Name: マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる除核イベントにおけるマウス赤芽球亜集団エンリッチの同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学ぶマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるマウス赤芽球の除核イベント同定法。骨髄細胞のin vitro培養と蛍光標識を用いて、赤血球前駆細胞の成熟過程を可視化し、血液疾患の理解に貢献する。

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著者は、専門家の技術サポートのためにAmnisコーポレーション（EMD Millliporeの一部）からシンシナティ小児病院研究財団とリチャードDemarcoの、Sherree友人、そしてスコットモルデカイの研究フローサイトメトリーコアに感謝します。この作品は、国立衛生研究所によってサポートされていましたK08HL088126とR01HL116352（TAK）とP30のDK090971（YZ）を付与します。

体外赤血球文化の中で 1。長期（ex vivoで赤血球分化培養プロトコルGiarratanaによるら 8、修正およびマウス細胞に適応） これは、in vitro赤血球生成プロトコルで 3段階の長期的である。最初のステップ（0〜4日目）は、2×10 5細胞/ mlを、幹細胞因子（SCF）、インターロイキン-3（IL-3）、エリスロポエチン（EPO）を補充した赤芽球増殖培地中に置かれる。第二工程（5-6日間）において、細胞は、Epoを用いてのみ補充した新鮮赤芽球の増殖培地中で接着性間質細胞上/ mlで共培養し、2×10 5細胞（MS5）に再懸濁する。第三段階（7-9日間）において、細胞は、最大除核のサイトカイン（ 図1A）なしの新鮮な赤芽球の増殖培地中のMS-5細胞の層上で培養される。 全ての動物プロトコルはの施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたシンシナティ小児病院医療センター。 <ol><li>骨および低密度骨髄細胞の単離の収穫<ol><li> 2ミリリットルを15 mlのコニカルチューブ中の2％ウシ胎児血清（FBS）を含有する滅菌IMDMを追加し、氷上に保つ。 </li><li>機関が承認したプロトコル（頸椎脱臼に続いて例えば 、CO 2吸入、）は、次の（興味のある遺伝的に標的とするマウスの有無にかかわらず一緒に）2-6ヶ月の野生型C57/BL6マウスを安楽死させる。 </li><li> 、鉗子やメスを用いて骨盤骨、大腿骨、および両足の脛骨を分離IMDM +2％FBSを含むチューブに追加し、氷上に保つ。 </li><li> 1ミリリットルピンセットを用いて、滅菌フローサイトメトリーチューブとフラッシュ骨にIMDM +2％FBSおよび25-G×5/8 &quot;針でツベルクリン注射器を追加します。フラッシュIMDM +2％FBS、骨を通して数回静かに（ ）を細胞懸濁液から〜500μLを吸引し、骨を再度フラッシングすることにより、およびフローcytometrに骨髄細胞を採取Yチューブ。骨が白くなったフラッシングは完了です。 </li><li> 50 mlのコニカルチューブの上に40μmのセルストレーナーセットを介して細胞懸濁液をフィルタリングする。 IMDM +2％のFBSと同じ培地を5mlの細胞懸濁液の最終体積を調節用いてセルストレーナーを洗浄する。 </li><li>密度勾配遠心分離により、低密度骨髄細胞（LDBM）を準備し、慎重に25 750×gで15 mlチューブ、スピンでグラム/ mlの培地密度勾配細胞分離5mlの1.083に細胞懸濁液を5ml層ブレーキなし/低加速しながら、室温（RT）で分。 </li><li>新しい15 mlチューブに上清（軟膜を取得するために15 mlチューブの2 mlのマークについてのすべてをバックアップ）を転送して、5分間525×gでIMDM +2％FBSで1以上の洗浄を行うRT。 </li><li>上清を吸引し、室温で5分間、3ミリリットルRBC溶解緩衝液中にペレットを再懸濁させることによって、残りの赤血球（RBC）を溶解する。赤芽球の高い純度がある場合最後のステップ（生化学的研究用など ）で必要とされる、磁気分離による林NEG細胞に、このステップでさらにLDBM細胞を浄化する。 </li></ol></li><li> LDBMまたはLIN NEG細胞 （ 図1A）から開始してex vivoで赤血球分化培養プロトコル<ol><li>追加7ミリリットルIMDM +2％のFBS、5分およびRTでなる2mlの赤芽球増殖培地（EGM）中でペレット化した細胞を再懸濁するために525×gでスピン。 A。 STEMPRO-34培地を含む B。 2.6％STEMPRO-34培地補充、 C。 20％BIT-9500、 D。 900 ng / mLの硫酸第一鉄、 E。 90 ng / mLの硝酸鉄、 F。 100単位/ mlペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン グラム。 10 -6 Mヒドロコルチゾン H。および新たなサイトカインを追加しました： I）100 ng / mlのSCF、 ii）の5 ng / mlのIL-3、および III）3 IU / mlのエポ。 </li><li>裾を使用して自動化細胞カウンターを用いてまたは手動で顕微鏡で細胞を数えるocytometer。 </li><li> 5×10 5細胞/ウェルにEGM 2.5ミリリットル（2×10 5 LDBM細胞/ ml）の最終体積の濃度で6ウェル細胞培養プレートにおいてプレートし、37°C（インキュベートこれが考慮される文化の日の＃0など）。 </li><li> 、上清の1.5ミリリットルを吸引室温で5分間525×gでスピンし、すべての3サイトカインを含有し、日中2に戻ってウェルに毎日を追加する新鮮な培地1.5mLに再懸濁することによりメディアを変更し、3、4、最適化する増殖期。 3日目に、すべての細胞を除去カウントし、約2×10 5細胞/ mlの細胞ウエル濃度を維持するために適切な数のウェルに分割する。 37℃/ 5％CO 2で培養物を維持する。 </li><li> 4日目に、新たな細胞培養6ウェルプレートのウェルにプレートMS5細胞（マウス間質細胞株）。 MS5細胞培養培地は、20％FBS、100単位/ mlペニシリン/ストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを含有するα-MEMである。 </li><li> 5日目に、数を数える血球計数器を用いて顕微鏡で自動細胞カウンターを用いてまたは手動で元の培養プレートの各ウェル中の細胞（現在著しく赤芽球に富む）。 </li><li>各ウェルからすべてのセルを持ち上げて、15 mlのコニカルチューブに移し、室温で5分間525×gでスピンダウンし、上清を吸引し、および2×10の濃度にのみEPO（3 IU / ml）を含む新鮮なEGMでペレットを溶解5細胞/ ml。 </li><li> MS-5細胞は、前日めっき（共培養時には70〜80％の集密度をターゲット）とEPOのみの（ではないが、その培地を含むEGMでこれらのウェル中の赤血球細胞を追加したウェルから上清を吸引し選択は、MS-5細胞）数日間、EGMでよく生き残る。 </li><li>日の＃6に新鮮なEPOを追加する培地交換。 </li><li>無添加サイトカインとEGMを使用して、その日の＃7にメディアを変更します。毎日、抗TER119及びSYTO-16で染色した後、フローサイトメトリーによる除核およびp日間7〜9、試験サンプル上のマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー（3章で詳述）のためのサンプルを染色するroceed。 注：メッキ前と2日目に、4、6、および培養7、サイズ（FSC）対表面マーカーCD44およびTER119を評価することにより、フローサイトメトリーで赤芽球濃縮および分化のための培養細胞をモニター9また、CD71、TER119、およびFSC。また、10、11を使用することができる。 </li></ol></li></ol> 2。高速除核アッセイ、吉田らが記載したプロトコルに従って。変更した12（図1B） <ol><li> in vitroの赤血球生成培養のためのストレス赤血球生成誘導と間質細胞調製<ol><li>動物実験委員会のガイドライン（ 例えばイソフルラン溶液による）あたりの2-6ヶ月の野生型C57/BL6マウスを麻酔。マウスが十分に緩やかな後足のピンチに反射的反応の欠如のためにとのチェックをして麻酔されていることを確認してください手順の間に定期的な呼吸。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医眼軟膏を使用してください。 </li><li> 500μLの最終容量に出血尾を経由して、ストレス赤血球生成を誘導する。インスリン注射器を用いて、動物の腹腔内に流体蘇生（注入する前に、トレンデレンブルグ体位に動物を保持し、内臓を傷つけないように下腹部に注射する）を保証するために生理食塩水を等量のを注入する。 </li><li>ケージの周りを移動し始めと陥ることなく、立って歩くことができるという動物によって示されるように、モータ制御を取り戻したまで無人マウスを放置しないでください。 phlebotomizedマウスは他のマウスなしでケージに入れている。 </li><li> 2日後、24ウェル細胞培養プレートのウェル中のMS-5細胞をプレート。 70〜80であることを目標とMS5細胞培地中で37℃/ 5％CO 2（20％FBS、100単位/ mlペニシリン/ストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを含有する-MEM）でのMS-5細胞をインキュベート％コンフルエントのI48時間後、n個のプレートウェル。 </li></ol></li><li>脾細胞の脾臓および処理の収穫<ol><li>四日（96時間）ストレス赤血球生成誘導後、動物実験委員会が承認したプロトコル（頸椎脱臼に続いて例えば 、CO 2吸入）を通じて以前に出血させ、マウスを安楽死させる。 </li><li>収穫脾臓とIMDM 2％FBSを含む15 mlのコニカルチューブに入れ、氷上に保つ。 </li><li>背中の研究室では、無菌条件下で組織培養フード内で、50 mlチューブの上にセットさ40μmのセルストレーナーに脾臓を含むチューブを反転させる。 5 mlのプラスチックシリンジのプランジャーを使用して脾臓をつぶす。 </li><li> IMDM +2％FBSを細胞ストレーナーを洗浄し、同じ培地を用いて、5mlまでの細胞懸濁液の最終体積を調整します。 </li><li>慎重にブレーキなし/低加速して、室温で25分間750×gで15 mlチューブとスピンで5ミリリットルの密度勾配細胞分離培地1.083グラム/ミリリットルで5ミリリットル脾臓細胞浮遊液を重ね。 </li><li>転送新しい15 mlチューブに、室温で5分間525×gでIMDM +2％FBSを含む1以上の洗浄を行い、上清（バフィーコートを取得するために15 mlチューブの2 mlのマークについてまで溶液） 。 </li><li>上清を吸引し、室温で5分間、3ミリリットルRBC溶解緩衝液中でペレットを再懸濁することによって赤血球を溶解する。 </li><li> 7ミリリットルIMDM +2％のFBSで細胞を洗浄し、4℃で5分間、525×gでRBC溶解緩衝液とスピンを希釈し、中和するために追加</li><li>上清を吸引し、および赤芽球増殖培地（EGM）2mlにペレット化した細胞を一時停止。 </li></ol></li><li>プラスチック上の赤芽球が濃縮された孤立した低密度脾細胞、（高速のin vitro赤血球生成文化の第一段階）の培養<ol><li>自動細胞カウンターにまたは手動で、血球計数器で細胞を数える。この段階では、脾臓当たりの単離された細胞の通常の数は、約15×10 6である。 </li><li> fで（サイトカインを含む更な​​るEGM内のセルを一時停止inal濃度）：SCF 50 ng / mlのIL-3 5 ng / mlの、そしてエポ2単位/ ml。 </li><li> / 24ウェル細胞培養プレートを1ml /ウェル（ウェルの細胞の総数に応じて当たりのセルの数が同じ）の最終体積中で、37℃でO / Nインキュベート板1〜5×10 6細胞5％CO 2。 </li></ol></li><li> MS5細胞に対する赤芽球の培養物（ 体外赤血球産生培養において 、高速の第二段階<ol><li>吸引穴プラスチックからの上清各ウェルに氷の上に、5分間PBS中に冷たい10mMのEDTAの2ミリリットルを追加することによって、（強く赤芽球が濃縮された）細胞を持ち上げる。 </li><li> （サイトカインなしで）EGMで一度洗って同じに再懸濁、新しいチューブに細胞を入れた。 </li><li> 1〜2 mLの量のプレート5×10 5 -1×10 6個の各MS5細胞で被覆された24ウェルプレートのウェル。薬理学的阻害剤は、実験に使用されている場合は、ここで適切な濃度で追加してください。 </li><li>によって導か6から8時間（時間インキュベート未処理のWTサンプル中の約30％-40％の摘出）の顕微鏡観察。 MS-5細胞に対する赤芽球の結合は、彼らの摘出を加速させる。 </li><li>氷上で5分間、冷PBS + 10 mMのEDTAを2mlを添加することにより、各ウェルから細胞を持ち上げ。赤芽球と一緒に、MS-5細胞も収集することができるが、これらは、後で簡単にFSC こんにちは TER119として、フローサイトメトリー解析の際に除外することができます-細胞。 </li><li>この段階で、細胞をマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる分析のために固定し、染色することができる。 </li></ol></li></ol> 3。マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる除核の間に細胞内タンパク質または脂質ラフトの局在化のための赤芽球の染色<ol><li> RTおよび上清を吸引し、5分間525×gでのスピン、PBS中で細胞を洗浄。 </li><li> （固定時間が反によって異なる場合があり、15分間、PBS中の3.7％ホルムアルデヒド500μlの細胞ペレットを再懸濁することにより細胞を固定GENはプロービング）し、穏やかにピペッティングしている。 </li><li> 1.5 mlのプラスチック製遠心管に移し、室温で15分間インキュベートする。 </li><li> 20秒台微量2000 XGスピン、上清を吸引し、各チューブに500μlのPBSを添加し、緩やかにピペッティングすることによりワンウォッシュを行う。 </li><li> 20秒、吸引上清ベンチ微量2,000 XGでスピンし、少なくとも15分間氷上でチューブを保持します。透過化は、3.6から3.9は、迅速かつ効率的に行うべきであり、RTにて紡糸/吸引の後、細胞ペレットを直ちに細胞は、より自分の完全性を維持するために、氷上に戻すべきであるステップ。 </li><li> -20℃の冷凍庫からアセトン溶液を取り出し、氷上に置く。穏やかに500μlの氷冷50％アセトン（のdH 2 Oとの1:1）ピペッティングで第細胞ペレットを再懸濁することにより細胞を透過。 </li><li> 20秒、吸引上清500μLに再懸濁細胞ペレット用のベンチ微量2,000 XGでのスピン60;優しくピペッティングによる氷冷100％アセトン。 </li><li> 20秒台微量2000 XGスピン、上清を吸引し、静かにピペッティングして500μLの氷冷50％アセトン中でもう一度細胞ペレットを懸濁します。 </li><li>ベンチのマイクロスピン2000 20秒XG、上清を吸引し、穏やかにピペッティングすることにより冷FACSバッファー（PBS +0.5％BSA）で細胞を1回洗浄します。 </li><li>目的の分子に対する抗体またはマーカーで標識カクテルを準備します。赤血球細胞染色用のF-アクチン染色および1μl/100μLTER119-PECy7 0.1 U/100μlのAF488-ファロイジンを。代替的または追加的染色も（1:50）、AF-594-結合コレラ毒素サブユニットB脂質ラフトを標識する（1:200）、抗pMRLC（Ser19）AF-488-抗β-チューブリン抗体を用いて行うことができる一次抗ウサギAF-488結合二次抗体（1:400）、続いて、リン酸化ミオシン制御軽鎖に対する抗体（1:50）、および抗γ-tubu抗ウサギAF-555結合二次抗体（1:300）、続いて林一次ウサギ抗体（1:100）。 </li><li>上清を吸引後、穏やかにマーカーカクテル100μlのピペットで細胞ペレットを再懸濁し、RTで30分間インキュベートする。 </li><li>核染色のDRAQ5の2.5μMを含むFACS緩衝液を準備します。 </li><li>ベンチマイクロ遠心にDRAQ5を含む60μlのFACS緩衝液中で20秒、吸引上清と再懸濁のために2000×gでスピンダウン、FACS緩衝液で細胞を洗浄。 </li><li>イメージングで実行試料は、撮像に固有解析ソフトウェアフローサイトメーターを用いて、実験あたり少なくとも10,000の事象を収集し、以前に公表13として生データファイルを補償し、 図2に示すように、結果を分析するフローサイトメーター。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

