食虫植物Nepenthesの組織からの生存多細胞腺の単離

本手法の目的は、分子解析のために、新鮮な植物組織から単一かつ純粋な腺を得ることにあります。まず、ネペンテス属の植物から捕虫葉を採取します。次に、組織の鮮度を維持するため、氷上にあるマイクロサンプリングプラットフォームに組織を直接固定します。

マイクロサンプリングの手順では、腺を精密に単離し、採取した試料に対して定量PCR解析を行う前にPCRチューブへ移します。最終的に、機械的なマイクロサンプリング技術を用いて、食虫植物から単一かつ純粋な腺を取得することで、その後の分子解析に必要な特定組織を、迅速かつ低侵襲的に提供します。食虫植物は、動物性タンパク質を消化できるため、植物相の中でも特異な存在です。

分子レベルでそれがどのように機能しているかについての知見は、まだ限られています。この疑問に取り組むための優れたモデルとして、虫垂の組織像が挙げられます。なぜなら、虫垂には消化プロセスに寄与する腺を産生する明確な器官（組織）が存在するからです。

これらの腺は、下図の中に位置しています。分子解析を行うには、直径約100〜200 µmのこれらの幅広く平坦な構造を、新鮮な組織から直接単離する必要があります。さらに困難なことに、これらの腺は保護フードで覆われています。

サンプリング時に3次元的な観察が必要となるカーポートのような構造を有しており、また、繊細に3次元的に動作できるツールが必要でした。しかし、現在のマイクロダイセクション技術では、我々の課題を解決できないことが分かりました。例えば、レーザーを用いた手法は、植物組織の水含有量が高いために失敗しました。

したがって、3D構造の組織の一部や単一細胞を単離するために、「aika」と呼ばれる新しい機械的マイクロダイセクション法を採用することにしました。この手法は実体顕微鏡または共焦点顕微鏡で構成されており、非常に平坦な試料や非常に高い試料にも容易に到達できるよう3Dマイクロマニピュレーターが組み込まれています。これは顕微鏡と共に柱として移動し、植物のサンプリングには多くの場合マイクロキャピラリーを使用します。

しかしながら、虫垂のガラス標本の場合、PTO駆動のマイクロ鉗子を用いる方が本の手順においてより効果的であることがわかりました。虫垂に合わせて、プラットフォームを修正しています。小型のVXYステージにより、組織サンプルとそのホルダー、および腺を配置する場所の両方を保持するのに十分な大きさの、氷を満たした容器が支持されています。

氷を用いることで組織内の分解プロセスを十分に遅延させ、組織の元の分子状態を認識することが可能になります。以下の手順は、画像の底部から約1〜2平方センチメートルの断片を切り出し、平坦にした状態から確立されています。

次に、組織を両面テープでスライドグラス上に固定します。この組織サンプルをRNaseフリーの水で覆い、サンプリング工程の間、湿った状態を維持します。その後、腺の保護フードがマニピュレーター側を向くようにサンプルを配置します。

腺が水平に就くように、サンプルとツールの角度を調整する必要があります。ユニバーサルステージを使用することで、2軸で傾斜を調整でき、顕微鏡下で容易に補正することが可能です。また、金属製ステージによって、顕微鏡観察中のサンプルの低温状態が維持されます。

腺組織が明確に識別されています。蛍光により、腺と保護フードの両方の輪郭を容易に認識することができます。腺の分離のために、FSEフィルターを通してサンプルを観察します。

RNA抽出には、UVフィルターを使用します。腺の単離には、マイクロピンセットの非常に精密な位置決めが不可欠です。ツールは低速モードで操作することを推奨します。

マイクロ鉗子を用いて腺にアプローチし、ジョイスティックで鉗子先をその縁に配置して、慎重に閉じます。次に、腺を周囲の組織から持ち上げます。精密に単離すると、下層の血管組織を伴う無傷の腔を確認することができます。

その後、分離した腺をPCRチューブに移し、調製したバッファーに入れます。この手法を検証するため、ピッチ状の液体に分泌されるatoma leg protein short（TAP）の遺伝子発現を測定しました。その結果、ゲノムDNAを事前に抽出することなく、分離した組織にPCR反応液を加えるだけで、腺から直接遺伝子を増幅できることが確認されました。

一連の実験では、異なる処理を施したネペンテスの腺およびその周囲の表皮組織のサンプルを用いました。それぞれの実験において全RNAを抽出しました。得られたmRNAを逆転写により対応するcDNAに変換し、その後のPCR反応に使用しました。

目的の遺伝子配列を増幅させるため、リアルタイムPCRを用いてネペンテス（ウツボカズラ）の腺組織と表皮におけるTLPの発現レベルを比較しました。その結果、nepenthes allottaおよびnepenthes miisの両種において、表皮組織に対する腺組織の比率が1未満であったことから、表皮組織と比較して分泌腺でのTLP転写レベルが高いことが視覚的に示されました。また、獲物との接触が遺伝子発現を誘導するかどうかを検証するため、獲物の捕獲後におけるTLP転写レベル、および未処理の状態とdrosophila melanogasterを供給した状態の画像を比較しました。

ここでは、表皮組織においてより高いTLP発現が認められました。腺組織と表皮組織のTLP転写産物レベル、および処理後のnepenthes miisの画像が比較されました。両組織タイプにおけるTLP発現の上昇は、捕虫嚢液タンパク質の産生が実際に獲物によって誘導され得ることを示しています。

PCRの結果から、給餌によって両方の組織タイプにおいてTLPの発現が効果的に変化し、腺組織と表皮の間の発現比を変動させ得ることが示唆されました。我々は、FA虫垂組織からクレンズを回収するための効率的な手法を開発し、遺伝子発現実験を行うのに十分な量のmRNAを単離しました。この新しく開発した手法を用いることで、虫垂腺のトランスクリプトーム解析だけでなく、メタボロミクスやプロテオミクスへのアプローチも可能になります。