Name: 神経芽細胞の移行を検討するために、げっ歯類神経芽細胞のクレオインビトロ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 学ぶ げっ歯類神経芽細胞のヌクレオフェクションと3D移行アッセイを用いた神経芽細胞移行の検討法。DNA/shRNA導入により標的タンパク質の影響を解析し、産後神経発生のメカニズム解明に貢献します。

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この作品は、PDとGLに授与ウェルカムトラストプロジェクト無償（089236/Z/09/Z）によって賄われていた。 SGがバイオテクノロジー·生物科学研究評議会の博士課程の学生の身分によってサポートされていました。私たちは、神経芽細胞クレオについて貴重なアドバイスをshRNAベクターの種類のギフトのためのマチューVermerenとジェニファーShiehに感謝します。

この手順では、英国内務省の規制（動物科学手続法、1986）に準拠しています。科学者たちは、彼らの機関や国の動物規制機関によって確立され、承認されたガイドラインに従う必要があります。 1。切開およびラットのRMS神経芽細胞の解離<ol><li>実効解剖、解離のために必要なソリューションを準備します。 </li></ol> 解剖培地 （100ml）で ハンクス平衡塩溶液（HBSS） - 98.5ミリリットル 5男のHEPES 7.4〜0.5ミリリットル ペニシリン - ストレプトマイシン（10,000単位/ ml 10,000μg/ ml）を - 1ミリリットル 解離培地（2ml）に HBSS - 1.760ミリリットル 10倍のトリプシン（2.5％） - 200μL DNAse1（1 mg / ml）を - 40μL ダルベッコのイーグル培地（DMEM）+10％ウシ胎児血清（FCS）（40ml）に変形 DMEM中 -36ミリリットル FCS - 4ミリリットル 完全培地 （12ミリリットル） 神経基礎培地 - 11.46ミリリットル B27サプリメント - 250μL L-グルタミン（200 mM）の - 125μL グルコース（45％） - 165μlの 2。 DMEM + 10％FCS完全培地をフィルタリングし、滅菌し、37℃/ 5％CO 2インキュベーター内でそれらをpreequilibrate。 <ol><li>解剖<ol><li>頚椎脱臼により、P6-P7ラットのトイレ（約12匹）を犠牲にしてはさみで首を切る。 </li><li>メスの刃と小脳に鼻から半ば矢状縫合に沿って皮膚内の前後の切開を加えます。皮をはがし頭蓋骨に沿って同じ切開を繰り返します。 </li><li>優しく鉗子で頭蓋フラップを取り外し、慎重に嗅球を含めるように注意しながら、へらで脳を削除します。 </li><li>脳の大部分の尾三分の一をカットして捨てる。 </li><li>目のチョップ組織チョッパーを用いて厚さ1.4mm冠状スライスに電子脳組織。 </li><li>冷たい解剖培地を含む皿の中でスライスを置き、慎重に針を使用して区切ります。 </li><li> RMSは、OB部分の中央にある三角形、半透明領域として、より尾側脳スライス内の小さな円形の領域として表示されます。周囲の組織を含めないように注意しながら、顕微ナイフで各スライスのうちRMSをカット。 P7の仔ラットでは、通常、（OB含む）〜8最も頭側のスライスは、RMSが含まれています。 </li><li>プラスチック製パスツールピペットで、RMS断片を収集し、氷上で冷たい解剖培地を含む小皿に配置します。 </li><li>切開が完了したら、プラスチックピペットにて15mlチューブにRMSフラグメントを転送する。チューブの底に沈降する断片のままにしておきます。 </li></ol></li><li>解離<ol><li>解離培地2mlで解剖培地を交換してください。 </li><li>優しくpで、RMS断片を粉砕するフラグメント·サスペンションアップipetting約10倍P1000ピペットを使用してダウン。 </li><li> 2分間37℃の水浴中で組織片をチューブのままにしておきます。 </li><li> 10倍再びソリューションをピペット断片は（懸濁液は白濁します）解離していることを確認してください。 </li><li>予め温めておいたDMEM + 10％FCSを5mlを添加することによりトリプシンを不活性化する。 </li><li> 5分間433×gで細胞懸濁液を遠心分離する。 </li><li>エッペンドルフチュー​​ブにそれまでの一定分量のsiRNA / DNAの必要量（通常3〜5μgのDNAを/ shRNAのか、ヌクレオあたり5-9μgのsiRNAオリゴは、しかし、DNA / siRNAの量が最適化が必要な場合があります）。 </li><li>余分な培地を除去し、あらかじめ温めておいたDMEM +10％FCSを5mlに穏やかなピペッティングにより細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>細胞数を実行します。ラットの仔の脳あたり〜1×10 6の細胞を期待しています。ながら、2.5×10 6個の細胞の最小は、各クレオのために必要とされる最適な結果はヌクレオにつき3〜4×10 6個の細胞を使用して達成している。 </li><li> 5分間433×gで細胞懸濁液を遠心分離する。 できるだけ多くのメディアを削除してください。 </li></ol></li></ol> 2。クレオ<ol><li>予め室温でインキュベートしたニューロンクレオ溶液（マウス細胞を用いた場合はマウス） を直ちにラットに細胞ペレットを再懸濁する。クレオあたり100μlを使用してください ：。典型的には12匹のラットのごみは4 nucleofectionsを実行するのに十分であり、マウスのトイレ（12匹）が2 nucleofectionsを実行するのに十分である。 </li><li> siRNAを/ DNAを含む各エッペンドルフチュー​​ブに細胞懸濁液100μlを転送し、P200ピペットでピペッティングにより穏やかに2〜3倍を混ぜる。 </li><li>気泡を避けるように注意しながら、nucleofectioncuvetteの底にサンプル（cell-DNA/siRNAサスペンション）を追加します。 </li><li>プログラムのG-013（ラット細胞の場合）またはO-005を使用してNucleofect（用マウス細胞）。一ヌクレオは約5秒かかります。 </li><li>すぐにヌクレオフェクトサンプルに予熱DMEM +10％FCSの1ミリリットルを加える。 </li><li>繰り返しは、他のすべての試料について2.4と2.5を繰り返します。注：最適な結果を得るために、全体のヌクレオ手続きはもう5分以上持続してはならない。 </li><li>クレオキットが提供するプラスチック製のピペットを用いて、あらかじめ温めておいたDMEM +10％FCSの5ミリリットルを含む15mlチューブに各サンプルを転送します。