それはex vivoで赤血球の正常な、大規模生産を達成するために効果的に再現するのが最も困難であるインビトロ赤血球新生培養における工程であるため、近年、赤芽球除核の研究が増加する勢いを得ている。最近まで、赤芽球摘出利用主に蛍光顕微鏡の研究とは、フローサイトメトリー法。蛍光顕微鏡法は、関与する分子を同定するのに有用ではあるが、特定の時点で固定された数百のセル内の摘出を受けているオルソ赤芽球の少数を同定するための顕微鏡観察の日数を必要とする。フローサイトメトリー法、他方では、培養液中の摘出率だけでなく、このプロセスの特定の分子の薬理学的または遺伝子操作の影響を評価する上で非常に有用ですが、intracellul上のデータを提供していませんこれらの分子のARの局在。 それは、細胞の数千のフローサイトメトリーおよび形態学的データの両方の迅速な取得を可能にするので、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーは、フローサイトメトリーおよび免疫蛍光顕微鏡の利点を兼ね備えています。赤芽球分化（前赤芽球、好塩基性、多染性、およびオルソ）のさまざまな段階で形態...

哺乳動物の赤血球系統内の端末分化はオルソ赤芽球は赤血球2を生成し 、その膜包ま核（pyrenocyte）1を排出を通して摘出の劇的過程でまとめられる。また、インビトロで赤血球の成功した、大規模生産の律速段階であるこのプロセスの正確なメカニズムは、まだ完全には解明されていない。除核の赤芽球内の主要なタンパク質や構造物の局在は、蛍光および電子顕微鏡3-5の使用に依存している。この面倒なプロセスは、一般的に摘出イベントの限られた数の識別をもたらし、常に意味のある統計的な分析を可能にしていません。マクグラスら 6により、前述の赤芽球の識別方法に拡大し、我々は、マルチスペクトルいまで摘出イベントを特定し、研究する新しいアプローチを開発した測定値を取得し、統計分析を実行するために十分な数の観測値を提供することができるエージングフローサイトメトリー（フローにおける多パラメータの高速セルイメージング、フローサイトメトリーと蛍光顕微鏡を組み合わせた方法）7。 ここでは、赤芽球を同期し、評価時に摘出を捕捉する確率を増加させるために使用される最初の2つのin vitroでの赤血球形成培養法を記載している。その後、我々は、マルチスペクトル画像フローサイトメトリーによる除核の間の細胞内タンパク質または脂質ラフトの局在化を研究するために詳細に固定および透過処理後の赤芽球の染色を記載する。 サンプルは、フローサイトメーターイメージングフロー上で実行され、回収した細胞をオルソ赤芽球6を識別するために、適切にゲートされています。明いまで測定されるオルソ赤芽球は、次​​いで、それらのアスペクト比に基づいて分析されそれぞれTER119及びDNAのために染色された領域の中心間の距離として定義されるパラメータデルタ重心XY TER119-DNA、のためのそれらの値に対するエージング。低アスペクト比及び高いデルタ重心XY Ter119/DNAを有する細胞の集団は、高度に細胞を除核内に濃縮される。 - / -たRac2上のRac1のMX-Creを媒介条件の削除と赤芽球に対する野生型（WT）赤芽球を使用して、または組み合わせたRac2 - / - ; RAC3 - / -遺伝的背景およびマルチスペクトル画像のこの新規な分析プロトコルは、フローサイトメトリー、我々は最近、脱核が非対称分裂に似ているし、RACのGTPaseによって部分的に調節アクトミオシン環の形成が摘出進行7のために重要であるとことを明らかにした。

