂白されたROIの蛍光回復を経時的に測定され、常に経時的に一定であることがチェックされる漂白細胞の総蛍光に対して標準化。 </li><li> FLIP実験のために、漂白OSER外と細胞全体をカバーするROIを描画します。経時的に蛍光強度を測定し、撮像自体による蛍光の低下を補正するために前記未漂白のセルに描かれたROIの蛍光レベルに正規化する。 </li><li>全ての実験では、ROIの蛍光強度から（細胞の外側の領域で決定した）バックグラウンドシグナルを差し引く。最後に、Grのを使用して結果をプロットaphPad Prismソフトウェア。 </li></ol> 3。透過型電子顕微鏡を用いて超微細構造解析試薬の多くの毒性を考えると、すべての手順は、適切なラボを着て行われるべきである。ヒュームフードの下のコートと手袋。 <ol><li>ペトリ皿からカバースリップを除去した後、室温で10分間、0.1 Mカコジル酸緩衝液、pH7.4中で濾過し、2％グルタルアルデヒドを用いて単層として皿の底の上に成長した残りの細胞を固定する。 </li><li>テフロンスクレーパーを用いて細胞をこすり落とし、1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに転送します。 10分間9,000 gでの遠心分離により細胞をペレット化。上清を除去し、新鮮な固定を追加し、4℃で一晩のまま</li><li>次いで、室温で1時間カコジル酸緩衝液中の1％四酸化オスミウム溶液で後固定し、緩衝液でペレットを洗浄する。 </li><li>ミリQ水で洗い流し、とした一括染色エン20〜60の間分間蒸留水中1％酢酸ウラニル。 </li><li>エタノールシリーズ（70％、80％、90％、100％、10分ごとに、100％）の増加でサンプルを脱水し、プロピレンオキシド（15分毎）​​で二回簡単に洗浄する。 </li><li> （2時間から一晩）、プロピレンオキシド+エポン（1:1）の混合物中にサンプルを浸潤する。 </li><li>少なくとも24時間60℃で硬化さエポンエポキシ樹脂に埋め込む。 </li><li>セクション60から70ナノメートルの厚さの部分を取得するために45°のダイヤモンドナイフを装備したウルトラライカUC6を使用して手動でトリミングされた樹脂圏。 300メッシュ銅グリッド上のセクションを収集します。 </li><li>酢酸ウラニル（20分）の飽和溶液でグリッド上のセクションを染色し、クエン酸鉛（7分）、徹底的に再蒸留ろ過された水でそれらを浸漬することによってグリッドを洗浄し、それらを室温で乾燥させます。 </li><li>染色されたグリッドはTECNAI G2透過型電子顕微鏡を用いて観察し、画像がボットを使用して捕捉される（一般的には6,000-39,000 Xの範囲）異なる最終倍率でOMマウントされたCCDカメラ。 </li></ol>

<ol><li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li>
<li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+architecture%3A+structures+in+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li>
<li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li>
<li>Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-directional+protein+transport+between+the+ER+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bi-directional protein transport between the ER and.</a> 20, 87-123 (2004).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).</li>
<li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li>
<li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubic+membranes%3A+a+legend+beyond+the+Flatland%2A+of+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li>
<li>Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+ER%3A+experimental+approaches+and+current+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic ER: experimental approaches and current questions.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).</li>
<li>Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptor+causes+formation+of+ER+cisternal+stacks+in+transfected+fibroblasts+and+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 12, 327-342 (1994).</li>
<li>Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li>
<li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li>
<li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li>
<li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li>
<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+faces+of+protein+misfolding%3A+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li>
<li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP%2C+photoactivation%2C+photoconversion%2C+and+FLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このホワイトペーパーで説明プロトコルおよびイメージングのアプローチは、生細胞の小胞体内に常駐トランスフェクションしたTAの蛍光タンパク質の分布や移動性を調査するために使用されてきた。我々はまた、超微細構造解析により、この細胞内区画のアーキテクチャにこれらのタンパク質の過剰発現の効果を分析した。 生細胞の共焦点イメージングおよび電子顕微鏡法の組み合わせが表すタンパク質の動的な特性を調査する非常に強力な手段であり、タンパク質機能に関する重要な情報を提供することができる。記載された方法は時間がかかり（仕事の典型的には3日間）ではなく、画像収集及び分析のための多くのユーザーフレンドリーなソフトウェアアプリケーションの開発は、比較的単純な、生細胞イメージングベースの光退色ができる。 これらの技術の主な限界は、蛍光融合タンパク質の使用であるため、蛍光タグは、目的のタンパク質の適切な折り畳みおよび/またはアセンブリに影響を与えることができる。また、過剰発現は、トランスフェクション、蛍光タグ化タンパク質の挙動を変更することができ、したがって、...