チューブに任意の細胞片を転送することは避けてください。 </li><li> 5分間433×gで遠心分離サンプル。 </li><li>慎重にすべての余分な培地を除去し、P20ピペットを用いてあらかじめ温めておいたDMEM +10％FCSの25〜30μlのペレットを再懸濁。培地の30以上の液を使用しないでください。 </li><li> P35ディッシュのふたの内側に落下などの懸濁液をピペットで。 </li><li> （ 図1も参照）完全培地の2ミリリットルを含むP35皿の上で蓋を反転します。 </li><li>でインキュベーター（37℃/ 5％CO 2）で残して少なくとも5時間と7時間まで。より長いインキュベーション時間は、細胞クラスターのより良好な再凝集を可能にする。 </li><li>カットチップでP1000ピペットを用いて皿の中の完全培地に蓋から吊り滴を転送します。 </li><li>のDNA nucleofectionsおよびsiRNA / shRNAののnucleofectionsのため48時間、24時間、37℃/ 5％CO 2でインキュベートする。 </li></ol> 3。埋め込み<ol><li> （25ミリリットル）の完全培地を用意し、数時間、37℃/ 5％CO 2でそれをpreequilibrate。 </li><li> -80℃の冷凍庫から基底膜マトリックスの凍結アリコートを取り出して、低温室で、氷上で解凍する。 </li><li>それぞれが8 13ミリメートル無菌coverlipsまで含む6cmディッシュを用意クレオため。 </li><li>密着フィルムで覆われたアイスボックスにお皿を置きます。これは、埋め込み手順中にマトリックスの凝固を防ぐために冷却し、カバースリップを維持することが重要である。 </li><li>湿度を維持するために、15cmの皿の内側湿った組織のストリップを配置し、その付病気埋め込ま神経芽細胞を含む3つの6cmのディッシュまで保持するために使用される。 </li><li> 1:3の比で解凍行列に完全培地を追加します。例えば、ピペッティングすることにより、マトリックスの120μlの完全培地を40μlを混合します。マトリックスのこの量は、8つの12mmのカバーガラス上で凝集体を埋め込むために十分である。 </li><li>で15mlチューブと遠心分離機に再凝集細胞クラスターを転送 5分間433×gで。 </li><li>余分な培地を除去し、完全培地10μlのペレットを再懸濁します。 </li><li>各無菌カバーガラス上に細胞凝集体懸濁液の2液を置き、マトリックス/完全培地混合物の18μlを加える。全体カバースリップの上に行列を広めるためにピペットチップを使用してください。 </li><li>すぐに15〜20分間15cmの皿にカバースリップを含有する6cmディッシュを配置し、インキュベーター内で残す（37℃/ 5％CO 2）。行列が固化したら、そっと押しに注意しながら、各6cmディッシュに5ミリリットルの完全培地を追加ピペットチップで浮動カバースリップダウン。 </li><li>神経芽細胞が細胞凝集体の外へ移動させるために37℃/ 5％CO 2で24時間インキュベートする。 </li></ol> 4。 3D移動アッセイ<ol><li>免疫染色に必要な溶液を調製する。 <ol><li>ブロック溶液を準備します。 ヤギブロック溶液（50ml） リン酸緩衝生理食塩水（PBS） - 5ミリリットル ヤギ血清 - 7.5ミリリットル 10％のトリトンX-100〜1.5ミリリットル BSA - 50 mgの H 2 O - 36ミリリットル</li><li> 4℃でのフィルターと店舗</li><li>定着液を準備します。 （100ml）中溶液を固定する ホルムアルデヒド（PFA） - 4グラム注意：必ずボンネットの下に、PFAを処理 ショ糖 - 20グラム（オプション） 100ミリリットルまでのPBS </li><li>ホットプレート上で、一定の攪拌下では80ミリリットルで、PFAを溶解PBSを65℃に維持</li><li> PFAが溶解したら、ショ糖20グラムを加える。 </li><li> pHを調節する7.4（通常、溶液100ml当たり〜60μlの1 M NaOHを添加することによって）。 </li><li> PBSで100ミリリットルの全量をもたらす。 </li></ol></li><li>免疫染色<ol><li> 24穴プレートにカバースリップを置きます。 </li><li> PBSで2倍にカバースリップを洗浄します。 </li><li>室温で45分間溶液を固定して、RMSの神経芽細胞の凝集体を固定します。 </li><li> PBS 3X（ - ロッキングプラットフォーム上で5分/洗浄）でカバースリップを洗浄します。 </li><li>ヤギブロック溶液で30〜60分間ブロックします。 </li><li>ヤギブロック溶液中で一次抗体を希釈し、4℃で一晩インキュベート（所望であれば、蛍光ファロイジン（1:400）およびヘキスト色素（1:10,000）は、繊維状アクチンおよび核を視覚化するために、一次抗体溶液に添加することができる）。 </li><li> PBS 3X（5分/洗浄）でカバーグラスを洗浄します。 </li><li>ヤギブロック溶液中で二次抗体を希釈し、室温で2時間インキュベートする。 </li><li> coversliすすぐPBSで3倍とPS（5分/洗浄） </li><li>マウントは、蛍光封入剤でカバースリップし、室温で一晩乾燥さのままにしておきます。 </li></ol></li><li>移行解析<ol><li> 10倍の対物レンズを使用して蛍光顕微鏡で固定したRMS神経芽細胞凝集体の画像をキャプチャする。サンプル画像中のスケールバーがあります。 </li><li>定量化のためのスケールを設定するには、ImageJのツールバーの「直線」ツールを選択することにより、画像中のスケールバーを測定します。 </li><li> 「分析」オプションを選択し、「スケールを設定」をクリックしてください。 </li><li>スケールウィンドウに「既知の距離」を設定し、すべての測定に対して同じ設定を保持するために「グローバル」ボックスをチェック。 </li><li>全体集計（ 図3B）周りの6つの分野での最も遠い移行神経芽細胞に骨材の端からの距離を測定するために、ImageJのツールバーの「折れ線」ツールを使用します。唯一の孤立AGを検討分析用gregates。 </li><li>各集計のために取得した6つの値の平均移動距離を計算します。 </li><li> 3つの独立した実験の最小値からのすべての独立した実験やプール結果に各条件のため10月20日集計を測定します。常にヌクレオ制御（ 例えば 。GFPまたは制御SH / siRNA）を挙げることができる。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

