Name: 食虫植物Nepenthesの組織からの生存多細胞腺の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-22T20:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 学ぶ、食虫植物Nepenthesの組織から単離された生存多細胞腺の機械的マイクロサンプリング法。この技術は分子解析と代謝研究のための純粋な腺組織を迅速かつ微侵襲的に提供します。

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植物を栽培してくれたイェーナのフリードリヒ・シラー大学植物園のMPI-CEの温室チームに感謝します。また、ヴィルヘルム・ボーランドとマックス・プランク協会の支援に感謝します。

1. 植物材料の準備
<ol>
	<li>すべてのネペンテス種は、MPIの化学生態学の温室またはドイツのイェーナにある植物園で栽培されました。</li>
	<li>分泌組織の調製のために、ピッチャーを採取し、蓋、ペリストーム、滑りやすいゾーンを含む上部の3分の1を取り除きます。このピッチャーは、新鮮な状態で使用することも、液体窒素で凍結して-80°Cで保存することもできます。</li>
</ol>
2. ピッチャー組織の顕微解剖
<ol>
	<li>マイクロサンプリングプラットフォームは、実体顕微鏡とマイクロマニピュレータで構成されており、マイクロマニピュレータは顕微鏡本体に直接取り付けられ、3Dジョイスティックで操作されます。ここでは、文書化されているように、アウレカの初期のプロトタイプが使用されました(図2A)。</li>
	<li>ネペンテスからの分泌腺の解剖には、ピッチャーはマイクロ鉗子を使用してマニピュレーターに取り付けます(図2Aおよび2B)。</li>
	<li>RNA抽出には、すべての器具(カミソリの刃、ピンセット、マイクロマニピュレーター、マイクロ鉗子、オブジェクトスライド)をRNaseZAPで処理します。</li>
	<li>RNA抽出用のPCRチューブに9 μlのヌクレアーゼフリー水と1 μlのRNase阻害剤を加えて、コレクションチューブを調製します。組織サンプルからの直接PCRには、ヌクレアーゼフリーの水(10 μl)のみを使用してください。
	<ol>
		<li>新鮮なピッチャーまたは冷凍ピッチャーを取り、かみそりの刃とピンセットを使用して、分泌腺を含む1〜2cm2のティッシュを取り除きます。ティッシュを水で洗います。RNAを抽出する場合は、0.1%ジエチルピロカーボネート(DEPC)を添加します。</li>
		<li>植物材料を両面粘着テープで物体スライドに固定し(グランドで覆われた表面が上を向く必要があります、図2Cおよび2D)、スライドをユニバーサルステージに粘着テープで固定します。</li>
		<li>核酸を抽出するには、調製を氷上で行う必要があります。したがって、平らな発泡スチロールの箱を取り、サンプルが入ったユニバーサルステージを中に入れ、箱に氷を入れます。その後、ボックスを顕微鏡の下に置きます。</li>
		<li>準備のためには、腺の位置が非常に重要です。分泌腺は部分的に保護フードで覆われており(図3)、片側から鉗子からのみアクセスできます。さらに、鉗子に対するサンプルの角度は、ネペンテスの種に応じて、ユニバーサルステージのテーブルを約135°傾けることによって調整する必要があります。</li>
		<li>マイクロダイセクションは、視覚的な制御下で行われます。グランドの単離には、DNAとRNAの分解を制限するために、非UVフィルターを使用します。</li>
		<li>マイクロマニピュレーターと鉗子をコントロールパネルから選択したグランドに移動します。腺に到達したら、鉗子の各アームを腺の両側に置きます。鉗子を閉じて、残りの組織から腺を取り出します(図4A)。</li>
		<li>鉗子に取り付けられたグランドを対象物から遠ざけ、収集チューブに向けます。鉗子の先端をチューブ内の溶液に接触させます(図4B)。鉗子を開くことによる腺の放出は、腺がツールチップにくっつく傾向があるため、よく観察する必要があります。組織は、PCRまたはRNA抽出まで-80°Cで保存できます。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Nepenthes組織からの直接PCR増幅
<ol>
	<li>調製法の効率性を証明するために、DNA抽出ステップを経ずに腺組織から直接PCRアプローチを行うことができます。</li>
	<li>PCR増幅には、遺伝子特異的プライマーを使用する;ここでは、ソーマチン様タンパク質(TLP)の配列をコードする(フォワード:5'-CAATGAGCCAATTCATAAAATTCATTG-3'、リバース:5'-CAGTTATACTTTAAGGGCAAAACACAACAAC-3')。
	<ol>
