沈殿形成ポリエチレングリコールマイクロゲルの特性は、反応物の分子量によって制御されます

この手順の総合的な目的は、光重合沈殿反応を用いてポリエチレングリコールマイクロゲルを形成し、これをドラッグデリバリー担体および組織工学スキャフォールドとして利用することです。まず、光開始剤、緩衝液、トリエチルアミン、およびPEG DL溶液を含む試薬を調製し、それらを37 °Cに加温することでこれを達成します。次のステップでは、試薬をマイクロ遠心チューブに入れ、37 °Cの温度を維持しながらボルテックスします。

次に硫酸ナトリウムを混ぜ合わせ、溶液をUVライトの下に置き、30秒間架橋させます。架橋後、溶液の上にマイクロゲルを含む白濁した層が形成されます。最終ステップとして、混合物にPBSを加え、遠心分離してペレットを形成します。

最終的に、マイクロゲルのサイズ測定には顕微鏡観察および動的光散乱法を用い、密度はデキストリン密度勾配を用いて測定します。さらに、マイクロゲルのウェット重量およびドライ重量を測定することで、膨潤量を算出します。エマルション法、懸濁法、分散法などの他の手法と比較した本手法の主な利点は、沈殿反応によって形成されるマイクロゲルが、有機溶媒や安定剤を使用せずに低い多分散指数を持つことです。また、沈殿反応の穏やかな条件、マイクロゲルのカスタマイズ可能な特性、および注射に適した低粘度であることから、NVivoアプリケーションへの適用に適しています。

この手法は、均一なサイズと低い多分散指数を兼ね備えたスキャフォールドの作製など、組織工学および再生医療分野における重要な課題の解決に寄与します。本技術は、薬剤中の成長因子を容易にカプセル化できるため、薬物送達治療への応用も期待されます。まず、光開始剤を500 mg量り取り、100 mLの脱イオン水に加えて0.5%溶液を調製します。

溶液を紫外線から保護し、光開始剤を完全に溶解させるため、絶えず攪拌しながら約1時間、40 °Cまで加熱します。完全に溶解した後、0.22 micronフィルターを用いて溶液を滅菌ろ過し、使用時まで4 °Cの暗所で保存します。次に、粘度を下げるため、Triethylamineを37 °Cに予熱します。

次に、その溶液612 µLと6 M塩酸260 µLを39.4 mLのPBSに加え、pHを7.8に無菌的に調整します。最終溶液を0.22 micronフィルターでろ過し、使用時まで37 °Cで保存します。Sonyらの報告に基づき、公表されている方法に従ってPEG前駆体を調製し、完成した製品をアルゴン雰囲気下、-20 °Cで保存します。その後、使用直前に、200 mgのpeg di acrylateに、トリエタノールアミンと塩酸を添加したPBS 0.8 mLをゆっくりと加えることで、200 mg/mLのPeg di Acrylate溶液を1 mL調製します。

また、実験の直前に、硫酸ナトリウム213 mgを量り取り、脱イオン水1 mLに溶解させます。1.5 M溶液を調製するため、溶液を37 °Cで20分間加熱し、その後、完全に溶解するまでボルテックスミキサーで撹拌します。溶解後、最終的な硫酸ナトリウム溶液とPEGジアクリレート溶液の両方を、37 °Cで0.22 µmフィルターを用いてろ過します。

1.6 mLマイクロ遠心チューブに、トリエチルアミンおよび塩酸を含むPBS 127.5 µL、0.5%光開始剤 10 µL、および200 mg/mL PEGジアクリレート溶液 25 µLを加えて混合します。その後、封入したい任意の分子を添加します。

これらのチューブと1.5 molar硫酸ナトリウム溶液を37 °Cまで加温します。次に、あらかじめ温めておいた1.5 molar硫酸ナトリウム溶液87.5 µLをPEG溶液の1本目のチューブに加え、ピペッティングで3〜5回混ぜ合わせます。混合後、塩濃度が均一に分布し、溶液は透明になります。

チューブをUVライトの下に置き、30秒間クロスリンクさせます。クロスリンク後、マイクロゲルを含む溶液の上に白濁した層が形成されているはずです。次に、チューブに750 µLのPBSを加え、ボルテックスミキサーで溶液を十分に混合します。