OBの最後の場所に、RMSに沿って神経芽細胞の移動は出生後の神経発生における基本的なステップです。しかし、この複雑なプロセスを制御する分子メカニズムは完全には理解されているから遠く離れている。 ここに記載の実験方法は、in vitroでの神経芽細胞の遊走の研究を可能にする。私たちは、生後初期のマウスまたはラット25からのRMSの神経芽細胞を単離するために以前に発表されたプロトコルを適応している。それが最小の切開およびヌクレオの間の時間間隔を維持するために重要であるので、最適な結果を達成するためには、切開工程を習得することが重要である。ヌクレオ後、神経芽細胞は、再凝集することができる三次元マトリックスに埋め込まれ、24時間かけて移行しておいた。あるいは、移動（ 例えば、免疫蛍光またはウエスタンブロット分析）以外の目的のために、細胞は直ちにpolyornithine/laminin-上のヌクレオ後にメッキすることができる彼らは4〜5日以内に生き残るコートしたカバーガラス、。マウスとラットの神経芽細胞が同程度にマトリゲルに移行し、しかし、マウスの細胞はラットの細胞よりもチェーンに移行する強い傾向を持っているように見えます。 研究の目的に応じて、神経芽細胞は、蛍光タンパク質や、興味のある野生型/変異型タンパク質をコードする別のプラスミドでヌクレオフェクトすることができます。 CAGプロモーター（CMVエンハンサーとβ-グロビンポリAテールを有するβ-アクチンプロモーター）26との最適なタンパク質発現プラスミドのために強く推奨されています。また、siRNAオリゴまたはshRNAプラスミドは、関心対象の標的をノックダウンするヌクレオフェクトすることができる。効果的なタンパク質の枯渇は、（通常、標準的な溶解緩衝液50μlで1ラットの仔から埋め込まれた凝集体を溶解する）、免疫蛍光、またはウェスタンブロットによって可視化することができる。 クレオは、主要な神経芽細胞をトランスフェクトするために比較的簡単な方法であるVIを簡単かつ迅速に代替手段を提供しています梅毒ベクター媒介トランスフェクション、および高い（〜70-80％）トランスフェクション効率を達成することができる。それは劇的に細胞の生存率を減少させ長時間にわたってクレオ液に神経芽を残しているため、クレオ手順中に迅速に作業することが重要です。 RMS切開からの平均細胞収率は、P7ラット（〜1×10 6細胞/脳）と比較して、P7マウス（〜5×10 5細胞/脳）が比較的低く、ヌクレオ当たり少なくとも3×10 6個の細胞が必要とされる約 50％の効率でトランスフェクションを達成する。また、ラットの神経芽細胞は、マウス神経芽細胞と比較したヌクレオ方が良いに抵抗するようである。そのため、初期の出生後（P6-P7）仔ラットは、ラットやマウスのRMSの組織は著しくシミであることを考慮すると、便利な神経芽細胞の供給源である可能性がありますLAR 27とin vitroでのラットおよびマウス神経芽細胞遊走の程度にも匹敵する。これは、細胞形態およびマイグレーション（私たちの未発表の観察）に異常な影響を回避するために、48時間よりも長い間、懸濁液中ヌクレオフェクト神経芽細胞の再凝集クラスターを維持することではないことをお勧めします。 ここで説明した3Dアッセイは、マトリックス中に埋め込 ​​んだ後、一定時間の時点で神経芽細胞遊走を定量化するために使用することができる（ 例えば、24時間）。凝集体の大きさや移動距離（我々の未発表の観察）との間に有意な相関がないので、異なるサイズの凝集物は、分析に使用することができる。視覚化し、さらに神経芽細胞遊走の動態を調べるために、タイムラプス撮影を使用することができる。これは、神経芽細胞の速度が大幅に長くなるの時点で（私たちの未発表の観察）を減少させるために表示されますので、埋め込んだ後、24時間間隔内に移行解析を行うことをお勧めします。&lt;/ pの&gt; このプロトコルにはいくつかの制限があります。ウイルスベクターによる感染は、成体神経芽28のための最も効率的なトランスフェクション法まままず、ヌクレオはこれまでのところ、早期の出生後の齧歯類の神経芽細胞のために使用することができる。第二に、in vitroでの遊走アッセイは、完全に生体内で観察されたRMSの複雑なアーキテクチャを再現していません。神経芽細胞は、それらのインビボ対応物と同様に移行する能力を維持するが、実際、ここで説明する実験では、それらは、また、それらの運動性9,29を調節するために貢献するような星状細胞および血管などの他のRMS成分との相互作用を欠いている30。この問題は、三次元共培養モデル系の最適化により、将来的に対処することができる。 結論として、3次元移動アッセイでクレオを組み合わせた、より良い基礎となる分子メカニズムを理解するための貴重なツールを表します神経芽細胞の遊走。この実験的な手順では、さらに、生体内出生後のエレクトロポレーションおよび脳スライス培養のタイムラプスイメージングのような他の手法で検証できる神経芽細胞の遊走の候補調節因子の役割を評価するために、初期の迅速かつ比較的簡単な方法を提供し、28,31,32 。

