メンブレン極性膜完全性、細胞内イオン濃度の監視の変更肺炎球菌蛍光染料を使用

次の実験の全体的な目標は、蛍光色素を利用して、細菌系の膜ダイナミクスと細胞内イオン濃度の変化を監視することです。これは、まず、細菌の成長期に目的の蛍光細胞をインキュベートし、それが膜全体で平衡化するまでインキュベートすることによって達成されます。次に、細菌を選択した薬剤で処理し、その蛍光をモニターします。

その結果、指示色素の蛍光の観察された変化に基づいて、膜脱分極、膜完全性、および細胞内イオン濃度の変化を示すことができます。真核生物系で使用されるパッチクランプのような従来の電気生理学技術に対するこの技術の主な利点は、蛍光灯を使用して細菌の膜ダイナミクスと細胞内イオン濃度の変化を監視できるようになったことです。一般的に、この方法に不慣れな人は、色素濃度を最適化するためにある程度の努力が必要なため、苦労するでしょう。

ローディング条件と検出設定 まずは細菌細胞から始めます。洗浄液でペレット化しただけで、まずペレットを少なくとも1ミリリットルのPBSに再懸濁し、1ミリリットルあたり1億CFUで、これは5つのサンプルに十分です。洗浄した細胞の1ミリリットルをマイクロ遠心チューブに移し、1モルフィルターの25マイクロリットルを追加します。

滅菌したグルコースのストック溶液を、細胞を摂氏37度の加熱ブロックで15分間インキュベートします。添加されるグルコースは、実験によって異なる場合があります。15分後、50マイクロモルの立ち枯れを5マイクロリットル、PI溶液を10マイクロリットル加えます。

細胞を数回ピペッティングして、細胞を完全に混合します。次に、この細胞懸濁液を透明な96ウェルプレートの5つのサンプルウェルに分割します。プレートを、立ち枯れNP検出用のプリウォームプレートリーダーセットにロードします。

次に、読み取り値が処理前の値に安定するまで、30〜40分にわたって1分に1回測定することにより、細胞膜上の立ち枯れ平衡を監視します。次に、プレートを排出し、選択した実験剤を追加します。すぐにプレートをリーダーに戻し、必要な時間、ダイバックとPI蛍光のモニタリングを続けます。

この手順でローディングバッファーを準備するときは、PBSとProbenecidを追加する前に、必ず短時間ボルテックスしてください。これらの溶液を加えた後、再度ボルテックスし、ホイルで包み込み、2 x セル懸濁液の 1 ミリリットルに包みます。2×ローディングバッファーを1ミリリットル追加します。

これは10個のサンプルに十分です。混合物を摂氏37度のウォーターバスで75分間インキュベートし、これらすべてのアッセイを通じて光から保護します。色素の濃度とインキュベーション時間は、特定の細菌種やその他の実験システム変数に応じて、アッセイとベースライン蛍光検出レベルを最適化するために調整する必要がある場合があります。

インキュベーション後、洗浄ごとに細胞を3回洗浄します。細胞を2,400Gで10分間ペレット化し、1つのxプロニックを含む2ミリリットルのPBSに再懸濁します。3回の洗浄後、細胞を摂氏37度でさらに30分間インキュベートします。

これにより、細菌内のエストロが色素のエステル基を加水分解し、細胞内で色素を活性化させることができます。次に、細胞はスナットを除去し、1 x プロベネシドを含む2ミリリットルのPBSにそれらを懸濁します。必要に応じて、グルコースを再び追加して細菌を再活性化し、各サンプルごとに200マイクロリットルの細胞を96ウェルプレートの1ウェルにロードし、プレートを1つのサンプルのプレウォームリーダーにロードすることができます。

まず、適切な波長で、1秒間に1秒あたり1回の読み取り値でベースラインの読み取り値を確立します。次に、プレートを取り外し、選択した処理の約5マイクロリットルを追加します。ということ。

よくすぐにピペットで数回上下させて治療を混ぜ、すぐにプレートをリーダーに戻します。必要な時間、測定を続けます。データを分析するには、値を 1 x 値 2 で割って各時点の蛍光値の比率を計算し、比率の値をグラフにプロットします。