<table><tbody><tr><td>&アルファ;MEM培地</td><td>CellGro</td><td>15-012-CV</td><td></td></tr><tr><td>IMDM培地</td><td>Hyclone(Thermo Scientific)</td><td>SH30228.01</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34 SFM</td><td>GIBCO(Life Tech)</td><td>10640</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34栄養補助食品</td><td>GIBCO(Life Tech)</td><td>10641-025</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>512450</td><td></td></tr><tr><td>BIT9500</td><td>Stemcellテクノロジー</td><td>09500</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP-1600-100</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>ハイクロン(サーモサイエンティフィック)</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ハイクロン(サーモサイエンティフィック)</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>ハイクロン(サーモサイエンティフィック)</td><td>SH30590.01</td><td></td></tr><tr><td>イソセシア(イソフルラン)</td><td>Butler-Schein</td><td>029405</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1.083 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmlyse (RBC lysis buffer)</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Acetone Sigma-Aldrich</td><td>534064</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 531-500</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>幹細胞因子 (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>インターロイキン-3 (IL-3)</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO)</td><td>AMGEN</td><td>薬局で利用可能</td><td></td></tr><tr><td>CD44-FITC 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553133</td><td></td></tr><tr><td>CD71-FITC 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553266</td><td></td></tr><tr><td>Ter119-PECy7 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>557853</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-AF488</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-tubulin-AF488 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>#3623</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit AF488-secondary antibody</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit AF555-secondary antibody</td><td>Invitrogen (LifeTechnologies)</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>AF594-cholera toxin B subunit</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>C34777</td><td></td></tr><tr><td>pMRLC (Ser19) antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>#3671</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-tubulin antibody</td><td>Sigma</td><td>T-3559</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>Draq5</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>硫酸第一鉄</td><td></td><td>Sigma F7002</td><td></td></tr><tr><td>硝酸鉄</td><td>Sigma</td><td>F3002</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120500</td><td></td></tr><tr><td>15mlチューブ</td><td>BD Falcon</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>50mlチューブ</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24-ウェルプレート</td><td>BD ファルコン</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>フローチューブ</td><td>BD ファルコン</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>ツベルクリンシリンジ</td><td>BD</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>インスリンシリンジ</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ針 25-G 5/8</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>キャップ付きフローチューブ</td><td>BD</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>40-&mu;m細胞ストレーナー</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>メス (使い捨て)</td><td>Feather</td><td>2975#21</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto Flow Cytometer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer</td><td>AMNIS (EMD Millipore)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up.</td><td>AMNIS (EMD Millipore)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemavet 950 Cell Counter</td><td>Drew Scientific</td><td>CDC-9950-002</td><td></td></tr><tr><td>NAPCO series 8000WJ インキュベーター</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-15R 遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Mini Mouse Bench 遠心分離機</td><td>Denville</td><td>C0801</td><td></td></tr></tbody></table>

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる除核イベントにおけるマウス赤芽球亜集団エンリッチの同定

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

哺乳動物の赤血球生成は、赤血球の形成をもたらす摘出の劇的プロセスを終了します。摘出のメカニズムはまだ完全には解明されていない。顕微鏡による除核の赤芽球内の主要なタンパク質や構造物の局在を研究する際に遭遇する一般的な問題は、摘出を受けている細胞の十分な数を観察することが困難なことである。我々は、フロー内のマルチパラメータの高速セルイメージング（マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー）を効率的に除核事象のかなりの数を識別するために、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法を組み合わせた方法を用いて新規な分析プロトコルを開発し、それはを可能にする測定値を取得し、統計解析を行う。 まず、ここでは、マウス赤芽球を同期し、目に摘出を捕捉する確率を増加させるために使用される2つのin vitro赤血球新生培養法を記載評価のE時間。次に、我々は、マルチスペクトル画像フローサイトメトリーによる除核の間の細胞内タンパク質または脂質ラフトの局在化を研究するために詳細に固定および透過処理後の赤芽球の染色を記載する。サイズおよびオルソ赤芽球を識別するために使用されDNA/Ter119染色と共に、我々は、細長い細胞の認識および「デルタ重心XY Ter119/Draq5に役立つ明視野チャンネル内のセルのパラメータ「アスペクト比」を利用&quot;それはTER119染色（新生網赤血球）の中心は、このように脱核するのに約セルを示す、遠く離れDRAQ5染色（押出を受けて核）の中心からである細胞事象の同定を可能にする。高いデルタ重心と低アスペクト比を有するオルソ赤芽球集団のサブセットは高度に細胞を除核内に濃縮される。