新しいニューロン（神経新生）の出生後の哺乳動物の脳、世代では生涯を通じて発生し、2神経性のニッチに限定されている。側脳室の脳室下帯（SVZ）および海馬1の歯状回の下帯。いくつかの最近の研究は、学習および記憶タスクの2,3を促進する成体神経新生の重要な役割を示している。また、脳損傷4-7次の神経前駆細胞の増殖および募集の証拠は、神経修復における神経新生の薬理活性化の可能性を高める。 出生後の神経発生、神経前駆細胞の増殖、遊走、分化、生存、そして新たに生まれた神経細胞8の最終的なシナプスの統合が含まれ、そのすべての段階において、厳密に調節されている。 SVZ幹細胞由来の神経前駆細胞（神経芽細胞）は​​吻側遊走を介して大きな距離にわたって移行彼らは機能的ニューロン9に成熟嗅球（OB）に向かって流れ（RMS）。渡り鳥神経芽細胞は、単一のリーディング·プロセスを延びる細長い細胞体で、主に単極性である。これらの細胞は互いに10上をスライド、一括してチェーンに移動します。移行が機能的ニューロン11にSVZ由来の前駆細胞のその後の成熟に重要なステップであり、などの複数の要因やガイダンス分子によって制御されます。ポリシアリル神経細胞接着分子（PSA-NCAM）12、エフリン13は、14のインテグリン、スリット15、成長は16を要因と17の神経伝達物質、しかし、このプロセスの基礎となる分子メカニズムは完全には理解されていない。神経芽細胞遊走を調節する細胞内シグナル伝達経路を調査することは、成体の神経発生のより良い理解を提供するだけでなく、新たな治療の開発に貢献する脳の修復を促進するために近づく。 この原稿は、ヌクレオと3D移動アッセイを用いてインビトロで神経芽細胞の遊走の候補調節因子の役割を研究するための詳細なプロトコルについて説明します。ヌクレオは、エレクトロポレーションの改良された方法に基づいて、細胞トランスフェクション技術である。細胞型特異的電流およびヌクレオソリューションは、このような直接ゆっくり胚および哺乳動物の神経細胞18のような非アクティブセルを分割するか、有糸分裂の細胞核と許可クションへのDNAとのshRNAベクター及びsiRNAオリゴヌクレオチドなどのポリアニオン性高分子の転送を可能にする。この方法は、高速で実行するのが比較的容易で、一次神経芽細胞およびニューロン19-21を含む細胞型の広い範囲の再現性の高いトランスフェクションの結果である。 RMS組織の解離は、渡り鳥神経芽細胞の単離を可能にする成功したDNA / SHRでヌクレオフェクトでき​​るNAベクトルまたは関心のある遺伝子を標的siRNAオリゴ。クレオに続いて、神経芽細胞は、ドロップをぶら下げに再凝集され、その後、3次元マトリゲルマトリックス中に埋め込ま。これらの条件は、このようにして神経芽細胞遊走に関与するシグナル伝達経路を調査するために、これらの細胞の運動性に対する薬理学的治療の影響を評価するための優れたモデル系を提供すること、神経芽細胞がin vivoで観察された移行モードをrecapitulating細胞凝集物から移動することを可能にする。

