イメージングと免疫組織化学のための網膜ホールマウントの準備のために最適化されたプロトコル

この手順では、マウスの網膜組織を用いて、構造的完全性を維持するために繊細な神経組織をどのように安定化させるかを実演します。免疫組織化学染色のいくつかのステップにおいて、まず眼球の摘出を行い、角膜を除去して網膜を強膜から分離します。その後、網膜の眼杯に切開を加え、組織を平坦にします。

次に、組織の完全性を維持するため、直接的な操作を避け、吸引転送を用いて網膜をリング補強膜に固定します。その後、染色を行うためにリングをマルチウェルプレートに転送します。我々の結果は、この手法が生体組織に効果的に適用でき、従来の網膜解離の取り扱い方法と比較して、シナプス蛋白質のイメージングに優れた基板を提供することを示しています。

これらの手法により、物理的な操作を最小限に抑えて繊細な組織を移送することが可能になります。これにより、変形や損傷の可能性を低減できます。このアイデアは、網膜変性のモデルであるRD1マウスのフラットマウント組織から記録を行う必要があった際に考案されました。このマウスの網膜は、変異による広範な細胞消失のため、極めて薄く脆弱です。

当研究室のポストドクターが、私と共に手順の実演を行います。まず、麻酔をかけたマウスの眼球を摘出し、酸素飽和させたヘップス緩衝リンガー液に転送します。角膜を除去するには、ピンセットで角膜輪部を保持し、鋸状縁に沿って円周状に切開します。

ボーラス注入および電気生理学的記録のため、ピンセットで水晶体を取り出します。エッジを丸めたピンセットを使用し、可能な限り多くの硝子体を 제거します。次に、ピンセットで強膜をしっかりと保持し、アイカップを固定します。

2組目のピンセットを網膜とアイカップの間に配置します。ピンセットを円周に沿ってゆっくりと動かします。網膜とアイカップの間で視神経を切断し、ハサミでアイカップを取り除きます。

網膜の外周から視神経に向かって切開を入れます。あるいは、網膜全体を使用する場合は、ホルダーを短くするために、外周から視神経の中間点まで切開を入れます。不要な部分は旋盤で取り除いてください。

次に、目の細かいサンドペーパーで粗い表面を研磨します。リングの下から脚を取り除きます。プラスチックピペットの細い先端部分を切り取ります。

次に、少量の溶液とともに組織をメンブレンに移動させます。網膜を広げながら溶液を徐々に除き、組織を展開します。そして、神経節細胞が上を向くようにして、網膜をメンブレンに固定します。

1 mLシリンジの保持チップを切断し、組織の直下に配置します。プランジャーを約0.3 mLの容量まで引き戻し、膜の中に組織を物理的に組み込みます。抵抗値を約1 MΩに設定し、ホウケイ酸ガラス製キャピラリーピペットをプルします。

次に、各パッチピペットの先端を慎重に折ります。続いて、HEPES緩衝リンガー液 10 µL に、セレクトインストック染色溶液 0.3 µL を加えます。そして、温めて酸素飽和させた HEPES 緩衝リンガー液で灌流している記録室に膜を配置します。

マイクロマニピュレーターを用いて、色素の入ったピペットを内境界膜に当てます。さらにピペットを進めて内境界膜を貫通させます。その後、標的とする1箇所または複数の箇所に染色液を注入します。

次に、エピ蛍光照明下で観察しながら、注入後の組織を10分間静置して回復させます。必要に応じて、インサートをガラスボトム培養皿に移し、網膜側を下にして配置します。標本を湿潤に保つため、ヒープ溶液を1滴加えます。

また、プラスチック製リングの周囲に真空 그리스を3箇所に塗布し、インサートを培養皿にしっかりと固定します。固定後、皿を顕微鏡ステージに移動させ、メンブレンをスクロース密度勾配溶液に浸します。その後、プラスチック製インサートリングからメンブレンを切り出します。

Kimwipesを用いて溶液を可能な限り取り除き、網膜面を上にしてパラフィルムの上に置きます。組織が載ったパラフィルムをクライオスタットのチャンバーに移し、OCTコンパウンドを1滴加えます。急速凍結装置を使用して凍結を促進させます。

凍結サンプルを剥がし、裏返します。次に、余分な凍結OCTを切り落とします。サンプルの周囲3辺には約2mmを残し、ホルダーに固定する側からは数mm残るようにしてください。

露出した網膜側にOCTを1滴垂らして覆い、付着している部分は除いておきます。網膜組織を含む膜を凍結させます。冷却したホルダーリングの上にOCTを1滴垂らします。

凍結試料を直ちにドロップに挿入します。-19 °Cで10〜20 µmの厚さに切片を作成し、温めたポリリジンコートスライドガラス上に配置します。切片を貼り付けたスライドガラスを、41 °Cの加熱プラットフォーム上に2〜3分間、暗所で静置します。

その後、サンプルを-20 °Cで保存します。この実験では、網膜の血管系が複数の網膜層にわたる精緻な血管ネットワークであることを、迅速かつ簡便に特性評価する方法を示しています。iso-selectinのボーラス投与とsulforhodamineによる浸漬標識を組み合わせることで、生体組織を網膜内でほぼ即座に可視化およびスキャンすることができ、表層から深層までの血管を標識することが可能です。

比較的拡散しやすいSRHとは対照的に、セレクチンは内境界膜を十分に透過しません。シナプス蛋白を標識する場合、パラホルムアルデヒドによる従来の固定法よりもカルビミドによる固定の方がいくつかの利点があります。例えば、カルビミドで短時間固定した後、IPLにおけるシナプスマーカーPSD 95の免疫蛍光染色を行うと、個々のシナプスを識別できる明るい点状の形態が観察されました。

対照的に、従来のパラホルムアルデヒド固定液を使用した場合は、シナプス成分の同定が不明確になります。網膜のクライオスタット切片においても同様の結果が得られました。このビデオを視聴することで、繊細な組織をこのメンブレン上にマウントする方法と、作製した標本に細胞化学染色を適用する方法について十分に理解できるはずです。

網膜をフィルターに固定するのに15分かかります。