神経芽細胞の移行を検討するために、げっ歯類神経芽細胞のクレオインビトロ

この手順の全体的な目標は、標的タンパク質の移動に対する影響を調べるために、出生後の一次げっ歯類神経芽細胞をトランスフェクションすることです。これは、最初にげっ歯類のポップの吻側移動流から神経芽細胞を解剖することによって達成されます。第2のステップは、それらを解離させ、DNAまたはS-H-R-N-Aのいずれかと核の愛情によってトランスフェクションすることです。

次に、神経芽細胞を吊り下げ液滴に再凝集させ、懸濁液中で適切な時間培養します。最後のステップは、再凝集した神経芽細胞クラスターを3次元マトリックスに埋め込み、それらを移動させることです。最終的には、免疫蛍光顕微鏡またはタイムラプスイメージング顕微鏡法を使用して、神経芽細胞の移動を解析します。

この方法は、出生後の脳における幹細胞由来の神経芽細胞遊走の制御など、神経新生分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、困難で時間がかかる可能性のあるウイルスベクターの使用と比較して、比較的簡単で高速であることです。P 6からP 7のラットの同腹仔を犠牲にした後、各ラットにメスの刃を使用して、鼻から小脳までの中矢状縫合糸に沿って皮膚を後方に切開します。

次に、皮膚をはがし、頭蓋骨に沿って同じ切開を繰り返します。次に、鉗子で頭蓋フラップをそっと取り外し、へらで嗅球と一緒に脳を慎重に取り除きます。

その後、脳の最も甘えん坊の3分の1を切り取り、それを捨てます。続いて、ティッシュチョッパーを使用して脳組織を厚さ1.4ミリメートルの冠状スライスに切り刻みます。スライスを冷たい解剖媒体が入った皿に移します。

次に、解剖顕微鏡でスライスを表示します。針を使って慎重に分離します。吻側移動筋は、OBセクションの中央に三角形の半透明の領域として、また小さな円形の領域として現れます。

より甘えん坊の脳のスライスでは、周囲の組織が含まれないように注意しながら、顕微手術ナイフで各スライスからRMSを切り取ります。次に、プラスチック製のパスターピペットでRMSフラグメントを収集し、氷上の冷たい解剖培地を入れた小さな皿に入れます。次に、皿をゆっくりと回転させて、RMSの破片を皿の中央に集めます。

プラスチックピペットで破片を集め、15ミリリットルのチューブに移します。破片をチューブの底に沈殿させます。解剖媒体を2ミリリットルの解離媒体T triと交換します。

その後、P 1000ピペットを使用してフラグメント懸濁液を約10回静かに上下させて、RMSフラグメントを評価します。組織の破片が入ったチューブを摂氏37度の水浴に2分間放置します。その後、溶液を再度10回ピペットで交換し、フラグメントが解離したことを確認します。

次に、5ミリリットルの予めワーム化されたDMEMと10%FCSを添加してトリプシンを不活性化し、細胞懸濁液をGの433倍で5分間遠心分離します。余分な培地を取り除き、復活させます。細胞ペレットを1ミリリットルの予温DMEMと10%FCSで静かにピペッティングして懸濁し、さらに4ミリリットルの同じ培地を加えます。

次に、セルカウントを実行します。各核の愛情には、10から6番目の細胞の2.5倍以上が必要であり、その間、最適な結果が得られます。1核あたり6個の細胞に10倍から3倍から4倍をかけて愛情を込める。

細胞懸濁液をGの433倍で5分間遠心分離します。その後、この手順でできるだけ多くの媒体を取り除きます。直ちにResusは、細胞ペレットを以前にインキュベートしたラットニューロン核愛情溶液に懸濁する。

室温で、細胞懸濁液100マイクロリットルをSI R-N-A-D-N-Aを含む各EORチューブに移します。その後、P 200ピペットで2〜3回ピペッティングして穏やかに混合します。次に、気泡が発生しないように注意しながら、核の愛情獣医の底にサンプルを追加します。

核愛情には、ラット細胞にはプログラムG dash 0 1 3を、マウス細胞にはO dash 0 0 5を使用します。その後、戦前のDMEM1ミリリットルと10%FCSを核の影響を受けたサンプルにすばやく追加します。核愛情キットに付属のプラスチックピペットを使用して、サンプルを戦前のDMEM5ミリリットルと10%FCSを含む15ミリリットルのチューブに移します。