<table><tbody><tr><td>ハンクBalanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>14175129</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Trypsin-EDTA (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>store 200 &micro;-20°Cのlアリコート。C</td></tr><tr><td>DNAse I バイアル (D2)</td><td>ワージントン</td><td>LK003170</td><td>&ge;バイアルあたり1,000ユニット。ストア50&マイクロ;-20°Cのlアリコート。C</td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清 (FCS)</td><td>Hyclone</td><td>SH3007902</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース溶液 (45%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル基底膜マトリックス、成長因子還元 (GFR)、フェノールレッドフリー、10 ml、LDEV-Free</td><td>BD Biosciences 356231</td><td></td><td>120 &micro;l 4 &deg;C、次に-80°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441242</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>BDH</td><td>102745C</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR International Ltd.</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>BSA フィ</td><td>ッシャーケミカル</td><td>BPE9701-100</td><td></td></tr><tr><td>Dako 蛍光実装媒体</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>ラットニューロン核形成キット</td><td>ロンザ</td><td>VPG-1003</td><td></td></tr><tr><td>マウスニューロン核形成キット</td><td>ロンザ</td><td>VPG-1001</td><td></td></tr><tr><td>顕微手術ナイフ</td><td>アンジオテック</td><td>7516</td><td></td></tr><tr><td>マキルウェイン組織用粉砕機</td><td>The Mickle Laboratory Engineering Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

神経芽細胞の移行を検討するために、げっ歯類神経芽細胞のクレオ<em&gt;インビトロ</em

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

側脳室の側壁に位置する脳室下帯（SVZ）は、成人の神経発生における基本的な役割を果たしている。脳のこの制限された領域では、神経幹細胞が増殖し、常に嗅球（OB）に到達するために吻側渡り鳥ストリーム（RMS）に沿ってチェーンに接線方向に移動する神経芽細胞を生成する。かつてのOBには、神経芽細胞は、放射状の移行に切り替えてから、既存の神経回路網に組み込むことができる成熟した神経細胞に分化する。適切な神経芽細胞の遊走は、新生ニューロンの正しい機能的成熟を確保し、神経発生における基本的なステップです。彼らの運動の基礎となる細胞内のメカニズムを調査して、脳内で負傷した領域を対象とするSVZ由来の神経芽細胞の能力を与えられた神経発生の理解を強化するだけでなく、神経再生戦略の開発を促進することができる。 この原稿は、詳細を説明します原発齧歯類RMS出生後の神経芽細胞や生体内で観察された移行の彼らのモードをrecapitulating 3D in vitroでの遊走アッセイを使用して運動性の解析のトランスフェクションのためのプロトコル。両方のラットおよびマウス神経芽細胞を迅速かつ効率的に、プラスミドDNA、低分子ヘアピン（shの）RNA又は短い干渉（SI）関心対象の遺伝子を標的RNAオリゴヌクレオ介してのいずれかでトランスフェクトすることができる。移行を分析するには、ヌクレオフェクト細胞は「懸滴」で再凝集させ、その後、3次元マトリクス状に埋め込まれている。クレオ自体が大幅に神経芽細胞の遊走を阻害しない。ヌクレオフェクトし、再凝集神経芽細胞の薬理学的治療は、神経芽細胞遊走に関与するシグナル伝達経路の役割を研究するために行うことができる。