		<li>10 μlのヌクレアーゼフリー水を含むPCRチューブに1〜5個の腺を採取します。50 μLの反応液に、10x Taqバッファー5 μl、10 mMデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)1 μL、25 mM MgCl2 μl 3、0.4 μl (1.25 U) Taq DNAポリメラーゼ、各プライマー1 μl (100 pmol)、ヌクレアーゼフリー水28.6 μlを添加してください。</li>
		<li>サーモサイクラーで PCR 反応を以下のプログラムで実施します。初期変性 94 °C で 3 分間、35 サイクルの変性 (94 °C で 30 秒)、アニーリング (59 °C で 30 秒)、伸長 (72 °C で 1 分間)、および最終伸長ステップ 10 分間 72 °C</li> で行います。
		<li>アガロースゲル電気泳動を使用してPCR産物の増幅を証明します。したがって、1.5%(w/v)アガロースを使用し、1x TAE(40 mMトリス塩基、20 mM氷酢酸、1 mM EDTA、pH 8)緩衝液に溶解してください。アガロースが溶解するまで、溶液を電子レンジで加熱します。100 mLのアガロース溶液に、1 μLのエチジウムブロマイド (10 μg/μl) を加えて下流の可視化に用いてください。ゲルを1x TAEバッファーに入れ、300 V、115 mAで電気泳動チャンバー内で約20分間泳動します。TLPアンプリコンの正しいサイズは690 bpである必要があります。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 小組織サンプルからのRNA抽出と逆転写
<ol>
	<li>氷上で次の手順を実行します。RNAの抽出には、全RNAの抽出用のマイクロキットと、磁気ビーズを適用したmRNA分離キットの2つの抽出方法を使用しました。</li>
	<li>1 μl の RNase 阻害剤と 9 μl のヌクレアーゼフリー水を含む PCR チューブに、マイクロプレパレーションにより少なくとも 30 個の分泌腺を採取します。その後、サーモサイクラーで組織を75°Cで10分間溶解します。</li>
	<li>トータルRNAの抽出。
	<ol>
		<li>調製後、90 μlの溶解溶液をサンプルに加え、75 °Cで10分間インキュベートします。その後、反応混合物をカラム(キットに付属)にロードし、メーカーのマニュアルに記載されている洗浄手順に進みます。</li>
		<li>10 μl Elution SolutionでそれぞれRNAを2回溶出し、DNase I処理を続けます。</li>
		<li>抽出した20 μlのRNAに、2 μlの10x DNase Iバッファーと1 μlのDNase I(RNA抽出キットに付属)を加え、37°Cで1時間インキュベートします。2 μlのDNase Inactivation Reagentを加えて反応を停止し、室温で2分間インキュベートします。最高速度で1.5分間の遠心分離ステップの後、RNAを新鮮なRNaseフリーチューブに移すことができます。分光光度計を使用して、各サンプルのRNA濃度を測定します。サンプルは-80°Cで保存する必要があります。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磁気ビーズを用いたmRNAの抽出。
	<ol>
		<li>溶解/結合バッファー(キットに付属)を使用してサンプル量を100 μlに調整し、75 °Cで10分間インキュベートし、Oligo (dT)25オーバーハングが付属した磁気ビーズ20 μlを加え、室温で5分間反応を混合します。mRNAは、ポリ(A)テールによってビーズのオリゴ(dT)25オーバーハングに結合します。</li>
		<li>磁気ビーズに結合したmRNAの洗浄ステップは、メーカーのプロトコルに従って行ってください。溶液は磁石を使用して除去できます。ビーズを20 μl 10 mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)に再懸濁します。</li>
		<li>サンプルを 2U (1 μl) の DNase (10x DNase バッファー 2 μl とヌクレアーゼフリー水 17 μl) で 37 °C で 1 時間処理することにより、ゲノム DNA のコンタミネーションを除去します。その後、酵素溶液を磁石で除去し、ビーズを 20 μl の 10 mM Tris-HCl バッファーに再懸濁します。RNA濃度はビーズに付着しているため、測定することはできません。サンプルは-80°Cで保存する必要があります。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>逆転写には、cDNA合成キットを使用します。反応は、メーカーのプロトコルに従って行いました。
	<ol>