緑色蛍光タンパク質（GFP）およびそのスペクトル変異体、および蛍光顕微鏡の並行開発の発見は、細胞におけるタンパク質の挙動の調査のための完全に新しい道を開いた。なぜなら強烈な照明の下での蛍光を消火する蛍光体の本質的な能力のために可能であるような（FRAP）を光退色後蛍光回復と（フリップ）の光退色の蛍光損失などの技術は、共焦点生細胞イメージングトランスフェクトの使用に基づいている蛍光融合タンパク質1-3。彼らは広く、その機能4に関する重要な手がかりを明らかにすることができ、タンパク質の局在だけでなく、彼らの機動性と小胞輸送だけでなく、を評価するために使用されています。 真核細胞のユニークな特徴は、特定の脂質およびタンパク質の組成物を有する細胞内コンパートメントの存在である。細胞小器官は、物理的に絶縁のあるですがオピニオン、それらは互いに通信し、細胞の恒常性を維持するために、分子成分を共有する必要がある。分泌経路は、ERで合成されたタンパク質や脂質は、彼らがその機能を発揮する正しい最終目的地に到達することが保証されます。細胞内小器官はまた、分子（脂質）が直接コンパートメントとの間で交換することを可能にする動的接触部位に接続することができる。さらに、多くのタンパク質は大きなヘテロ複合体で組み立てまたは機能的に活性になるか、その最終的な目的地に輸送されるために特定の脂質種（脂質ラフト/マイクロドメイン）に関連している。これらの生物学的局面の全てが大きく、タンパク質の動力学的特性に影響を与えるため、適宜、以下に記載される技術を用いて調べることができる。 我々のグループは、ERのアーキテクチャとその異なるサブを研究するために、電子顕微鏡と組み合わせ広く使われているFRAPやFLIPを持ってドメイン。 ER、分泌経路の最初のステーションであり、タンパク質および脂質5選別において重要な役割を果たしている。それは、その個別のサブドメイン（ すなわち 、タンパク質および脂質生合成および輸送、タンパク質の折り畳み、Ca 2 +の貯蔵と放出、および異物代謝）その多くの異なる機能を反映して非常にダイナミックな細胞小器官である。それらは形態学的に、空間的、および機能的に別個であるものの、これらのドメインは、互いに連続しており、それらの相対存在量は、生理学的および病理学的条件下で、細胞内で改変することができる。最もよく知られ、ERの通常空間的に分離されたドメインは、核膜、および平滑、粗ERであるが、我々及び他のER構造は、種々の細胞型におけるより精巧なアーキテクチャおよび三次元の組織に存在することが実証されているまた、低酸素症、薬物などのストレス刺激により誘導することができる、生理学的条件下での組織投与、またはERに存在する膜貫通タンパク質2,6の過剰発現（およびその中の参考文献）。 また、最近、ヒト疾患1,7の細胞モデルにおいて、このような構造の存在が実証されている。彼らはまた、彼らのような彼らのアーキテクチャに基づいてkarmellae、ラメラ 、及び晶質ERとして知られているが、滑らかなERの積み重ね嚢から発信さが、それらは、2003年6で編成滑面小胞体（OSER）の集合的な名前を与えられたサイズは、変えることができる。細胞が尾アンカー（TA）ERに存在するタンパク質（Dの EGFP-ER）の細胞質ゾル領域に融合GFPをトランスフェクトされた後、 トランスでGFPの弱い二量化傾向が劇的にERの組織や構造を変更します。 FRAPやFLIPの実験は、D EGFP-ERはOSERs内に拡散して自由であることを示した、それが&lt;OSERに網状ERから移動し、 その逆もあるという事実/ em&gt;は凝集体が周囲の網状のERと連続していることを示しています。超微細構造解析は、私たちは、ナノスケールレベルでのOSERアーキテクチャと組織の詳細な説明と蛍光データを相関させることができました。OSERsは、常に滑らかなERの対になった嚢のスタックで構成されていますが、このような規則的に正弦波に配置などの空間組織のさまざまな形態を有することができる配列や渦巻き、または六角形の「クリスタ」管状の配列。これらの再配列は、それらが生理学的条件下9および10低酸素症、薬物治療11、および癌9として以下の応力下で細胞中に見出されているように、超微細構造のマーカーとして大きな可能性を有していてもよい立方晶の形態8に導く。 GFP融合タンパク質を使用して、この最初の実証の後、我々は薬理学的治療12、ASSEに応答してERドメインの増殖を分析するためにイメージング実験を用いカテゴリーセル13にオリゴマー化するため、およびその病原1,8に関連し得るER由来の細胞内凝集体の形成における変異、ALS TA-結合タンパク質の役割を調べるために蛍光タンパク質の傾向。これは、（多くの神経変性疾患において生じる14）は、細胞内凝集物の形成が毒性変異体タンパク質及び周辺セル構成要素15との間の相互作用を防止するように設計された保護メカニズムであり得ることが示唆されている。 以下は、そのC末端疎水性ドメインはERの膜に挿入され、それらの動的挙動の解析およびERドメインに対するそれらの過剰発現の効果を調査するための構築物の光学および電子顕微鏡法の組合せの説明である培養細胞におけるアーキテクチャ（実験プロトコルのフローについては図1を参照）。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコModified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'Modified Eagle Medium (DMEM) w/o phenol red</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM solution</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus Transfection</td><td>PP10110</td><td></td></tr><tr><td>OxyFluor</td><td>Oxyrase株式 会社。</td><td>OF-0005</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド グレード I</td><td>Σ Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム三水和物</td><td>Σ Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム 4% 溶液</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ウラニル二水和物</td><td>Σ Aldrich</td><td>73943</td><td>わずかに放射性</td></tr><tr><td>プロピレンオキシド</td><td>Σ-Aldrich</td><td>82320</td><td></td></tr><tr><td>EPON埋め込み培地キット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359-1EA-F</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸鉛</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>17800</td><td></td></tr><tr><td>ベンチトップ遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>スペクトル共焦点顕微鏡 </td><td>ライカマイクロシステム</td>ズ <td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>CO2 顕微鏡ケージインキュベーションシステム </td><td>OkoLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome </td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドナイフ </td><td>Diatome</td><td>Ultra 45 &deg;</td><td></td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡 </td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prismソフトウェア</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24mm用鋼製培養細胞チャンバー カバーガラス</td><td>バイオサイエンスツール</td><td>CSC-25</td><td></td></tr><tr><td>電子顕微鏡グリッド</td><td>電子顕微鏡 Science</td><td>G300Cu</td><td></td></tr></tbody></table>