神経芽細胞は、正常解剖RMS組織（ 図1A）から単離し、三次元マトリックスに埋め込 ​​むことができる。ラットやマウスの出生後の実効値のいずれかから単離された細胞は、ダブルコルチン（DCX）、βIIIチューブリンまたはPSA-NCAM（ 図1B-C）などの渡り鳥神経芽細胞マーカーのために免疫陽性である。 解離した神経芽細胞が効率的にウェスタンブロット分析（ 図4B）、または免疫蛍光によって評価することができるタンパク質の枯渇を達成するためにDNA（ 例えば、。GFPをコードするプラスミドを、図2）またはshRNAプラスミド（ 図4）でヌクレオフェクトすることができる（図示せず） 。 GFPをコードするプラスミドでヌクレオフェクト細胞が再凝集した神経芽細胞クラスター（ 図3A）から放射状に移行します。相対移行された距離の定量24時間後埋め込 ​​み（ 図3B）は 、GFP-POSIT間での移行に差を示さない<html> IVE細胞とGFP陰性、nonnucleofected細胞（ 図3C）、ヌクレオ自体が移行を破壊しないことを示している。直接的RMS植片（データは示していない）から移動ヌクレオフェクト神経芽細胞及び神経芽細胞との間の移動の程度に有意な差は存在しない。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig1.jpg" width="500px" /> 図1。実効神経芽細胞の解剖。 （A）のRMS神経芽細胞解離の模式図。詳細についてはテキストを参照してください。 （B）単離したラットのRMS細胞は神経芽細胞の遊走メーカーDCXおよびβIIIチューブチューブリンに対して免疫である。マウスのRMS外植片から移動バーは20μm。（C）細胞は、渡り鳥神経芽細胞マーカーDCXおよびPSA-NCAMを発現する。バーは20μm。0989/50989fig1highres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 <img alt="図2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig2.jpg" width="500px" /> 図2。マウス神経芽クレオ。解離マウスのRMS 神経芽細胞は、PMAX-GFPでヌクレオフェクト再凝集させ、三次元マトリックスに包埋し、6時間遊走させた。再凝集セルクラスタのうちの移行神経芽細胞（上、位相コントラストの写真）は、高いトランスフェクション効率（下、GFPチャネル画像）を示す。右の列のパネルは、左の列のパネルでハイライトインセットに対応した高倍率の写真を示しています。バー、20ミクロンは。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:c<html> ontent幅= &quot;6インチ&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig3.jpg&quot;幅= &quot;500px&quot; /&gt; 図3。 3D移動アッセイ。 （A）ラット神経芽がPMAX-GFP（GFP）またはのpCAG-IRES-EGFP 22（EV）をヌクレオフェクトし、再凝集マトリックスに埋め込 ​​まれており、24時間遊走さ残しました。次に、細胞をGFP（緑色）およびβIIIチューブリン（赤）のために固定し、免疫染色した。バーは50μm。（B）のImageJを使用して移動距離を測定する。再凝集細胞クラスターは6に等しいセクタに分割されている。クラスタ（点線）と遠いマイグレーションセルのエッジとの間の距離は、各セクタ毎に測定される。相対距離の（C）の定量化は、細胞ヌクレオフェクトによって移行（GFP陽性）および対照、nonnucleofected細胞（GFP陰性） 。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="&lt;/ HTML">FO「図4」：コンテンツ幅= SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg&quot;幅 &quot;6インチ&quot; = &quot;500px&quot; /&gt; 図4。のshRNAヌクレオ後の神経芽細胞の遊走を監視する。 （A）ラット神経芽細胞は、（また、EGFP 23を表現PCA-B-EGFPm5サイレンサー3）コントロールshRNAベクターまたはshRNAがファシン対象に、アクチンバンドリングタンパク質24を含む同じベクターでヌクレオフェクトた。細胞を、48時間かけて再凝集マトリックス中に包埋し、24時間遊走させた。骨材は、その後、GFP（緑色）およびβIIIチューブリン（赤）のために固定し、免疫染色した。バーは50μm。（b）有効ファシン 枯渇は、ウェスタンブロット分析によってのshRNAヌクレオ後50時間後に検出することができる。アクチンは、ローディングコントロールとして示されている（C）ファシン枯渇が大幅に神経芽細胞の遊走損なうことを示す相対的な移動距離の定量分析。（平均±SEM; ** P &lt;0.01、n = 3の独立した実験）。 <aHREF = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig4highres.jpg&quot;ターゲット= &quot;_blank&quot;&gt;拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

神経芽細胞の遊走は、出生後の神経新生に重要なステップです。プロトコルは、ここに記載DNA /低分子ヘアピンRNA（shRNAは）ヌクレオおよびげっ歯類生後吻側遊走性流から単離された神経芽細胞を用いた3次元遊走アッセイを用いることにより、神経芽細胞遊走の候補調節因子の役割を調査するために使用することができる。