まず、細胞は、その明のアスペクト比（その長軸に対して彼らの未成年の長さの比）とそれらの明領域（その大きさの指標）に基づいて分析する。明Area値20を下回ると、200よりも高いとのイベントには、それぞれ、主に破片および細胞凝集体である、と分析（ 図2A）から除外されます。単一細胞（ゲート「R1」）は、画像の鮮鋭度を示すグラデーションRMSパラメータのためのそれらの値に基づいて分析される。ゲート「R2」がフォーカス（ 図2B）でよく撮影した画像を選択するために、50 パーセンタイル以上の勾配RMS値を持つ細胞を含む作成される。 TER119蛍光染色、平均ピクセル·パラメータ（ゲート」TER119が正」、 図2C）によって測定される細胞は、次いで、それらの明領域によって測定されるように、それらのサイズに基づいて、および赤血球マーカーTER119のためのそれらの陽性ゲートされる。 TER119のための非常に低いか、または非常に高い細胞は、それぞれ、非erythroidsまたは残りの細胞凝集体のどちらかであり、分析から除外...

この議定書は、赤芽球摘出プロセスの可視化を提供し、フローサイトメトリーマルチスペクトルイメージングフローによりオルソ赤芽球を除核の集団を同定する新規な方法を説明します。

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

この手順の全体的な目的は、有核赤芽球（aurn Erythroblast）サブポピュレーションにおける脱核イベントの同定を容易にすることである。最初のステップは、脱核イベントが濃縮された集団を作製することである。これは、非ストレスマウスの大腿骨、脛骨、および骨盤骨から単離した低密度骨髄細胞からの長期培養、または短期培養によるin vitro赤血球造血培養によって行われる。ストレス赤血球造血を誘導するために、あらかじめ静脈切開を行ったマウスの脾臓から採取した前駆細胞を用いて開始します。培養の最終段階における培養細胞を固定し、透過処理を施した後、目的の蛍光マーカーで染色します。これらの細胞をイメージングフローサイトメーターで解析し、核脱出を起こしている細胞を核を有する細胞集団の中から同定することで、核脱出のプロセスを調節および媒介するシグナル伝達因子や細胞骨格成分を特定することが可能です。蛍光顕微鏡などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、より多くの有核細胞を短時間で観察および解析できる点にあります。この方法は、赤芽球の核形成に関与する分子メカニズムは何かといった、赤血球造血分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。赤芽球を低密度の骨髄細胞から分画するには、まず滅菌済みのフローサイトメトリーチューブに1 mLの培地を加えることから始めてください。次に、25ゲージ・5/8インチの針をツベルクリン用注射器に取り付け、回収した大腿骨と脛骨に新鮮な培地を数回緩やかに流し込み、フローサイトメトリー用チューブに回収します。IMDMを用いて細胞懸濁液の量を5 mLに調整した後、15 mLチューブに入れた密度1.083 g/mLの密度勾配細胞分離培地5 mLの上に慎重に重層します。これを新しい15 mLチューブの2 mLの目盛りまで全て移し、回収したバフィーコートを新鮮な培地で洗浄します。その後、赤血球溶解バッファー3 mL中で室温で5分間赤血球を溶解させます。培地で細胞を洗浄し、同じプレート内でペレットを再懸濁した後、6ウェル細胞培養プレートに、1ウェルあたり5×10⁵ cellsの濃度、最終容量2.5 mLの増殖培地で播種し、37 °Cで培養します。播種から5日後に培養を確認してください。元の培養プレートの各ウェルにある赤芽球数をカウントし、各ウェルを対応する個別の15 milliliterコニカルチューブに移します。細胞を遠心分離した後、上清を吸引し、エリスロポエチンのみを含む新鮮な増殖培地を用いて、細胞密度が2 × 10⁵ cells/mLになるようにペレットを再懸濁します。次に、MS five細胞のプレートから上清を吸引し、そこに赤芽球細胞を加えます。2日後、低密度のPLEサイトから赤芽球を得るため、上清をサイトカインを含まない新鮮な増殖培地に交換します。5 mLシリンジのプランジャーを使用して、脾臓を40 µmのストレーナーで漉し、50 mLチューブに回収します。セルストレーナーを増殖培地で洗浄し、細胞懸濁液の最終容量を5 mLに調整します。先ほど示したように密度勾配により細胞層を分離した後、赤血球を除去し、細胞を7 mLの培養液で洗浄します。次に、サイトカインを添加した増殖培地でペレットを再懸濁し、24ウェル細胞培養プレートの1ウェルあたり最終容量1 mLに、1〜5×10⁶ cellsの細胞を分注し、37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。