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

これらは強烈interorganelle分子のトラフィックにもかかわらず、彼らの独特の構成と機能を保持しているが、真核細胞での脂質とタンパク質が連続的に、細胞区画間で交換される。このホワイトペーパーに記載されている技術は、 生体内とその生理的な環境で、タンパク質や脂質の移動と人身売買を研究する強力な手段である。 （FLIP）の光退色で（FRAP）の光退色後の蛍光回復および蛍光損失が広くエキソ - エンドサイトーシス経路、オルガネラまたはサブコンパートメント間の連続性、タンパク質複合体の形成、およびタンパク質局在化を介して細胞内輸送を研究するための生細胞イメージング技術を用いている脂質ミクロドメインに、それらの全ては生理学的および病理学的条件下で観察することができる。これらのアプローチの限界は、主に蛍光性融合タンパク質の使用によるものであり、それらの潜在的な欠点は、過剰発現アーチファクトを含む細胞内のイオンと、タグ付きおよび天然のタンパク質のフォールディングおよびローカリゼーションの違いの可能性。最後に、光学顕微鏡（約200nm）の解像度の限界としてストレス下の細胞に由来することができERまたは特定のサブコンパートメントの微細構造の調査を許可していない（ すなわち低酸素症、薬物投与、膜貫通の過剰発現ER常在性タンパク質）または病理学的条件の下で、我々は超微細で培養されたトランスフェクトされた細胞の生細胞イメージングを組み合わせることは、透過型電子顕微鏡法に基づいて解析する。