調製では、pH 6.5 から 8.0 の範囲の 5 つまたは 6 つの高カリウム緩衝液を作成します。前の手順と同様に、ボルテックスを使用して、中対数相培養洗浄液から2 x loadingバッファーを調製し、細胞を濃縮します。次に、SNATを2ミリリットルのBSと交換して、4xセル懸濁液を作成します。

4 x セル懸濁液の 1 ミリリットルと 2 x ローディングバッファーの 1 ミリリットルを組み合わせます。次に、細胞を摂氏30度の水浴中で40分間インキュベートします。光から守ってください。

次に、細胞を3回洗います。前に示したように細胞をペレット化します。2つのxプロップベナンと1ミリモルグルコースを含む4ミリリットルのPBSを再び加え、3回の洗浄後に遠心分離を繰り返します。

細胞を摂氏37度でさらに5分間インキュベートします。バックグラウンド蛍光フィルターを決定するには、通電した細菌懸濁液の約500マイクロリットルを滅菌して細菌を除去します。次に、200マイクロリットルの濾液を96ウェルプレートに移し、そのウェルからの吸収を1分間測定します。

in vivo検量線を取得するには、ロードして通電した細胞の500マイクロリットルALIワットをスピンダウンし、蘇生します。それらを各サンプルに異なるpHの一連の高カリウム緩衝液に懸濁し、20マイクロモルのリシンを加えます。これにより、細胞の細胞内pHが周囲の緩衝液のpHに平衡化されます。

次に、サンプルを摂氏37度で5分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルをプレートリーダーの96ウェルプレートに移します。各サンプルの蛍光を数分間測定して、各サンプルの研究測定値を確立します。まぁ。

このデータを分析するには、バックグラウンド蛍光値を減算し、値を除算して蛍光値の比率を計算します。1 x 値 2 で、各 pH バッファーの比値をプロットし、細胞内 pH の変化を測定するための検量線を作成します。通電した細胞の200マイクロリットルのサンプルをプレートにロードし、5秒ごとに5分間蛍光を測定します。

同時に、1つのサンプルに10マイクロモルのCCCPを添加し、他のサンプルに目的の薬剤を追加します。CCCPは、細胞内pHを低下させるための時間整合陽性コントロールです。すぐにプレートをリーダーに戻し、5秒ごとに10分間蛍光測定を続けます。

追加のコントロールとして、すべてのサンプルに20マイクロモルのNIギャリソンを加えて、細菌のpHをバッファーのpHにさらに5分間平衡化します。膜の極性を調べる場合、細菌をダイバックして約40分間インキュベートして、色素が膜上で平衡化できるようにする必要があります。これは、蛍光が着実に減少し、横ばいになることによって示されます。

PIは平衡化を必要としませんが、立ち枯れとともに、膜破裂のモニタリングに役立ちます。極性と同時に、細菌の脱分極および破裂は、2つの蛍光シグナルの比率が計算され、この比率の増加または減少が細胞内カルシウムに対応する。PBFI amの場合、細胞内カリウムは蛍光比で測定されます。

細胞内水素は、B-C-E-C-F amの蛍光比を用いて測定されます。カルシウムを添加すると、イオノ4イオンマイシンカルシウムが細胞内に流れ込み、蛍光比が増加します。valmyの添加は逆の効果があり、カリウムが細胞外に流出し、蛍光比の低下によって示されます。

B-C-E-C-Fは、細胞内pHの測定を可能にし、最初に既知のpHの様々な緩衝液で検量線を作成します。染料の蛍光比の低下は、pHの低下に対応します。これは、力CCCPのプロトンの追加、黒い線、およびプロトン駆動力ディシペーターの追加後の青い線で見られます。

2本目の矢印は、細胞内および細胞外の水素濃度を平衡化するニッシンの添加を示しています。このビデオを見れば、細菌細胞内の膜脱分極、膜の完全性、およびイオンの細胞内濃度を測定する方法について十分に理解できるはずです。また、このプロトコルを出発点として、他の特性や細菌細胞を研究することもできます。