次に、サンプルをGの433倍で5分間遠心分離します。余分な培地をすべて慎重に取り除き、P 20ピペットを使用して、戦前のDMEMと10%FCSの25〜30マイクロリットルにペレットを再懸濁します。30マイクロリットルを超える媒体は使用しないでください。

その後、懸濁液をP35ディッシュ蓋の内側に滴としてピペットで移します。次に、2ミリリットルの完全培地が入ったP35ディッシュの蓋を裏返します。5%二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターに少なくとも5時間放置します。

5時間後、蓋から吊り下げた滴を皿内の完全な培地に移します。先端がカットされたP 1000ピペットを使用。次に、DNA NU核感染の場合は24時間、SI A HRA核の愛情については48時間、5%二酸化炭素と摂氏37度でサンプルをインキュベートします。

次に、25ミリリットルの完全培地を準備し、摂氏37度で5%の二酸化炭素で数時間平衡化します。その間に、基底膜マトリックスの凍結アリコートをマイナス80°Cの冷凍庫から取り出し、冷蔵室の氷上で解凍します。各核の愛情について、最大8枚の13ミリメートル滅菌カバースリップを含む6センチメートルの皿を準備します。

ラップフィルムで覆われたアイスボックスに皿を置きます。湿度を保つために、湿ったティッシュのストリップを15センチの皿の中に入れ、膝に埋め込まれた州を含む最大3つの6センチメートルの皿を保持するために使用されます。次に、完全な培地をホーマトリックスに1対3の比率で加え、再凝集した細胞クラスターを15ミリリットルのチューブに移し、Gの433倍で5分間遠心分離します。

その後、余分な媒体を取り出し、パレットを10マイクロリットルの完全な媒体に再懸濁します。次に、2マイクロリットルの細胞凝集懸濁液を各滅菌カバースリップに置きます。18マイクロリットルのマトリックス完全培地混合物を加え、ピペットチップを使用してマトリックスをカバー全体に広げます。

カバースリップが入った6センチ皿を15センチ皿に置いた直後に滑り込ませます。皿を摂氏37度でインキュベーターに5%二酸化炭素で15〜20分間移します。マトリックスが固まったら、5ミリリットルの完全培地を各6cmの皿に静かに加え、浮遊するカバースリップをピペットチップで押し下げ、摂氏37度で5%カルボゲンと24時間インキュベートして、神経芽細胞が細胞凝集体から移動できるようにします。

この図では、単離されたラットRMS細胞は、遊走性神経芽細胞マーカーDCXおよびβ 3チューブリンに対して免疫陽性であることが示されています。そして、この図は、マウスから移動する細胞で遊走性神経芽細胞マーカーDCXとPSA NCAが発現していることを示しています。マウスNeuroblast Nu核の愛情、解離マウスRMS Neuroblastの核は、3次元マトリックスに埋め込まれたGFP再凝集で影響を受けた核を6時間移動させました。

再凝集した細胞クラスターから移動する神経芽細胞は、高いトランスフェクション効率を示します。ここでは、ラット神経芽細胞を、GFPをコードする2つの異なるプラスミドで影響を受け、マトリックスに埋め込まれ、24時間遊走させました。次に、細胞を固定し、GFPおよびβ 3チューブリンの免疫染色を行い、移動距離を測定しました。

集約されたセル クラスターは 6 つの等しいセクターに分割され、クラスターのエッジと最も遠くに移動されたセルとの間の距離がセクターごとに測定されます。この図は、GFP陽性の核影響を受けた細胞によって移動した相対距離の定量化を示し、神経芽細胞の移動を監視するためにGFP陰性の非核の影響を受けた細胞を制御しています。S-H-R-N-A Nucle affection ラット神経芽細胞を、コントロールS-H-R-N-AベクターまたはHRNAターゲットファステンおよびアクチンバンディングタンパク質細胞を含む同じベクターで核に罹患させた後、48時間かけて再凝集し、マトリックスに包埋し、24時間遊走させた。

次に、凝集体を固定し、GFPおよびβ-3チューブリンの免疫染色を行いました。ウェスタン血液分析によるS-H-R-N-A核の愛情の50時間後に有効な留め具の枯渇を検出することができ、ここではローディングコントロールとしてActonが示されています。これは、相対的な移動距離の定量的分析であり、固定された枯渇が神経芽細胞の移動を著しく損なうことを示しています。

この手順に続いて、出生後のエレクトロポレーションなどの他の方法を実行して、NU Nuclear Affection migration assayで得られた結果をin vivoで検証できます。