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

この手順の全体的な目的は、一次培養したげっ歯類出生後ニューロブラストにトランスフェクションを行い、標的タンパク質がそれらの遊走に及ぼす影響を調べることです。これは、まずげっ歯類の吻側移行流からニューロブラストを解剖し、分離することによって達成されます。次のステップでは、それらを分散させ、DNAまたはshRNAを用いた核酸導入法（ヌクレオフェクション）によってトランスフェクションを行います。次に、神経芽細胞をハンギングドロップ法で再凝集させ、その後、適切な時間だけ懸濁培養します。最終ステップとして、再凝集した神経芽細胞クラスターを3次元マトリックスに包埋し、遊走させます。最終的に、免疫蛍光染色またはタイムラプスイメージング顕微鏡を用いて、神経芽細胞の遊走を解析します。本手法は、出生後脳における幹細胞由来ニューロブラストの遊走制御など、神経発生分野における重要な課題を解明するのに役立ちます。本手法の主な利点は、困難で時間を要する場合があるウイルスベクターの使用と比較して、比較的簡単かつ迅速であることです。P6〜P7のラットの1腹から個体を取り出した後、各ラットの鼻から小脳まで、正中矢状縫合に沿ってメスで皮膚に後方切開を加えます。次に、皮膚を剥離します。頭蓋骨に沿って同様の切開を繰り返します。その後、ピンセットで頭蓋フラップを慎重に取り除き、スパチュラを用いて嗅球とともに脳を注意深く摘出します。その後、脳の最も尾側の3分の1を切り取り、廃棄します。続いて、組織チョッパーを用いて、脳組織を1.4 millimeter厚の冠状切片に切り分けます。切片を冷たい解剖用培地を入れたディッシュに移します。次に、解剖顕微鏡下で切片を観察します。針を用いて慎重に分離してください。吻側移動流は、嗅球（OB）切片の中央にある三角形の半透明な領域、および小さな円形の領域として観察されます。さらに多くの脳切片を用いて、マイクロサージカルナイフで各切片からRMSを切り出します。この際、周囲の組織が含まれないように注意してください。次に、プラスチック製パスツールピペットでRMS断片を回収し、氷上の冷えた解剖用培地を入れた小型ディッシュに移します。その後、ディッシュをゆっくりと回転させ、RMS断片をディッシュの中央に集めます。プラスチックピペットで断片を回収し、15 milliliterチューブに移します。断片がチューブの底に沈殿するまで待ちます。解剖液を2 millilitersの解離液T triに交換します。その後、P 1000ピペットを用いて、断片懸濁液を10回ほど緩やかにピペッティングしてRMS断片を分散させます。組織断片が入ったチューブを37 °Cのウォーターバスに2分間置きます。続いて、再度10回ピペッティングを行い、断片が十分に解離していることを確認します。次に、あらかじめ加温した10% FCS含有DMEMを5 mL加えてトリプシンを不活化し、細胞懸濁液を433 ×gで5分間遠心分離します。上清を除去し、1 mLの加温済み10% FCS含有DMEMを用いて緩やかにピペッティングして細胞ペレットを再懸濁させ、さらに同培地を4 mL加えます。その後、細胞数を計測します。1回の核酸導入につき、最低2.5 × 10⁶個の細胞が必要ですが、最適な結果を得るには1回あたり3〜4 × 10⁶個の細胞を使用してください。細胞懸濁液を433 ×gで5分間遠心分離します。その後、この手順で可能な限り培地を除去します。直ちに、あらかじめインキュベートしておいたラット神経細胞核抽出用溶液で細胞ペレットを再懸濁します。室温で、SI R-N-A-D-N-Aを含む各EORチューブに細胞懸濁液を100 µLずつ分注します。次に、P 200ピペットを用いて2〜3回ピペッティングし、穏やかに混合します。続いて、気泡が発生しないように注意しながら、サンプルをニュークリフェクション用キュベットの底部に加えます。核酸導入には、ラット細胞の場合はプログラムG-013、マウス細胞の場合はO-005を使用してください。その後、核酸導入したサンプルに、あらかじめ温めておいた10% FCS添加DMEMを1 mL速やかに加えます。核酸導入キットに付属のプラスチックピペットを用いて、サンプルを5 mLのあらかじめ温めておいた10% FCS添加DMEMを含む15 mLチューブに移します。次に、サンプルを433 ×gで5分間遠心分離します。余剰な培地を慎重にすべて除き、P 20ピペットを用いて、ペレットを25〜30 µLの予温したDMEM（10% FCS添加）に再懸濁します。培地は30 µLを超えて使用しないでください。その後、懸濁液をP 35ディッシュの蓋の内側に一滴分分注します。次に、2 mLの完全培地が入ったP 35ディッシュの上に、蓋を伏せて置きます。これを37 °C、5% carbon dioxideのインキュベーター内で少なくとも5時間静置します。5時間後、蓋の吊り滴をディッシュ内の完全培地へと移します。この際、チップの先端を切断したP 1000ピペットを使用してください。その後、サンプルを37°C、5% CO2条件下で、DNA NU核感染の場合は24時間、SI A HRA核感染の場合は48時間インキュベートします。次に、25 mLの完全培地を調製し、37 °C、5% CO2条件下で数時間プレエキリブレーションを行います。その間に、-80 °Cのフリーザーから基底膜マトリックスの凍結アリコートを取り出し、コールドルーム内で氷上で融解させます。1回の核導入につき、最大8枚の13 mm滅菌カバーガラスを入れた6 cmディッシュを準備します。ラップで覆ったアイスボックスの上にディッシュを置きます。湿度を維持するため、膝に埋め込まれた骨芽細胞を含む6 cmディッシュを最大3枚保持するための15 cmディッシュの中に、湿らせたティッシュを1枚入れます。次に、完全培地をハイドロゲルマトリックスに1:3の比率で加え、再凝集させた細胞クラスターを15 mLチューブに移し、433 ×gで5分間遠心分離します。その後、過剰な培地を除去し、ペレットを10 µLの完全培地で再懸濁します。次に、細胞凝集塊懸濁液を2 µLずつ、各滅菌カバーガラス上に滴下します。マトリックス完全培地混合液を18 µL加え、ピペットチップを使用してマトリックスをカバーガラス全体に広げます。カバースリップを入れた6 cmディッシュを15 cmディッシュに配置した後、すぐにスライドさせます。このディッシュを37 °C、5% carbon dioxideのインキュベーターに移し、15〜20分間保持します。マトリックスが凝固した後、各6 cmディッシュに完全培地5 mLを緩やかに加え、浮いているカバースリップがあればピペットチップで押し下げます。その後、神経芽細胞が細胞凝集塊から遊走できるよう、37 °C、5% carbogen条件下で24時間インキュベートします。この図では、単離されたラットRMS細胞が、遊走性神経芽細胞マーカーであるDCXおよびbeta three tubulinに対して免疫陽性であることが示されています。また、この図は、マウスRMSから遊走する細胞において、遊走性神経芽細胞マーカーであるDCXおよびPSA NCAが発現していることを示しています。マウス神経芽細胞の核への導入（nuclear affection）について説明します。解離させたマウスRMS神経芽細胞をGFPで核導入し、三次元マトリックスに埋めて再凝集させ、6時間にわたって遊走させました。再凝集させた細胞塊から遊走する神経芽細胞は、高いトランスフェクション効率を示します。ここでは、GFPをコードする2種類の異なるプラスミドをラット神経芽細胞に導入し、マトリックスに埋入して再凝集させ、24時間遊走させました。その後、細胞を固定し、GFPおよびbeta three tubulinについて免疫染色を行い、遊走距離を測定しました。凝集した細胞クラスターを6つの等しいセクターに分割し、各セクターにおいてクラスターの端から最も遠くまで遊走した細胞までの距離を測定します。この図は、神経芽細胞の遊走をモニターするために、GFP陽性のNUCLE影響細胞と、対照群であるGFP陰性の非NUCLE影響細胞による相対的な遊走距離の定量化を示しています。S-H-R-N-AによるNucle影響の後、ラット神経芽細胞にコントロールS-H-R-N-Aベクター、またはHRNAターゲット配列を含む同一ベクターを用いてNUCLE影響を与え、マトリックス中に埋入して48時間にわたり再凝集させ、その後24時間遊走させました。その後、凝集塊を固定し、GFPおよびbeta three tubulinを用いて免疫染色を行いました。Fascinの効率的なノックダウンは、S-H-R-N-Aを核に導入して50時間後にウェスタンブロット解析で検出でき、ここではローディングコントロールとしてActinを示しています。以下は相対的な移動距離の定量解析であり、Fascinのノックダウンが神経芽細胞の移動を著しく阻害することを示しています。この手順に従い、出生後のエレクトロポレーションなどの他の手法を実施することで、NU Nuclear Affection遊走アッセイで得られた結果をin vivoで検証することができます。

