Name: 皮膚からのI型コラーゲンの調製のための改良された方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-21T22:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: 学ぶ皮膚試料からI型コラーゲンを3時間未満で迅速に精製する改良法。酢酸ナトリウム処理とクエン酸緩衝液抽出を用い、従来の10日間から大幅に短縮し、組織工学や再生医療研究への応用を促進する。

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この作品は、国立衛生研究所（DBCにHL068915）、（CAP）のスラッシャー研究基金からの新しい研究者賞、補助金、米国心臓協会（DBCへ12GRNT11910008）からの研究助成金によってサポートされていました（DBC）は、ボストン小児病院の心臓伝導基金、ライアンファミリー基金への寄付、そしてデビッド·プルマンによる子供の心臓財団からの研究助成金。

ここでは、子羊の皮からCOL1の分離のデモンストレーションを行います。書かれたように、このプロトコルはまた、正常ウサギおよびヒトの皮膚からCOL1を単離するために使用することができる。 1。皮膚のサンプルを準備します<ol><li>使用前に4℃にすべての試薬を平衡化させます。 </li><li>氷のように冷たいのdH 2 O中で真皮サンプル（25〜g）をすすぎ、脱毛クリームを持つウール、毛皮、または髪を削除します。 </li><li>結合組織および脂肪のサンプルクリーンをこすりするために単一のエッジかみそりの刃を使用してください。 </li><li>氷のように冷たいのdH 2 Oのサンプルをすすぐ</li><li>シングルエッジかみそりの刃で1センチメートル×1センチの部分に皮膚サンプルをスライス。 </li></ol> 2。非コラーゲン可溶化物質を除去<ol><li>サンプル50ミリリットルあたりのコニカルチューブの5グラムを秤量し、氷冷した0.5 M酢酸ナトリウム30ミリリットルを追加します。 </li><li>ベンチトップホモジナイザー中で50mlのチューブアダプタを使用して6m /秒の設定で1分間チューブを混合する。 </li><li> SUPを破棄7酢酸ナトリウムの洗浄サイクルの合計ernatant繰り返し。 </li><li>氷のように冷たいのdH 2 Oの中に試料をすすぎ、残留酢酸ナトリウムを除去するために、一度ミックス。 </li><li>過剰な液体を除去した後、新しい50mlコニカルチューブに転送するためにチューブの側面に対してサンプルを圧縮するヘラを使用しています。 </li></ol> 3。私コラーゲンの抽出を入力<ol><li>試料を圧縮し、各洗浄後に上清を捨てベンチトップホモジナイザーで6m /秒で1分間ミリリットル/ gの2倍のサンプルを洗浄0.075 Mクエン酸ナトリウム緩衝液。 </li><li>サンプルに0.075 Mクエン酸ナトリウム緩衝液の新鮮な2ミリリットル/ gのアリコートを追加します。 </li><li>各サイクルの間にバッファを削除せずに6連続した1分、攪拌の6メートル/秒のベンチトップホモジナイザーミックスサイクルを実行します。 </li><li>コレクションチューブに厚く、透明な上澄みを転送します。 </li><li>サンプルにミリリットル/ g、さらに1 0.075 Mクエン酸ナトリウム緩衝液を加え、1の最終ベンチトップホモジナイザー胸焼けを行うクル。 </li><li>コレクションチューブにこの最終上清を追加します。 </li><li>遠心機で4℃で10分間、3,200×gで回収チューブ</li><li>分子量100,000の最上部のコンパートメントに上清を移し、遠心フィルター装置を遮断。 </li><li> 4℃で30分間3200×gで遠心分離</li><li> 4℃のクリーンコニカルチューブおよび格納するために上部コンパートメントから精製されたCOL1を転送</li></ol>

<ol><li>Nageotte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+fibrillaire+in+vitro+du+collag%C3%A8ne+dissous+dans+un+acide+dilu%C3%A9%5BTitle%5D)+AND+%22CR+hebd.+s%C3%A9ances+Acad.+Sei%22%5BJournal%5D)">Coagulation fibrillaire in vitro du collagène dissous dans un acide dilué.</a> CR hebd. séances Acad. Sei. 184, 115 (1927).</li>
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<li>Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-coated+cellulose+sponge%3A+three+dimensional+matrix+for+tissue+culture+of+Walker+tumor+256%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256.</a> Science. 155, 1259-1261 (1967).</li>
</ol>

著者らは、開示することなく、競合する金融利害関係はありません。

この方法の重要な要素は、過剰な液体を除去し、皮膚のサンプルを繰り返し効率的な圧縮です。これは、試料を圧縮することによって、ステップ2.5においてできるだけ酢酸ナトリウムを除去することが重要である。我々は、チューブの側面に対して皮膚を圧縮するためにスパチュラを使用しているが、チーズクロスを使用することもできる、これがチューブからのサンプルの除去を必要とし、これらのステップを実行するために必要な時間を増加させるだろうが。同様に、クエン酸ナトリウムの体積は、その後の抽出工程において正確であるように、ステップ3.1でサンプルを圧縮することが重要である。適切にこれらのステップのいずれかで試料から液体を除去しないと、最終的なCOL1収率に有害な影響を有するであろう。この議定書のもう一つの重要な要素は、4℃で、すべての試薬を維持することであるこれは、酸可溶化COL1の効率的な抽出を保証し、コラーゲンの凝固を防ぐことができます。さらに、プロシージャは、すべて使用して実施することができる無菌環境下で無菌の試薬。これは、ヒトにおける使用のためCOL1を単離するために、このメソッドを使用することを望む人のために特に重要であろう。 COL1の多くの商業的供給源...