図2は、タンパク質の移動の例FRAP研究を示しています。 dは EGFP-ERタンパク質の移動度は、漂白OSERsに光退色後蛍光回復急速によって実証される。定量分析のために、半分の時間、モバイル画分は、以下の単一指数の式を当てはめることによって実験的に測定されたデータから導出された。 F（T）= F ポスト +（F REC-Fポスト ）（1-E-T /τ） F ポストは 、光退色後の蛍光シグナルであり、F rec視聴、登録時トン 、漂白後に到達し、時定数τ最大蛍光回復値である。 蛍光回復と、結果的に、タンパク質の移動度分析を変える可能性が飽和画素せずに画像を取得することの重要性に注意してください。それI常に焦点面での画...

私たちは、生きた細胞の共焦点イメージングにより、小胞体（ER）に常駐トランスフェクションし、蛍光タンパク質の分布や移動性を調査するために使用して画像化のアプローチについて説明します。また、超微細構造、この細胞内区画のアーキテクチャにその発現の効果を分析する。

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

本実験の全体的な目的は、トランスフェクションされた蛍光タンパク質が小胞体内でどのように分布し移動するかを調査し、その発現が超微細構造に及ぼす影響を評価することである。この目的を達成するため、培養細胞にGFPタグ付きの小胞体局在型テールアンカータンパク質を一過性にトランスフェクションさせる。トランスフェクション後、生細胞共焦点イメージングを行い、光退色後の蛍光回復（FRAP）および蛍光消失を評価する。フォトブリーチング（光退色）またはFRAPにおいて、透過型電子顕微鏡を用いて超微形態解析が行われます。得られたデータは、GFPタグ付きB5コンストラクトの発現が小胞体の組織および構造を劇的に変化させ、凝集体の形成を誘導することを示しています。ここで提示する方法は、タンパク質や脂質の移動および輸送など、基本的な細胞生物学的プロセスへの知見を提供できます。また、薬理学的治療への反応の検討、蛍光タンパク質やオリゴマー化の評価、あるいは筋萎縮性側索硬化症などの疾患において病原性と関連があると考えられる細胞内凝集体の形成における病原性変異タンパク質の役割の研究に利用することも可能です。本研究で使用したプラスミドは、リンカー配列を介して、ラットシトクロムB5のerアイソフォームのテイル領域にC末端で融合させた強化版GFPで構成されています。B5のテイル領域には、トリプシンによる切断後も膜に結合したままとなる全配列が含まれています。これには、上流および下流の極性配列に挟まれた17残基の膜貫通ドメインが含まれます。リンカーはMエピトープとそれに続くGLY four S3で構成されています。cDNA全体を哺乳類発現ベクターpcDNA3のHindIIIおよびXhoIサイトに挿入します。トランスフェクションの準備として、COS-7細胞をサプリメント添加DMEM中で37 °C、5% CO2にて培養します。トランスフェクションの前日に、6ウェルプレート内の丸型24 mmガラスカバースリップ上に3 × 10⁵ 個の細胞を播種します。メーカーの指示に従い、jet PEIシステムを用いて細胞にトランスフェクションを行います。ここでは、jet PEIとDNAの比率を2:1として使用します。これにより、通常70から80%のトランスフェクション効率が得られます。イメージングを行うまで、細胞を37°C、5% CO2条件下で24時間維持します。次に、ピンセットを使用して、トランスフェクトした細胞が載ったカバーガラスをイメージングチャンバーに移します。残りの細胞を保存するため、組織培養皿をインキュベーターに戻します。電子顕微鏡による超微細構造解析を行う場合、またはライブセルイメージングを行う場合は、スチール製セルカルチャーチャンバーにイメージング培地を2 mL加えます。サンプルの光退色を防ぐため、イメージン

visualization-of-endoplasmic-reticulum-subdomains-in-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、哺乳類の組織培養細胞に小胞体関連mRNAを可視化する方法を説明します。この手法は、蛍光灯に続く細胞質の内容を削除するジギトニンと形質膜の選択的透過性上昇を伴う...

