圧力筋運動記録法を用いた抵抗腸間膜動脈における筋原性応答および血管作用を評価します

この手順の全体的な目標は、薬理学的薬剤または病状が圧力誘発性血管緊張に及ぼす影響を判断することです 小さな抵抗性腸間膜動脈の緊張。これは、最初にマウスモデルから腸間膜アーケードを分離することによって達成されます。2番目のステップは、4次の小さな抵抗動脈を解剖することです。

次のステップは、動脈製剤のカニューレ挿入、加圧、およびインキュベーションです。PSSでは、最後のステップは動脈製剤の生理学的完全性を評価することであり、これは血管緊張の自発的な発達と血管収縮薬および血管拡張薬に対する適切な可逆的反応によって示されます。最終的には、圧力による収縮を測定することができます。

この技術の意味は、高血圧、低血圧、または血管機能障害の治療または診断にまで及びます。この技術は、血管抵抗、灌流、および血圧の主要な決定要因である血管緊張の変化を誘発する圧力の根底にある主要なメカニズムを特定するためです。この手順は、私たちの研究室のポスドクターフェローであるJja博士によって実演されます。

この手順は、ガラスカニューレをマイクロピペットホルダーにロードし、マイクロピペットホルダーを灌流チャンバーに取り付けて灌流チャンバーを準備することから始めます。Milli Q水ですすぎ、続いて解剖液をそれぞれ5分間使用します。.次に、チャンバーに2ミリリットルの解剖液をロードします。

次に、カニューレ全体と付属のチューブを気泡を出さないように慎重に充填します。解剖顕微鏡下で鈍い鉗子を使用して、それぞれ半分の結び目で2つの縫合糸を準備します。解剖鉗子を使用して、先端から少し離れたところに部分的に閉じた縫合糸の結び目を持つ両方のカニューレをロードします。

次に、麻酔をかけたラットの骨盤から胸骨まで、最初に皮膚を切開し、次に下にある筋肉層を切開することにより、正中線開腹術を行います。腹腔内臓器を傷つけないように注意する必要があります。細胞外入浴液の汚染を避けるために、チャイムと糞便の漏れを防ぐために両端を別々に結びます。

その後、腸の近位端をポリの近くに、遠位端を回盲接合部の近くで切断します。次に、摂食血管系の近くの基部で腸幹を切開します。次に、小腸腸間膜床全体を氷冷解剖液を含む50ミリリットルのビーカーに移し、5分間インキュベートします。

次に、新鮮な解剖液ですすいで血液を取り除きます。次に、サードコーティングされた皿の右側にある腸の近位端をピンで留め、残りの腸を反時計回りに伸ばします。セグメントを固定して中心を広げ、ステレオズーム顕微鏡で血管を露出させます。

最初に2次枝の近くの覆っている脂肪をすべて除去することにより、小腸に平行な3次および4次の小さな腸間膜動脈を解剖します。次に、静脈を解剖し、V字型の分岐点で動脈を分離します。選択したセグメントに穴を開けないように注意してください。

次に、小腸に平行な動脈の4〜5ミリメートルの部分を分離します。小腸に埋め込まれているすべての5次枝を枝の起点から少し離して切り取り、一部を保存します。これらの部分は、動脈セグメントを灌流チャンバーに移すための保持部位として機能し、その後、それらのカニューレ挿入をガイドします。

次に、動脈の両側にある5次枝から遠位に2つの切開を行うことにより動脈セグメントを切断し、それらを灌流チャンバーに移します。ガラス製のマイクロピペットで血管の一端をカニューレ挿入し、動脈セグメントの先端を解剖鉗子で保持します。前にロードした部分的に閉じた縫合糸をカニューレの端にスライドさせて固定します。

続いて、このカニューレに接続されたストップコックに10ミリリットルのシリンジを装填した解剖液を取り付けます。シリンジを静かに上げます。溶液にかかる重力により、血管の開放端から血管内血液が除去されます。

動脈内血を抜いた後、ストップコックを閉じます。次に、血管の遠位端を2番目のガラスカニューレに結び付け、もう一方のカニューレを動脈セグメントの結ばれていない端にできるだけ近づけます。前にロードした部分的に閉じた縫合糸をカニューレの端にスライドさせ、固定します。

動脈セグメントを引っ張ったり引っ張ったりしないように注意し、両方のカニューレに取り付けられたストップコックスが閉じていることを確認する必要があります。灌流チャンバーをライブビデオ録画を備えた倒立顕微鏡のステージに移します。次に、動脈セグメントの近位端に結ばれたカニューレのストップコックをサーボ制御の圧力調整装置に接続します。

安定した管腔内圧を維持するために、もう一方のカニューレに取り付けられたストップコックが閉じたままであることを確認してください。次に、真空チューブを灌流チューブに、吸引ポートをチャンバーの灌流ポートに取り付けます。1つのインライン溶液ヒーターを介して、1分間に2ミリリットルで温かいPSSを容器に灌流し始めます。

蠕動ポンプを使用して、チャンバー内のPSSの温度が摂氏37度近くになるように真空をオンにします。管腔内圧を水銀柱の20ミリメートルから100ミリメートルまでゆっくりと上げます。圧力調整器の自動圧力設定を使用して、容器に漏れがないか確認します。

その後、圧力を100ミリメートル水銀柱に維持しながら、動脈セグメントの曲がりを評価します。スクリューレバーを使用して、カニューレを動かして動脈セグメントをまっすぐにし、動脈セグメントを過度に伸ばさないでください。次に、圧力を水銀柱の70ミリメートルに下げて、腸間膜アーケードの生体内圧力を模倣し、動脈セグメントが安定して筋緊張を発達させます。

この手順では、モノクロビデオ電荷を備えた顕微鏡で10倍対物レンズで動脈を観察します。デバイスのカメラを結合します。ビデオフレームグラバーとリアルタイムエッジ検出システムを使用して管腔径を測定します。

次に、血管の直径を記録し、筋原性緊張の発達を監視します。その後、圧力を20ミリメートル水銀柱に下げ、直径が安定するまで待ちます。次に、20、40、60、80、100などの段階的なステップで管腔内圧を上げ、動脈が各圧力で安定した直径を達成できるようにします。

次に、トレースで示されるように0.39ミリモルEGTAおよび0.1ミリモルナトリウムニトロプレスを含むカルシウムフリーPSSで圧力ステップ応答を繰り返し、ラット由来の小腸間膜動脈の直径は、水銀柱の70ミリメートルで加圧すると自然に減少し、1マイクロモルのアセチルコリンを添加して直径を開始直径近くまで増加させた。組織浴に1マイクロモルのフェニレフリンを追加すると動脈径が減少し、この図は、カルシウム遊離PSSでの小さな腸間膜動脈のインキュベーションが動脈径を増加させることを示しています。この表は、さまざまな灌流 8 の 1 つの加圧動脈セグメントの直径を示しています。

ここでは、PSSおよびカルシウムフリーPSSの存在下で管腔内圧を徐々に増加させながら、動脈径を連続的に記録します。これは、各圧力ステップで達成された動脈径の曲線であり、各圧力ステップで達成された筋原性緊張の棒グラフがここに示されています。このビデオを見た後、小さな抵抗動脈の筋原性挙動を評価する方法についてよく理解しているはずです。

この技術に続いて、内皮破壊や動脈浸透などの追加の手順を実行できます。これらの手順の両方は、小抵抗動脈の血管緊張の調節における内皮とカルシウムの役割に関するさらなる質問に答えることができます。