何十年もの間、研究者や商業ベンダーが使用することができる組織化されたCOL1原線維のマトリックスの再懸濁、その結果中​​和し、単純な酸抽出プロトコルのいくつかのバリエーションを使用して皮膚や腱などの組織源の品揃えから可溶化COL1を単離した生物医学的応用1-4多数のため。 col1の臨床応用の多くの例がありますが、このタンパク質の調製は5-7を実行するために数日から数週間を取って長々抽出を必要とするので、これらのいくつかは自家由来COL1を採用しています。その結果、研究調査官や医師は、一般的には、ラット、ウシ、またはブタ真皮などの非ヒト組織を用いたか、死体から摘出皮膚を使用したり、男性の割礼に従って製造されたCOL1の高価な、市販製剤を使用しています。再生アプリケーション、固体形成する能力に関して、これらの製品の多くの展示可変性マトリックスまたは細胞の付着および成長を支持することが可能な組織構築物。そのため、すぐにアクセス可能で、豊富な自家組織源からCOL1を抽出するために設計された新しい標準化された方法のための明確な必要性がある。 そのような方法は、COL1は、関心のある動物モデルから抽出したコラーゲンベースの足場上で組み立て設計組織の前臨床試験を使用することができる研究環境で、時間とコストの両方を節約することになる。同時に、診療​​所で急速に分離された、自家由来COL1を使用するオプションを有する他の方法で同種または異種の準備を受け取ることになる患者のための全体的な安全性を増加させるであろう。自家調製を受けている患者の場合、この方法は非常に合理化された生検収集およびコラーゲンアプリケーションとの間の間隔を減少させるであろう。これらの理由から、我々は、高速AGを使用して、長い確立COL1の単離および精製方法を改善しようとしたitationおよびサイズ​​排除遠心分離。この方法は、多くの研究室で見られる標準バッファーと装置を使用して実行するのは簡単です。高速攪拌を用いることにより、我々のプロトコルは3未満〜8時間、約10日から可溶性、皮膚COL1を単離するために必要な時間を短縮する。重要なことに、この方法は、容易な手順の単一のセット中の患者に使用するための自​​家由来するCOL1を調製するために臨床設定で行うことができる。

<table><tbody><tr><td>FastPrep-24 System</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離</td>機<td>ベックマン</td><td>J6-MI</td><td>スイングバケットローターは、3,200 x gで50 mlのコニカルチューブに対応します。</td></tr></tbody></table>

皮膚からのi型コラーゲンの調製のための改良された方法

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

水溶性タイプ1コラーゲン（COL1）は、細胞培養用の接着基質として、再生アプリケーションのための携帯足場として広く使用されています。臨床的に、このタンパク質は、広く美容外科、皮膚注射、骨移植および再建手術のために使用される。これらの手順のcol1のソースは、炎症や拒絶反応の可能性だけでなく、生体異物疾病伝播を増加させる、一般的にヒト以外である。そこで、効率的かつ迅速に自家由来組織の限られた量からCOL1を精製する方法は、これらの問題の多くを回避するであろうが、標準の単離プロトコルが長いであり、多くの場合、コラーゲン様組織を大量に必要とする。ここでは、約10日から約3時間後に、このタンパク質を単離および精製するために必要な時間を短縮し、効率的なCOL1抽出方法を示す。我々は、多くの外科的処置の際に、その利用可能性の我々の組織源として真皮を選びました。 T彼の方法は、真皮、少量から高純度、溶解性のCOL1を得るための強力な撹拌及び遠心濾過と組み合わせた伝統的な抽出バッファを使用しています。簡潔には、皮膚生検、脂肪、結合組織、毛髪を除去した後、氷冷のdH 2 Oで十分に洗浄する。皮膚サンプルを0.5 M酢酸ナトリウムおよび高速ベンチトップホモジナイザーを用いて非コラーゲン性タンパク質及び多糖類から取り除かれる。残留固形物由来のコラーゲンは、その後、ホモジナイザーを用いて0.075 Mクエン酸ナトリウム緩衝液で抽出する。これらの抽出物は、100,000 MWカットオフ市販品または従来の手順を用いて得られたものと同等以上の品質のCOL1製剤を得る遠心フィルタを使用して精製される。我々は、この方法では、研究と臨床応用の多数のための自家由来COL1の利用を容易にするであろうと予想している。