哺乳動物細胞における小胞体ローカライズされたmRNAの可視化

クラスリン媒介性エンドサイトーシスは、シグナル伝達受容体を含む多くのタンパク質を内部化する急速で非常に動的なプロセスです。ここで説明するプロトコルは、個々のエンドサイトーシスイベントの動態を直接視覚化します。これは、エンドサイトーシス機構のコアメンバーがどのように互いに協調し、タンパク質カーゴがこのプロセスにどのように影響するかを理解するために不可欠です。...

TIRF顕微鏡を経由してシングルイベント解像度のGタンパク質共役型受容体のクラスリン依存性エンドサイトーシスの可視化

ここでは、固定された細胞内小胞体とミトコンドリアの間に内因性の相互作用を視覚化し、高感度で定量化するための手順について説明します。プロトコルは、ミトコンドリア関連膜界面での75 /電位依存性アニオンチャネル/シクロフィリンD複合体イノシトール1,4,5-三リン酸受容体/グルコース調節タンパク質を標的と現場での近接連結アッセイに最適化されています。...

小胞体とミトコンドリアの相互作用の研究によって、<em&gt;その場で</em固定された細胞における&gt;近接ライゲーションアッセイ

pH感受性蛍光体で膜タンパク質の細胞外ドメインをラベリング、superecliptic pHluorin（SEP）は、細胞内局在、発現、および人身売買を決定することができます。全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）の撮像SEP-標識されたタンパク質は、末梢ERおよび原形質膜中のタンパク質レベルの定量化を可能にします。...

細胞内局在や人身売買を監視するpHluorinタグ付き受容体を利用します

我々は、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ2およびワサビペキシダーゼ染色を含む相関光および体積電子顕微鏡を用いて遺伝子改変後の全細胞におけるミトコンドリアおよび小和性網膜の分布を研究するためのプロトコルを提示し、同じセクション内の標的遺伝子の有無にかかわらず細胞のシリアル断面、および電子顕微鏡によるシリアルイメージング。...

相関光と体積電子顕微鏡によるミトコンドリアと小体網膜イメージング

肝臓または他の組織の細胞から肝細胞細胞小器官間の膜接触部位の三次元的詳細を取得するための簡単で包括的なプロトコル。...

連続部電子顕微鏡を用いた肝細胞細胞内細胞小器官間接触部位の3次元特性評価

本プロトコルは、量子ドットを用いて心臓組織切片中のタンパク質を免疫標識する方法を記載する。この技術は、あらゆるタンパク質の細胞内局在と発現を微細構造レベルで視覚化するための有用なツールを提供します。...

量子ドットを介した免疫標識とそれに続く透過型電子顕微鏡法を用いた心臓におけるタンパク質の細胞内局在の可視化(英語)

膜接触部位(MCS)を研究するための新しいアプローチの必要性は、これらの細胞構造とその構成要素の研究への関心の高まりにより高まっています。ここでは、MCSに存在するオルガネラ内およびオルガネラ間タンパク質複合体を同定および定量するために、以前に利用可能であった顕微鏡技術を統合したプロトコルを紹介します。...

近接ライゲーションアッセイによるER-ミトコンドリア接触部位における内因性オルガネラ内タンパク質相互作用の可視化と定量

ここでは、細胞の超微細構造に関連する希少タンパク質の局在を調査するためのツールとして、内因性蛍光標識に基づく最適化されたオンセクション相関光電子顕微鏡法のプロトコルを紹介します。このアプローチの威力は、バフィロマイシン処理を行わない飢餓細胞における内因性LC3の超微細構造局在によって実証されています。...

オンセクション相関光電子顕微鏡による内因性LC3の超微細構造局在

培養中の細胞の数を決定することは培​​養条件の標準化と正確な定量実験を行う際に重要です。このビデオでは、我々は、細胞を血球計を使用してカウントしている方法を示しています。...

カウントと培養細胞の生存率の決定

学ぶ 培養細胞における小胞体サブドメインの可視化手法。GFP標識タンパク質を用いた共焦点顕微鏡とFRAP技術により、小胞体内のタンパク質動態と超微細構造変化を解析する方法を解説します。

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

さらに動画を探す