		<li>全RNAの逆転写には、1 μl (100 pmol) Oligo (dT)20 プライマーまたは1 μl (0.4 μg) ランダムヘキサマー、1 μl RNase 阻害剤、1 μl 10 mM dNTP Mix を 1 μg の RNA に添加し、ヌクレアーゼフリーの水で容量を 14 μl に調整します。65°Cで5分間インキュベートし、その後、サンプルを氷上に置きます。0.1M DTT1 μL、逆転写酵素1 μl、5x RTバッファー4 μlを添加します。反応液を50°Cで55分間インキュベートした後、70°Cで10分間不活性化ステップを行います。逆転写後、サンプルは-20°Cで保存できます。</li>
		<li>磁気ビーズに結合したmRNAの場合は、Tris-HClバッファーを最初の反応ミックス(1 μl RNase阻害剤、1 μl 10 mM dNTP Mix、および12 μlヌクレアーゼフリー水)に交換し、65°Cで5分間インキュベートします。ビーズにはオリゴ(dT)25がオーバーハングしているため、オリゴ(dT)20プライマーやランダムヘキサマーをサンプルに加える必要はありません。その後、上記のプロトコル(ステップ4.5.1)に従います。</li>
		<li>分光光度計でcDNA濃度を測定します。サンプルは-20°Cで保存します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. リアルタイムPCR
<ol>
	<li>リアルタイムPCRによる解析には、Micro KitおよびSYBR Green QPCR Master Mixで抽出したトータルRNAを使用します。転写産物の量を均等にするには、逆転写後に各サンプルのcDNA濃度を同じ値に調整します。</li>
	<li>サンプルに加えて、制御反応を挿入します。非テンプレートコントロールを使用して、試薬の汚染をスクリーニングし、プライマーの品質を確認します。ゲノムDNAが存在しないことを確認するために、非RTコントロールを実行します。どちらの反応も、リアルタイム PCR では陰性 (蛍光シグナルなし) である必要があります。</li>
	<li>異なるサンプル間で転写産物レベルが等しいことを保証するには、少なくとも1つの参照遺伝子を使用します。ここでは、アクチン(forward:5'-CTTCTTAACCCCAAAGCAAACAGG-3'、逆:5'-GTGAGAGAACACCCTGGATG-3')と18SrRNA(forward:5'-CTTGATTCTATGGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTG-3'、逆:GTTAGCAGGCTGAGGTCTC-3')をコードするプライマーペアを設計した。標的遺伝子としてTLP(forward:5'- GTGGGCAACAATTGGACCCAG-3', reverse: 5'-CATTCGATCCGGAAAGGCTAC-3')を選択した。増幅された各フラグメントのサイズは約100bpでした。</li>
	<li>25 μlの反応液には、12.5 μl の2x SYBR Green QPCR Master Mix、cDNA (≥20 ng)、各プライマーの400 nM、およびパッシブリファレンス色素ROX(キットに付属)の30 nMを添加してください。ヌクレアーゼフリーの水でサンプル量を25 μlに調整します。</li>
	<li>反応は、QPCR サーモサイクラーで次のプログラムを使用して行いました: 最初の変性を 95 °C で 10 分間行い、ポリメラーゼを活性化します。40 サイクルの変性 (95 °C で 30 秒)、アニーリング (61 °C で 60 秒)、伸長 (72 °C で 1 分間)、続いて解離曲線 (95 °C で 60 秒、 55°Cで30秒、95°Cで30秒)。解離曲線は、プライマーダイマーの不在を判断するために必要であり、プライマーダイマーは追加のピークによって検出できます。</li>
	<li>各PCR反応の効率(E)を、LiuとSaint8の方法を用いて決定します。効率は、増幅曲線の線形部分から偏向させることができます。ここでは、1つのサイクルポイント(CPA)の相対アンプリコン数(Rn、A)が、別のサイクル(CPB)のアンプリコン(Rn、B)の量にリンクされています。</li>
	<li>リアルタイムPCRの結果は、Relative Expression Software Tool(REST 2009, <a href="http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html" target="_blank">http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html</a>)または同様のソフトウェアで解析します。このプログラムを使用して、処理したサンプル中の遺伝子の発現率をコントロールと比較して計算します。</li>
</ol>