このCOL1単離プロトコールは、完了するのに約2時間と15分が必要です。図1は、この手順の主なステップを概説する概略図を示す。試料を調製し、高速攪拌回転の7サイクルを実行し、酢酸ナトリウムでリンスすると、約35分（図1A-C）をとる。 1の攪拌を実施するとDH 2 Oですすぎサイクルは約5分（図1Dおよび1E）を取ります。クエン酸ナトリウムを加えて、攪拌の6サイクル行った1攪拌とすすぎサイクルにサンプルを供して、約45分（図1F及び1G）を取ります。液体抽出物から残った固形物を遠心分離すると、15分（図1H）を取ります。最後に、フィルタ装置にサンプルを移送し、精製、可溶化COL1を濃縮し、小さなタンパク質を除去するために、別の遠心分離工程を行う30分かかります（図1Iおよび1J）。最終生成物は、更にをNa 2 HCO <sub...

水溶性タイプ1コラーゲン（COL1）を単離するための伝統的な手続きが原因に長いバッファインキュベーションおよびフィブリルの面倒な再懸濁の開始から終了まで約10日を要する。ここでは、3時間未満の小さな皮膚生検からCOL1を精製するための手段を記載する。

皮膚からのI型コラーゲンの調製のための改良された方法

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

本手順の全体的な目的は、真皮サンプルからI型コラーゲンを迅速に単離することです。まず、真皮サンプルを小さく切断します。次に、真皮サンプルを酢酸ナトリウム中で急速に撹拌することにより、非コラーゲン性の可溶性タンパク質および多糖類を除去します。次に、酢酸ナトリウムの痕跡をすべて取り除くため、サンプルを水で洗浄します。最終ステップでは、クエン酸緩衝液を用いて真皮サンプルからI型コラーゲンを抽出し、遠心分離によってサンプルから残りの固形物を除去した後、使い捨て遠心分離デバイスを用いてろ過し、最終産物を濃縮します。最終的に、この濃縮液からI型コラーゲンをさらに重合させることができます。既存の手法に対する本手法の主な利点は、真皮サンプルからのI型コラーゲンの単離時間を1週間以上から3時間未満に短縮できる点にあります。まず、25〜50 gの真皮サンプルを氷冷蒸留水で洗浄し、次に除毛クリームを用いて羊毛、獣毛、または毛髪を除去します。次に、片刃カミソリを使用して、サンプルから結合組織と脂肪をかき出して除去し、さらに氷冷蒸留水でサンプルをすすぎます。その後、カミソリを用いて皮膚サンプルを1 cm四方の断片に切り分けます。非コラーゲン性の可溶性物質を除去するために、まず50 mLコニカルチューブ1本あたり5 gのサンプルを量り取り、各サンプルに氷冷した0.5 M酢酸ナトリウムを30 mL加えます。次に、50 milliliterチューブ用アダプターを使用し、ベンチトップホモジナイザーを用いて6 meters per secondの設定でチューブを混合します。1分後、上清を除去し、さらに氷冷した酢酸ナトリウムを加えてサンプルを再度混合します。これを合計7回の洗浄サイクルまで繰り返します。最後の洗浄後、サンプルを氷冷した蒸留水でリンスし、残留した酢酸ナトリウムを除去するためにもう一度サンプルを混合します。次に、スパチュラを使用してサンプルを各チューブの壁面に押し付け、余分な液体を除去します。その後、コラーゲンを抽出するため、各サンプルを新しい個別の50 milliliterコニカルチューブに移します。続いて、ベンチトップホモジナイザーを用いて、2 mL/gの0.075 molarクエン酸ナトリウム緩衝液中で、6 m/sで1分間、サンプルを2回洗浄します。各洗浄後には上澄み液を捨て、先ほど示したようにサンプルを押し付けます。2回目の洗浄後、各サンプルに新しいクエン酸ナトリウム緩衝液の分注液を加え、緩衝液を除去せずに、6 m/sで1分間の撹拌サイクルを6回連続で行います。ここで、粘性のある透明な上澄み液を個別の回収チューブに移し、上澄み液にさらに1 mL/gの0.075 molarクエン酸ナトリウム緩衝液を加え、最後に1回撹拌サイクルを行います。これらの最終上清を回収チューブに加え、3

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Bioengineering

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このプロトコルの目標は、自然な肌に似た3次元の全厚の皮膚等価物を構築することです。特別に構築された自動創傷装置により、無菌状態を維持しながら、正確で再現性のある創傷を生成することができます。...

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マイクロ流体デバイス内での機能的な微小組織の作成には、従来の細胞培養技術をマイクロデバイスの限られた空間次元に適応させることにより、細胞表現型の安定化が必要です。コラーゲンを改質することで、肝細胞などの初代細胞をマイクロ流体組織モデルとして安定化させることができる極薄のコラーゲン集合体を層ごとに堆積させることができます。...

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幹細胞にロードされたキトサンミクロスフェアの配信のためにコラーゲンハイドロゲルの構築

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