マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる除核イベントにおけるマウス赤芽球亜集団エンリッチの同定

この手順の全体的な目標は、オーン赤芽球亜集団による除核イベントの同定を容易にすることです。最初のステップは、核形成イベントが豊富な集団を作成することです。これは、ストレスを受けていないマウスの大腿骨、脛骨、および骨盤骨から単離された低密度の骨髄細胞から開始する長期培養または短期培養のいずれかで、in vitro赤血球生成培養によって達成されます。

ストレス赤血球生成をマウントするために、以前に瀉血を受けたマウスの脾臓からのple細胞から開始します。培養の最終ステップで培養した細胞を固定し、浸透させ、目的の蛍光マーカーで染色します。これらの細胞をイメージングフローサイトメーターで分析し、次いで解析して核細胞集団において核出中の細胞を同定し、核核形成のプロセスを調節し媒介するシグナル伝達および細胞骨格成分を同定することができる。

蛍光顕微鏡法などの既存の方法と比較した場合、この手法の主な利点は、非常に多くの核細胞を短時間で観察および分析できることです。この方法は、赤芽球核形成にどのような分子メカニズムが関与しているかなど、赤血球生成分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。赤血球細胞を低密度骨髄細胞から分化するには、まず1ミリリットルの培養培地を滅菌フローサイトメトリーチューブに加えます。

次に、25ゲージ×8分の5インチの針をツベルクリン注射器に取り付け、採取した大腿骨と脛骨を通して新鮮な培地をフローサイトメトリーチューブに数回静かに流します。IMDMで細胞懸濁液量を5ミリリットルに調整した後、15ミリリットルのチューブに1.083グラム/ミリリットルの密度勾配細胞分離培地を5ミリリットル慎重に重ねます。新しい15ミリリットルのチューブに2ミリリットルのマークまですべてを移し、収集したバフィーコートを新鮮な培養培地で赤血球を洗浄し、赤血球を赤血球溶解緩衝液の3ミリリットルで5分間洗浄し、培養培地で細胞を洗浄し、同じプレートでペレットを懸濁します。 細胞を6ウェル細胞培養プレートに入れ、ウェルあたり5番目の細胞の10分の5の濃度で最終容量2.5ミリリットルまで増殖培地に添加し、培養物をプレーティングしてから5日後に細胞を摂氏37度でインキュベートします。

元の培養プレートの各ウェル内の赤芽球の数を数え、各ウェルを対応する個々の15ミリリットルの円錐管に移します。細胞をスピンダウンした後、上清を吸引し、エリスロポエチンのみを含む新鮮な増殖培地にペレットを再懸濁し、1ミリリットルあたり5番目の細胞の10の2倍の濃度にします。次に、MS 5細胞のプレートから上清を吸引し、赤血球細胞をウェルに加えます。

2日後、上清をサイトカインを含まない新鮮な増殖培地と交換します 低密度PLE細胞からの赤芽球に対して。5ミリリットルのシリンジのプランジャーを使用して、40ミクロンのストレーナーを介して脾臓を50ミリリットルのチューブに浸軟します。細胞ストレーナーを増殖培地で洗浄し、細胞懸濁液の最終容量を5ミリリットルに調整します。

次に、先ほど示したように密度勾配で細胞層を分離した後、赤血球をシラミにし、7ミリリットルの培養培地で細胞を洗浄します。次いで、Resusは、サイトカインを添加した増殖培地にペレットを懸濁し、24ウェル細胞培養プレートのウェル当たり1ミリリットルの最終容量で、摂氏37度および5%二酸化炭素で一晩、細胞を10〜6個の細胞に1〜5回インキュベートする。翌日。

前述のように、接着したMS細胞5個を含むウェルに細胞を移し、6〜8時間後に分析し、培養ウェルから赤芽球を採取し、PBS Resus中の500マイクロリットルの3.7%ホルムアルデヒドに固定し、ペレットを穏やかにピペッティングして懸濁します。15分後、細胞を2000GSでマイクロ遠心分離機で20秒間回転させ、上清を吸引し、ペレットを500マイクロリットルのPBSに再懸濁します。マイクロ遠心分離機で細胞をスピンダウンした後、再び上清を吸引し、細胞を氷上に少なくとも15分間置きます。