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</ol>

開示するものは何もありません。

長い間、植物の分泌構造、特に毛状突起の研究は、本質的に解剖学に基づいて行われ、純粋に記述的でした。9-11 のレビューに要約されているように、このタイプの出版物は多数あります。植物の分泌構造に関する私たちの生化学的および分子的知識は、いくつかの初期の注目すべき研究、 例えば 、腺毛状突起が皮下腔に分泌されるモノテルペノイドの生合成の部位であることを示すミント腺毛状突起について、まだ限られています12。したがって、それらを独立して研究するために、そのような特殊な臓器を分離するためのツールを作成し、技術を開発する必要があります。これらの腺に直接アクセスすることで、植物の分泌系における生理学的プロセスと分子的プロセスの両方を直接調査し、理解する可能性が提供されます。分泌化合物の生合成と輸送において重要な役割を果たす遺伝子の機能と、そのような高度に専門化された臓器の発達がどのように制御されているかという問題に取り組むことができます。
多くの分泌腺の生産能力と分泌能力は、人間の健康や耐久性のある作物保護を含む幅広い分野での潜在的な...

植物は、低分子化合物からポリマーに至るまで、工業的および医薬的に応用可能な多種多様な化合物を生成します。これらの化合物は、多くの場合、高度に分化した構造体によって生成および分泌されます。その多くは、腺毛や蜜腺のように植物の表面に位置するか、あるいは特異細胞（イドイオブラスト）やラテックス管、樹脂管のように内部に位置しています。しかし、これらの特殊な分泌構造の生物学については、ほとんどの種類で活性代謝を示す多くの特徴が見られるものの、比較的ほとんど分かっていません。特に、Nepenthesのような食虫植物の腺は、植物細胞生物学におけるモデルシステムとして捉えることができます1。
食虫植物は、チャールズ・ダーウィンの『食虫植物』が出版された1875年以来、数多くの研究対象となってきました。2しかしながら、分子レベルでの研究が行われ始めたのはここ数年のことであり、我々の知見はまだ限られています。例えば、ウツボカズラ属の食虫植物における消化液のタンパク質組成については、 ウツボカズラ は依然として完全には解明されていない。ごく最近になって、いくつかの加水分解タンパク質と、それらに対応するいくつかの遺伝子が同定された。3のピットフォールトラップにおいて ウツボカズラ (図1), 多細胞腺は捕虫嚢の内側底部に位置している。これらの腺は、消化酵素の産生と捕虫嚢液への分泌、および捕虫嚢液から溶解した栄養素を吸収することの両方を行う。4したがって、これらの二機能腺は、食虫性の［省略］において中心的地位と機能を担う、独特な微小組織であると言える。 ネペンテス それは詳細に研究する価値がある。
<img alt="食虫植物の解剖図、ネペンテスの捕虫嚢の詳細、植物学的研究、トラップ機構、適応。" src="/files/ftp_upload/50993/50993fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図1"> 
図1. Nepenthes alataの捕虫嚢。捕虫嚢の下部には、消化液と内側の腺が含まれている。
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50993/50993fig1highres.jpg" target="_blank">ここをクリックして拡大画像を表示</a>。
植物科学において、多くの実験的アプローチは、特定の組織ではなく器官全体を調査するため、「バルク材料」に依存しています。その結果、それらのホモジナイズおよび分析で得られる結果は、個々の組織や細胞に対して希釈され、比例的なものにならざるを得ません5。この問題を解決するために、いわゆるレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）などのマイクロプレパレーション技術が開発され、特定の植物組織を回収し、その個別の含有物を分析することに成功しています6。しかし、RNAのような不安定な、あるいは分解の速い細胞成分を標的とする場合、LCMは制限されることが多いです。このような場合、時間がかかり、しばしばバイオ分子の分解を伴う事前の組織固定が必要となることがデメリットとなります。さらに、多くの植物組織の含水率が高く、細胞壁が強固であるため、新鮮な組織から直接プレパレーションを行う際にLCMは失敗することがよくありました7。遺伝子、mRNA、タンパク質から、二次化合物およびその生合成に至るまで、分泌腺に存在する細胞成分を調査するあらゆるアプローチには、特別なプレパレーションのための代替技術が必要です。したがって、プレパレーション後も完全な状態で保持される単一細胞、あるいは多細胞腺を単離するための特異的な技術が必要とされています。
ここでは、直接的な顕微鏡視覚化機能を備えた機械化マイクロサンプリングプラットフォームを用いた手法を紹介する。この手法は、ウツボカズラの捕虫嚢から個々の腺を調製する際に、迅速かつ効率的である。 ネペンテス 種。これらの多細胞腺は二機能性であり、 すなわち これらは分泌および吸収プロセスの両方に関与しており、固定的な性質を持ち、露出していない細胞層は浸潤して内皮を形成しています。隣接する組織を含まずに腺全体を単離し、PCRチューブに規定の方法で配置することが可能です。この手法は、腺組織における特定の遺伝子および遺伝子発現の研究に適用されます。

