圧力筋運動記録法を用いた抵抗腸間膜動脈における筋原性応答および血管作用を評価します

本手順の全体的な目的は、小抵抗腸間膜動脈における圧力誘発性血管緊張に対する薬理学的薬剤または疾患状態の影響を明らかにすることである。まず、マウスモデルから腸間膜アーケードを単離し、次に第4次分岐の小抵抗動脈を解剖することでこれを達成する。

次のステップは、動脈標本のカニュレーション、加圧、およびインキュベーションです。PSSでは、最終ステップとして動脈標本の生理学的完全性を評価します。これは、血管緊張の自発的な発生と、血管収縮薬および血管拡張薬に対する適切な可逆的反応によって実証されます。最終的に、圧力誘発性収縮を測定することが可能です。

本手法の意義は、高血圧、低血圧、または血管機能不全の治療や診断にまで及びます。なぜなら、本手法は血管抵抗、灌流、および血圧の主要な決定要因である血管緊張の圧力誘発性変化の根底にある主要なメカニズムを特定できるためです。本手順は、当研究室のポストドクター研究員であるDr.Jjaによって実演されます。

まず、ガラスカニューレをマイクロピペットホルダーに装着し、それを灌流チャンバーに取り付けて灌流チャンバーの準備を行います。Milli Q水で洗浄した後、解剖液でそれぞれ5分間ずつ洗浄します。その後、チャンバーに解剖液2 mLを満たします。

次に、気泡が入らないように注意しながら、カニューレ全体と接続されたチューブに溶液を満たします。解剖顕微鏡下で鈍的ピンセットを用い、半結びにした縫合糸を2本準備します。解剖ピンセットを使用して、両方のカニューレの先端から少し離れた位置に、半分結ばれた状態の縫合糸を装填します。

次に、麻酔をかけたラットに対し、骨盤から胸骨にかけて正中切開を行います。まず皮膚を切開し、続いてその下の筋肉層を切開してください。この際、腹腔内臓器を損傷しないよう十分注意してください。細胞外灌流液の汚染を防ぐため、食糜や糞便の漏出がないよう、両端を個別に結紮してください。

その後、腸管の近位端を孔付近で、遠位端を回盲接合部付近で切断します。次に、栄養血管に近い腸間膜の基部を切開します。続いて、小腸腸間膜床全体を、氷冷した解剖液が入った50 milliliterのビーカーに移し、5分間インキュベートします。

次に、新鮮な解剖液で洗浄し、血液を取り除きます。続いて、腸の近位端をシャーレの右側に固定し、残りの腸を反時計回りに伸ばします。実体顕微鏡下で、腸間膜を広げ、血管を露出させるように各セグメントをピンで固定します。

まず、2次分枝付近の被覆脂肪をすべて取り除き、小腸に並行する3次および4次の小腸間膜動脈を剥離します。次に、静脈を剥離して、V字型の分枝点を持つ動脈を単離します。選択したセグメントを穿刺しないように注意してください。

次に、小腸に平行な動脈の4〜5 mmの区間を単離します。小腸に埋入しているすべての第5次分枝を、分枝の起点からわずかに離れた位置で切断し、その一部を保持しておきます。これらの部分は、動脈セグメントを灌流チャンバーへ移送する際の保持部位として機能し、その後のカニュレーションのガイドとなります。

次に、動脈の両側にある5次分岐の末梢側で2箇所切開して動脈セグメントを切り出し、灌流チャンバーへ移します。解剖用ピンセットで動脈セグメントの先端を保持し、血管の一端をガラスマイクロピペットにカニュレーションします。あらかじめ装着しておいた半結びの縫合糸をカニュレーションした端にスライドさせ、固定します。

続いて、解剖溶液を満たした10 milliliterシリンジを、このカニューレに接続されたストップコックに取り付けます。シリンジをゆっくりと持ち上げてください。溶液にかかる重力によって、血管の開口部から血管内の血液が除去されます。

動脈内の血液を除去した後、ストップコックを閉じます。次に、もう一方のガラスカニューレを動脈セグメントの結んでいない端にできるだけ近づけ、血管の遠位端を2本目のガラスカニューレに結びつけます。あらかじめ準備しておいた部分的に結ばれた縫合糸をカニューレ挿入端にスライドさせ、固定します。

動脈セグメントを引っ張ったり、強く引いたりしないよう注意し、両方のカニューレに取り付けられたストップコックが閉じていることを確認してください。灌流チャンバーを、ライブビデオ録画装置を備えた倒立顕微鏡のステージに移動させます。次に、動脈セグメントの近位端に結ばれたカニューレのストップコックを、サーボ制御式圧力調節装置に接続します。

管腔内圧を安定させるため、もう一方のカニューレに取り付けられたストップコックが閉じたままであることを確認します。次に、真空チューブを灌流チューブに、吸引ポートをチャンバーの灌流ポートにそれぞれ接続します。シングルインライン溶液ヒーターを介して、温めたPSSを用いて2 mL/minの速度で血管の灌流を開始します。

ペリスタルティックポンプを使用し、チャンバー内のPSSの温度が37 °Cに近づいたところで真空ポンプをオンにします。管腔内圧を20から100 mmHgまでゆっくりと上昇させます。圧力レギュレーターの自動圧力設定を使用して、血管にリークがないか確認してください。

その後、圧力を100 mmHgに維持しながら、動脈セグメントに屈曲がないか確認します。スクリューレバーを使用してカニューレを移動させ、動脈セグメントを直線状に伸ばします。この際、動脈セグメントを伸ばしすぎないように注意してください。次に、腸間膜アーケード内のin vivo圧力を模倣するために圧力を70 mmHgまで下げ、動脈セグメントを安定させ、筋原性トーンを発現させます。

本手順では、モノクロビデオ電荷結合デバイス（CCD）カメラを備えた顕微鏡を用い、10倍の対物レンズで動脈を観察します。ビデオフレームグラバーとリアルタイムエッジ検出システムを使用して、内腔径を測定します。

次に血管径を記録し、筋原性緊張の発現をモニタリングします。その後、圧力を20 mmHgまで下げ、血管径が安定するまで待ちます。続いて、内腔圧を20、40、60、80、100といった段階的なステップで上昇させ、各圧力において動脈径が安定した状態になるまで待ちます。

次のステップとして、トレースに示されているように、0.39 millimolar EGTAおよび0.1 millimolar sodium nitropressを含むカルシウムフリーPSSを用いて、圧力ステップ応答を繰り返します。ラットの小腸間膜動脈の直径は、70 millimeters of mercuryで加圧すると自発的に減少しますが、1 micromolar acetylcholineを添加すると、直径は開始時の直径近くまで増加しました。組織バスに1 micromolar phenylephrineを添加すると動脈径が減少し、本図は小腸間膜動脈をカルシウムフリーPSSでインキュベートすると動脈径が増加することを示しています。さまざまな灌流圧における単一の加圧動脈セグメントの直径を本表に示します。

ここでは、PSS存在下およびカルシウムフリーPSS存在下で、管腔内圧を段階的に上昇させながら、動脈径を連続的に記録します。各圧力段階で得られた動脈径の曲線と、各圧力段階で得られた筋原性緊張の棒グラフがここに示されています。このビデオを視聴することで、小型抵抗動脈の筋原性挙動を評価する方法について十分に理解できるはずです。

この手法に続いて、内皮破壊や動脈透過性などの追加の手順を行うことができます。これらの手順により、小型抵抗動脈の血管緊張調節における内皮およびカルシウムの役割に関するさらなる疑問を明らかにすることができます。