マイナス20°Cに置き、氷上にアセトン溶液を保管します。次に、ファックスバッファー洗浄後に示されている一連のアセトン洗浄で細胞を迅速に再懸濁し、スピンダウンし、細胞ペレットを適切な抗体カクテル100マイクロリットルで室温で30分間インキュベートします。次に、ファックスバッファーで細胞を再度洗浄した後、ドラク5を含むファックスバッファーの60マイクロリットルに持続ペレットを再懸濁し、実験サンプルごとに少なくとも10,000イベントを収集するイメージングフローサイトメーターでサンプルを実行します。

次に、明視野のアスペクト比、小軸と長軸の長さの比率、およびサイズを示す明視野面積に基づいてセルを選択することから解析を開始します。明視野面積の値が 20 未満と 200 より大きいイベントは、それぞれほとんどが破片と細胞凝集体であり、解析から除外されます。次に、画像の鮮明さを示す勾配RMSパラメータの値に基づいて単一のセルを分析し、50パーセンタイルを超える勾配RMS値を持つセルを含む2番目のゲートを作成して、焦点が合った画像を選択します。

次のゲートでは、細胞は、それらの明視野面積によって測定されたサイズおよびTER119によって測定された赤血球マーカーTER19に対するそれらの陽性に基づく細胞は、TER one 19について非常に低いまたは非常に高いピクセルパラメータ細胞であり、それぞれ非赤血球または残りの細胞凝集体のいずれかであり、次のステップで分析から除外される。細胞は、DR 5アスペクト比の強度、核の短軸と長軸の比率、およびd dr five発現の強度に基づいて選択されます。DRファイブネガティブ細胞は、主に網状赤血球や赤血球などの除核細胞と抗力5アスペクト比の低い細胞です。

ほとんどの場合、ダブレットは分析歩行から除外されます。ドラッグ5陽性DNA陽性細胞は、この時点ではほとんどが赤芽球です。次に、これらの赤芽球は、細胞のサイズを示すTER one 19領域と、TER one 19染色の明るさを示すTER one 19発現の平均ピクセル面積または密度に基づいて分析されます。

オルト色赤芽球は、小さなTER1 19高細胞として認識されます。最後に、オルトクロマティック赤芽球の亜集団は、それらの低い明視野アスペクト比と高いデルタセンチュXY TUR one 19によって特徴付けられます。初期の TUR 1 19 陽性網状赤血球の中心と DR 5 陽性核の中心との間の距離と、彼女に対する抗体 19 と DNA 染色 DRAAK 5 によって定義される DR 5。

細胞は通常、赤芽細胞および核形成中のfアクチンの局在を特定するためにも染色されます。注目すべきは、核摘出の進行は、アスペクト比が減少する細胞として視覚化できることです。すなわち、細胞はますます細長くなり、デルタOIDが増加すると、XY TUR 19 5抗力が観察される。

Fアクチンは、核形成中に切断溝に集中し、核が押し出されると消散します。目的の他のタンパク質や構造も、適切な抗体や蛍光マーカーで染色して、核摘出中の役割をイメージングすることができます。例えば、分極した微小管の形成は、核形成前の野生型オルト色赤芽球では可視化できますが、コルヒチンで処理した赤芽球では可視化できません。

コルヒチンによるチューブリン重合の阻害は、明視野チャネルで見られる細胞体の中心とDR fiveで達成された核染色の中心との間のパラメータDELTA OID XYB FDR fiveを測定することによって実証されるように、細胞分極を減少させます。この手順に続いて、蛍光顕微鏡などの他の方法を実行して、赤芽球島で観察されるような赤血球生成に関与する異なる細胞型間の相互作用に関する質問に答えることができます。このビデオを見れば、赤芽球が豊富な集団における眼球摘出イベントを視覚化する方法を十分に理解できるはずです。