次に、混合液を4,000 ×gで2分間遠心分離し、ペレットを形成させます。ペレットが形成されたら、ペレットを乱さないように注意して上清を除去し、マイクロゲルを新鮮なPBSに懸濁させます。マイクロゲルを新鮮なPBSで計5回洗浄し、その都度遠心分離してペレット化します。

最終洗浄後、上清を除去し、ペレットから30 µLのマイクロゲルを1 mLの脱イオン水にピペットで分注します。次に、マイクロゲル溶液をウォーターバス型超音波洗浄機に入れ、周波数50～60 Hz、電力1.4 Aで1時間超音波処理します。続いて、15 µLのマイクロゲル溶液を清潔な酸エッチングガラススライド上にピペットで滴下し、その上にNo. 1.5の酸エッチングカバーガラスを載せます。

スライドをラボ用ティッシュの上に裏返して置き、スライドを軽く押して余分な溶液を取り除き、マイクロゲルが単層になっていることを確認します。次に、光学顕微鏡を用い、DIC 100 x 油浸対物レンズでマイクロゲルの画像を数枚撮影します。マイクロゲルを測定し、代表的な直径を求めます。

ここに示す体積ベースの式を用いて多分散指数を算出します。ここで N はマイクロゲルの総数、VI はマイクロゲルの体積です。平均マイクロゲル密度を測定するために、まず脱イオン水を用いて 7、6、5、4、3、および 1% のデキストリン溶液を調製します。デキストリン溶液の密度をここに示します。次に、7% デキストリン溶液 2 mL を 15 mL 遠心チューブに加えます。

次に、6% dextrin溶液2 mLをゆっくりとピペッティングし、7% dextrinの上に明確な層を形成させます。5分後、次の層として5% dextrinを2 mL加え、dextrin濃度が低くなる順に各濃度のdextrinが層状になるまでこの操作を繰り返します。その後、1% dextrin溶液の上にマイクロゲルを慎重に重層し、この勾配を5 °C、4,000 ×gで10分間遠心分離します。

次に、マイクロゲルの位置を可視化し、層間の位置に基づいてマイクロゲルの密度を算出します。マイクロゲルの膨潤質量を測定するには、まずマイクロ遠心チューブの重量をあらかじめ測定し、そこにマイクロゲルを1 mL加えます。各洗浄の間に、脱イオン水でマイクロゲルを5回洗浄してください。

最後の洗浄後、マイクロゲルをペレットにするため、サンプルを4,000 ×gで10分間遠心分離します。これらを脱イオン水に再懸濁し、最低48時間膨潤させます。48時間後、膨潤したマイクロゲルを4,000 ×gで10分間遠心分離し、上清をすべて取り除きます。

次にサンプルを秤量し、湿重量を記録します。正確な湿重量が得られたら、マイクロゲルを－80 °Cで凍結させ、その後凍結乾燥させて水分を除去し、乾重量を求めます。すべての水分が昇華した後、ここに示す式を用いてマイクロゲル中の水分量およびポリマー含有量を算出します。ここで、MSはマイクロゲルの湿重量、MDは乾重量です。

さまざまな分子量の20% PEGを用いて形成されたPEGマイクロゲルの平均直径をここに示します。UV照射時間の延長もマイクロゲルの直径に影響を及ぼしました。UV照射時間が増加するにつれて、ここに示した3つの処方すべてにおいて直径が増加しました。

デキストラン勾配で測定した密度は、前駆体peg分子の分子量が増加するにつれて減少しました。これは含水率のグラフでも確認されており、分子量の高いpegほど、ポリマー1gあたりの水分量が多いことが分かりました。最後に、マイクロゲルに蛍光標識したタンパク質を充填できることを示すため、重合前にアルブミンを混合物に添加し、球体内部に封入させました。

蛍光標識タンパク質の濃度を上げると、球体の多分散指数は上昇しましたが、平均サイズは一定に保たれました。この手順を行う際は、すべての溶液を37°Cに加熱すること、および洗浄やイメージング用スライドの調製時に凝集塊を分散させるため、マイクロゲルを十分にボルテックスすることに留意することが重要です。本手順に続き、薬物放出の影響に関するさらなる疑問を解決するために、薬物封入のための追加手法を実施することが可能です。

このビデオを視聴することで、沈殿反応を用いて穏やかな条件下でpeg DAマイクロゲルを作製する方法について、十分に理解することができます。