nucleofection-rodent-neuroblasts-to-study-neuroblast-migration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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このプロトコルは、吻側渡り鳥ストリームにおける出生後の脳および神経芽細胞の遊走の高解像度のタイムラプスイメージングに最適化された器官スライスのアッセイを説明します。...

出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

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大脳皮質の発達における遺伝子の機能の迅速な評価を行うために、我々は関与する方法を説明...

神経形態形成の研究のための方法：<em&gt;エキソビボ</em胎児マウス大脳皮質&gt; RNAiのエレクトロポレーション

我々は、マウスの前脳におけるニューロン移動のリアルタイムvideoimagingためのプロトコルを記述します。ウイルス標識又はグラフト神経前駆細胞の遊走は、固定と移動相の持続時間と速度を含む細胞遊走のさまざまなフェーズを、勉強するのは比較的急速な取得間隔と広視野蛍光イメージングを用いた急性スライスのライブで録音された移行。...

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体性幹細胞の増殖を制御することは、彼らの研​​究と治療における使用を妨げる大きな要因となっている。ここでは、一時的にマウス脳で生成されたニューロンの数を増やすために使用することができます開発と成人期における神経幹細胞の膨張を制御するためのシステムを説明します。...

によって胚および成体神経幹細胞の拡大<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションまたはウイルス定位注射

神経芽細胞の遊走は、出生後の神経発生における基本的なイベントです。我々は、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよび急性脳スライスのタイムラプスイメージングを使用して、移行のその後の視覚化によって神経芽細胞の効率的な標識のためのプロトコルを記述します。私たちは、ビデオトラッキングによる神経芽細胞の動態を定量的に分析するための説明が含まれています。...

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

このプロトコルは、放射状に移動する皮質ニューロンの直接観察のための指示を提供する。 子宮内でのエレクトロポレーションでは、器官型スライス培養および時間経過共焦点画像化を組み合わせて、移動するニューロンにおける関心対象遺伝子の過剰発現または下方制御の影響を直接かつ動的に研究し、発生時のそれらの分化を分析する。...

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング<em&gt;ウテロの</em&gt;エレクトロポレーション

このプロトコルでは、E7.5のマウス羊膜腔にレンチウイルスを注入し、生存や胚発生への有害な影響を最小限に抑えながら、神経板全体の均一な形質導入をもたらす方法について説明します。...

胎内ナノ注射(NEPTUNE)によるマウス神経板ターゲティング(胎内7.5日目)

大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスには多くの遺伝子が関与しています。このプロトコルでは、移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージングの技術を紹介します。...

マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

ここでは、成体マウス脳室下ゾーンから単離された拡大神経幹細胞(NSC)における遺伝子導入効率を高めるように設計されたヌクレオフェクションシステムについて説明します。この知見は、この方法が神経幹細胞における遺伝子摂動を大幅に改善し、従来のトランスフェクションプロトコルの有効性を上回り、細胞の生存率を向上させることを示しています。...

成体マウス脳室下領域からの神経幹細胞の単離、増殖、およびヌクレオフェクション

学ぶ げっ歯類神経芽細胞のヌクレオフェクションと3D移行アッセイを用いた神経芽細胞移行の検討法。DNA/shRNA導入により標的タンパク質の影響を解析し、産後神経発生のメカニズム解明に貢献します。

神経芽細胞の移行を検討するために、げっ歯類神経芽細胞のクレオ

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