翌日。既報の通り、接着させたMS five細胞を含むウェルに細胞を移し、6〜8時間後に解析します。培養ウェルから赤芽球を回収し、PBSで希釈した3.7% formaldehyde 500 µLで固定し、穏やかなピペッティングでペレットを懸濁させます。15分後、マイクロ遠心分離機を用いて2000 ×gで20秒間遠心分離し、上清を吸引してペレットをPBS 500 µLで再懸濁します。再度マイクロ遠心分離機で細胞を遠心分離した後、再び上清を吸引し、細胞を少なくとも15分間氷上に置きます。－20 °Cで保存したアセトン溶液を氷上に置きます。次に、faxバッファーでの洗浄後、指示に従って一連のアセトン洗浄を行い、細胞を迅速に再懸濁して遠心分離します。細胞ペレットを適切な抗体カクテル100 µL中で室温で30分間インキュベートします。その後、再びfaxバッファーで細胞を洗浄し、得られたペレットをdrac fiveを含むfaxバッファー60 µLに再懸濁し、イメージングフローサイトメーターで解析を行い、実験サンプルあたり少なくとも10,000イベントを収集します。次に、細胞の明視野アスペクト比（短軸と長軸の比率）および細胞の大きさを表す明視野面積に基づいて細胞を選択し、解析を開始します。明視野面積の値が20未満、または200を超えるイベントは、それぞれ主にデブリおよび細胞凝集塊であるため、解析から除外します。その後、画像の鮮明度を示す勾配RMSパラメータの値に基づいて単一細胞を解析し、ピントが適切に合っている画像を選択するために、勾配RMS値が50パーセンタイルより大きい細胞を含む第2のゲートを作成します。次のゲートでは、明視野面積で測定した細胞サイズと、TER119蛍光染色の平均ピクセルパラメータで測定した赤芽球マーカーTER119の陽性に基づいて細胞を分画します。TER119の発現が極めて低い細胞は非赤芽球であり、極めて高い細胞は細胞凝集体の残渣であるため、それぞれ次のステップの解析から除外されます。その後、DR5のアスペクト比と強度、すなわち核の短軸と長軸の比およびDR5発現強度に基づいて細胞を選択します。DR5陰性細胞は、主に網状赤血球や赤血球などの脱核細胞、およびDR5のアスペクト比が低い細胞です。基本的に、解析ゲートからダブレットは除外されます。DNA陽性の細胞を5つドラッグします。この時点では、これらの細胞のほとんどは赤芽球です。次に、細胞の大きさを示すTER1-19領域と、TER1-19染色の明るさを示すTER1-19の平均ピクセル領域（すなわちTER1-19発現の密度）に基づいて、これらの赤芽球を解析します。正染性赤芽球は、小型でTER 19 highな細胞として認識されます。最終的に、正染性赤芽球のサブポピュレーションは、明視野におけるアスペクト比が低く、delta sentu XY TUR 19が高いことによって特徴付けられます。DR 5は、TUR 19陽性となりつつある網赤血球の中心と、DR 5陽性核の中心との間の距離として定義され、これにはHer 19に対する抗体とDNA染色剤のDRAAK 5が用いられます。通常、赤芽球の分化と脱核における f actin の局在を特定するために、細胞の染色も行われます。注目すべき点として、脱核の進行はアスペクト比の低下として可視化できます。つまり、細胞が次第に伸長し、delta OID xy TUR one 19 drag five が増大する様子が観察されます。F actinは脱核中の分裂溝に集積し、核が押し出されると消失します。脱核における役割をイメージングするため、他の目的のタンパク質や構造についても、適切な抗体や蛍光マーカーを用いて染色することが可能です。例えば、野生型の正染性赤芽球では脱核前に極性化した微小管形成が可視化されますが、コルヒチン処理した赤芽球では可視化されません。コルヒチンによるチューブリン重合の阻害は、明視野チャンネルで見える細胞体の中心と、DR fiveを用いて得られた核染色の中心との間のパラメータdelta OID XYB FDR fiveを測定することで実証されるように、細胞の極性を減衰させます。この手順に続いて、赤芽球島などで観察されるような、赤血球造血に関与する異なる細胞型間の相互作用に関する疑問を解決するために、蛍光顕微鏡などの他の手法を実施することができます。このビデオを視聴することで、赤芽球濃縮集団における脱核現象を可視化する方法について十分に理解できるはずです。

identification-murine-erythroblast-subpopulation-enriched-enucleating

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

直接収穫したてのマウスの骨髄、脾臓や胎児の肝臓における分化段階特異的マウス赤血球前駆細胞と前駆体の同定と分子解析のためのフローサイトメトリー法。アッセイは、細胞表面マーカーCD71、TER119、およびセルサイズに依存しています。...