<table><tbody><tr><td>RNAqueous-Micro Kit</td><td>Life Technologies GmbH, ドイツ</td><td>AM1931</td><td>Isolation of total RNA, 50 samples</td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit</td><td>Life Technologies GmbH, Germany</td><td>61011</td><td>5 ml Dynabeads Oligo (dT)25</sub</td></tr><tr><td>>DynaMag-2 magnet</td><td>Life Technologies GmbH, Germany</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript CellsDirect cDNA Synthesis System</td><td>Life Technologies GmbH, Germany</td><td>18080-200</td><td>25 reactions</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies GmbH, Germany</td><td>10777-019</td><td>Rnase inhibitor, 5,000 units</td></tr><tr><td>ランダムヘキサマー (0.4 &mu;g/&mu;l)</td><td>QIAGEN GmbH、ドイツ</td><td>79236</td><td>100 &mu;l</td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix, molecular biology grade</td><td>Fermentas GmbH, Germany</td><td>R0192</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Taq DNA ポリメラーゼ, (組換え)</td><td>Fermentas GmbH, ドイツ</td><td>EP0402</td><td>10x Taq バッファー (KCl または (NH4)2SO4) および 25 mM MgCl2</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Life Technologies GmbH, ドイツ</td><td>AM2238</td><td>1,000 units</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth GmbH Co. Germany</td><td>T846.3</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler Low Range DNA ladder, ready-to-use</td><td>Fermentas GmbH, Germany</td><td>SM1193</td><td>50 &mu;g</td></tr><tr><td>Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix</td><td>Agilent Technologies, Inc., USA</td><td>600828</td><td>シングルキット</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>R2020</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Carl Roth GmbH Co., Germany</td><td>CK08.1</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Carl Roth GmbH Co., Germany</td><td>2801.1 / 2855.1</td><td></td></tr><tr><td>GE NanoVue 分光光度計</td><td>GEHealthcare Europe GmbH, Germany</td><td>28-9569-62</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler gradient</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td><td>5331 000.010</td><td></td></tr><tr><td>Mx3000P Real-Time PCR System</td><td>Stratagene, USA</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis Chamber</td><td>Biometra</td><td>Discontinued</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>aura optik gmbh</td><td>aureka</td><td>マイクロ鉗子を搭載</td></tr><tr>実<td>体顕微鏡</td><td>カールツァイス顕微鏡、イェーナ、ドイツ</td><td>SteREO Lumar.V12</td><td>AxioCam</td></tr>ル<tr><td>マーフィルターセットを装備 01</td><td>カールツァイス、顕微鏡、イェーナ、ドイツ</td><td>485001-0000-000</td><td>UVフィルター</td></tr><tr><td>ルマーフィルターセット09</td><td>カールツァイス、顕微鏡、イェーナ、ドイツ</td><td>485009-0000-000非</td><td>UVフィルター</td></tr></tbody></table>を装備