CD71/TER119フローサイトメトリーアッセイを用いてマウス赤血球前駆細胞の同定と解析

分化胚性幹細胞(ESC)における時間的遺伝子発現の操作は、誘導性遺伝子システムを使用して達成することができます。しかし、これらの細胞株の作製には費用と時間がかかります。このプロトコルは、ES由来細胞の分化における導入遺伝子の迅速な発現と、その後の下流の造血分化の解析を実現します。...

マウス胚のレトロウイルス感染は、造血分化の解析のための細胞由来の胚様体幹細胞

造血幹細胞および前駆細胞（HSPC）は、まだ少しはいくつかの内皮細胞は、血液が形成になることを指定するプロセスについて知られている、開発中に特殊な（造血）内皮細胞に由来します。我々は、マウス胚組織から造血内皮細胞およびHSPCの同時分離を可能にするフローサイトメトリーベースの方法を示しています。...

マウス胚性造血内皮細胞の単離

浸潤しているマクロファージは、循環前駆細胞から成体組織に継続的に動員されるが、常在マクロファージは発達中に組織を播種し、前駆細胞からのさらなる入力なしに維持される。常在マクロファージの前駆細胞は最近同定された。ここでは、常在性マクロファージ前駆細胞の遺伝子運命マッピングのための方法を提示する。...

フローサイトメトリーによるマウス胚における赤血球系前駆細胞およびその子孫の同定

この記事では、スペクトルサイトメトリー、蛍光色素を区別するために、発光スペクトルの形状を使用するフローサイトメトリーでの新しいアプローチを説明します。このアルゴリズムは、補償を置き換え、独立したパラメータとして自家蛍光を扱うことができます。この新しいアプローチは、固形臓器から単離された細胞の適切な分析が可能になります。...

スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析

このプロトコルの目的は、説明されているマーカーを用いた肝臓内リンパ管の内皮細胞集団を識別するためにです。コラゲナーゼ IV と DNase...

リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化

インビトロマイクロ核アッセイは、ゲノ毒性および細胞毒性を評価するための確立された方法ですが、手動顕微鏡検査を使用してアッセイを採点することは面倒であり、主観性とスコアラー間の変動に苦しんでいます。本論文では、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてアッセイの完全自動化バージョンを実行するために開発されたプロトコルについて述べた。...

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてインビトロ微小核アッセイを行う自動化方法

ここでは、フローサイトメトリーによる腹膜、脾臓、および骨髄組織におけるマウス免疫B細胞区画の不均一性の単純な分析について説明する。プロトコルは、他のマウス組織に適応し、拡張することができます。...

マウスB細胞の発達におけるフロー細胞量測定

ここでは、マウス骨髄細胞を表現型造血幹および前駆細胞に単離および染色するための簡単なプロトコルと、支持するニッチ内皮および間葉系幹細胞について説明します。内膜および中枢骨髄領域に位置する細胞を濃縮する方法も含まれる。...

マウス骨髄造血幹・前駆細胞および間質ニッチ細胞のフローサイトメトリー解析

ここでは、初期バースト形成ユニット赤血球(BFU-e)およびコロニー形成ユニット赤血球(CFU-e)前駆細胞を新鮮なマウス骨髄および脾臓から直接前向きに単離するための新しいフローサイトメトリー法について説明します。単一細胞トランスクリプトームデータに基づいて開発されたこのプロトコルは、組織のすべての赤血球前駆細胞を高純度で分離した最初のプロトコルです。...

フローサイトメトリーによるマウス組織からのバースト形成ユニットおよびコロニー形成ユニット赤血球前駆細胞の同定と単離(英語)

この論文では、真皮リンパ管からマウス内皮細胞を磁気ビーズベースで単離する方法について説明しています。単離されたリンパ内皮細胞は、下流の in vitro 実験やタンパク質発現解析に使用できます。...

マウス真皮リンパ管内皮細胞の単離

学ぶマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるマウス赤芽球の除核イベント同定法。骨髄細胞のin vitro培養と蛍光標識を用いて、赤血球前駆細胞の成熟過程を可視化し、血液疾患の理解に貢献する。

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる除核イベントにおけるマウス赤芽球亜集団エンリッチの同定

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