食虫植物nepenthesの組織からの生存多細胞腺の単離

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

多くの植物は、特定の低分子量化合物およびタンパク質の産生および分泌に関与する特殊な構造を持っています。これらの構造は、ほとんどの場合、植物の表面に局在しています。その中には、蜜厄介類や腺状トリコームがあります。分泌された化合物は、花粉媒介者の誘引剤や草食動物に対する抑止力など、生物環境との相互作用によく使用されます。
食虫植物には、いくつかの点でユニークな腺があります。ネペンテ属のいわゆるピッチャー植物では、落とし穴トラップの内側の二機能腺は、一方では獲物の消化に必要なすべての酵素を含む消化液を分泌し、他方では放出された栄養素を吸収します。したがって、これらの腺は、植物のタンパク質分泌と栄養素の取り込みの根底にある分子的、生化学的、生理学的メカニズムを研究する運命にある理想的で特殊な組織を表しています。さらに、一般に、腺構造を備えた多くの植物によって産生される二次化合物の生合成は、腺で直接調べることができます。
そのような特殊な構造に取り組むためには、それらは効率的で、速く、代謝的に活性で、他の組織との汚染なしに分離される必要があります。そこで、機械的なマイクロプレパレーション技術が開発され、ネペンテス消化液の研究に適用されました。ここでは、機械化されたマイクロサンプリングプラットフォームに基づいて、Nepenthesトラップから単一の二官能腺を成功裏に調製するために使用されたプロトコルを示します。腺は単離され、RNA調製後のPCR技術による遺伝子発現解析にさらに直接使用できます。

Nepenthesの捕虫嚢組織から単一の腺を調製するために、機械化されたマイクロダイセクション法が開発され、適用されました。マイクロ調製プラットフォームには、マイクロマニピュレーターに取り付けられたマイクロ鉗子を備える必要があり、これはコントロールパネルによって操作されます。顕微鏡下で視認できる個々の腺を、鉗子で標的として腺組織を把持し、機械的に摘出することができました（図 4A）。
その腺組織は、後続の解析のためにPCRチューブに直接移された（図 4B）。腺の除去が成功したことは、腺の下にある植物の維管束系が露出したことで確認できた（図 4A）。
調製法の品質と効率をさらに証明し、本手法が有用であることを確認するため、PCR法を実施しました。候補遺伝子として Nepenthes gracilis 由来のthaumatin-like protein (TLP) (NCBI Acc. No D...

植物腺は、生物環境との相互作用に関与する多くの化合物の生合成と分泌に関与する特殊な構造です。それらの分子的および生化学的特徴の研究を可能にするために、ここでは肉食植物Nepenthesから単一の代謝活性腺を単離するための機械的マイクロ調製技術が確立されました。

食虫植物Nepenthesの組織からの生存多細胞腺の単離

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

本手法の目的は、分子解析のために、新鮮な植物組織から単一かつ純粋な腺を得ることにあります。まず、ネペンテス属の植物から捕虫葉を採取します。次に、組織の鮮度を維持するため、氷上にあるマイクロサンプリングプラットフォームに組織を直接固定します。マイクロサンプリングの手順では、腺を精密に単離し、採取した試料に対して定量PCR解析を行う前にPCRチューブへ移します。最終的に、機械的なマイクロサンプリング技術を用いて、食虫植物から単一かつ純粋な腺を取得することで、その後の分子解析に必要な特定組織を、迅速かつ低侵襲的に提供します。食虫植物は、動物性タンパク質を消化できるため、植物相の中でも特異な存在です。分子レベルでそれがどのように機能しているかについての知見は、まだ限られています。この疑問に取り組むための優れたモデルとして、虫垂の組織像が挙げられます。なぜなら、虫垂には消化プロセスに寄与する腺を産生する明確な器官（組織）が存在するからです。これらの腺は、下図の中に位置しています。分子解析を行うには、直径約100〜200 µmのこれらの幅広く平坦な構造を、新鮮な組織から直接単離する必要があります。さらに困難なことに、これらの腺は保護フードで覆われています。サンプリング時に3次元的な観察が必要となるカーポートのような構造を有しており、また、繊細に3次元的に動作できるツールが必要でした。しかし、現在のマイクロダイセクション技術では、我々の課題を解決できないことが分かりました。例えば、レーザーを用いた手法は、植物組織の水含有量が高いために失敗しました。したがって、3D構造の組織の一部や単一細胞を単離するために、「aika」と呼ばれる新しい機械的マイクロダイセクション法を採用することにしました。この手法は実体顕微鏡または共焦点顕微鏡で構成されており、非常に平坦な試料や非常に高い試料にも容易に到達できるよう3Dマイクロマニピュレーターが組み込まれています。これは顕微鏡と共に柱として移動し、植物のサンプリングには多くの場合マイクロキャピラリーを使用します。しかしながら、虫垂のガラス標本の場合、PTO駆動のマイクロ鉗子を用いる方が本の手順においてより効果的であることがわかりました。虫垂に合わせて、プラットフォームを修正しています。小型のVXYステージにより、組織サンプルとそのホルダー、および腺を配置する場所の両方を保持するのに十分な大きさの、氷を満たした容器が支持されています。氷を用いることで組織内の分解プロセスを十分に遅延させ、組織の元の分子状態を認識することが可能になります。以下の手順は、画像の底部から約1〜2平方センチメートルの断片を切り出し、平坦にした状態から確立されています。次に、組織を両面テープでスライドグラス上に固定します。この組織サンプルをRNaseフリーの水で覆い、サンプリング工程の間、湿った状態を維持します。その後、腺の保護フードがマニピュレーター側を向くようにサンプルを配置します。腺が水平に就くように、サンプルとツールの角度を調整する必要があります。ユニバーサルステージを使用することで、2軸で傾斜を調整でき、顕微鏡下で容易に補正することが可能です。また、金属製ステージによって、顕微鏡観察中のサンプルの低温状態が維持されます。腺組織が明確に識別されています。蛍光により、腺と保護フードの両方の輪郭を容易に認識することができます。腺の分離のために、FSEフィルターを通してサンプルを観察します。RNA抽出には、UVフィルターを使用します。腺の単離には、マイクロピンセットの非常に精密な位置決めが不可欠です。ツールは低速モードで操作することを推奨します。マイクロ鉗子を用いて腺にアプローチし、ジョイスティックで鉗子先をその縁に配置して、慎重に閉じます。次に、腺を周囲の組織から持ち上げます。精密に単離すると、下層の血管組織を伴う無傷の腔を確認することができます。その後、分離した腺をPCRチューブに移し、調製したバッファーに入れます。この手法を検証するため、ピッチ状の液体に分泌されるatoma leg protein short（TAP）の遺伝子発現を測定しました。その結果、ゲノムDNAを事前に抽出することなく、分離した組織にPCR反応液を加えるだけで、腺から直接遺伝子を増幅できることが確認されました。一連の実験では、異なる処理を施したネペンテスの腺およびその周囲の表皮組織のサンプルを用いました。それぞれの実験において全RNAを抽出しました。得られたmRNAを逆転写により対応するcDNAに変換し、その後のPCR反応に使用しました。目的の遺伝子配列を増幅させるため、リアルタイムPCRを用いてネペンテス（ウツボカズラ）の腺組織と表皮におけるTLPの発現レベルを比較しました。その結果、nepenthes allottaおよびnepenthes miisの両種において、表皮組織に対する腺組織の比率が1未満であったことから、表皮組織と比較して分泌腺でのTLP転写レベルが高いことが視覚的に示されました。また、獲物との接触が遺伝子発現を誘導するかどうかを検証するため、獲物の捕獲後におけるTLP転写レベル、および未処理の状態とdrosophila melanogasterを供給した状態の画像を比較しました。ここでは、表皮組織においてより高いTLP発現が認められました。腺組織と表皮組織のTLP転写産物レベル、および処理後のnepenthes miisの画像が比較されました。両組織タイプにおけるTLP発現の上昇は、捕虫嚢液タンパク質の産生が実際に獲物によって誘導され得ることを示しています。PCRの結果から、給餌によって両方の組織タイプにおいてTLPの発現が効果的に変化し、腺組織と表皮の間の発現比を変動させ得ることが示唆されました。我々は、FA虫垂組織からクレンズを回収するための効率的な手法を開発し、遺伝子発現実験を行うのに十分な量のmRNAを単離しました。この新しく開発した手法を用いることで、虫垂腺のトランスクリプトーム解析だけでなく、メタボロミクスやプロテオミクスへのアプローチも可能になります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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