長期的な慢性緑膿菌気道感染

この手順の全体的な目標は、マウスで持続的な長期の慢性シュードモナス好気性気道感染を確立することです。これは、最初に選択したシュードモナス好気性細菌株を培養することによって達成されます。第2ステップは、50°Cで細菌を寒天や鉱物油と混合し、4°Cでゆっくりと連続的に攪拌しながら冷却することで、小さな寒天ビーズに細菌を埋め込むことです。

次に、鉱油をPBSで数回洗浄して除去し、寒天ビーズのアリコートを均質化して寒天プレートにメッキします細菌含有量を決定するために、最後のステップは、マウスの気管に数マイクロリットルの寒天ビーズ懸濁液を注入して、慢性的なシュードモナスエアロゲン肺感染症を確立することです。最終的には、気管支肺胞洗浄液と肺をチャレンジとは異なる時点で回収し、寒天プレートに播種して、慢性感染マウスの割合と生存マウスの電波中の細菌量を検出することができます。これらのagaビット法が既存の方法よりも優れている点は、マウスの高割合で安定した長期慢性感染を可能にし、最大1ヶ月間の安定した細菌負荷の持続につながることです。

AGAビット法は、マウスの肺にマイクロ好気性条件を提供し、細菌がマイクロコロニーの形で増殖することを可能にします。嚢胞性線維症患者の粘液の増殖と同様に、これらの方法は、研究者が嚢胞性線維症やその他の呼吸器疾患の病因に関する重要な問題に取り組み、シュードモナスギン慢性肺感染症に対する新しい治療法をテストするのに役立ちます。この方法は、他の病原体との慢性感染を達成するためにも使用することができます バーXOアパッチまたはブドウ球菌アイリス 異なる病原体との同時感染や競争実験も可能です 手順がフェノ、ポスドク、およびカミル・リバ、マウスチャレンジの3日前に私の研究室の博士課程の学生のいずれかになることを示す実験も可能です。 マイナス80°Cのストックカルチャーからシュードモナス空気源でいっぱいのループを接種し、トアイ大豆寒天プレートを試し、摂氏37度で一晩インキュベートします。

その翌日。5ミリリットルのトライトアイ大豆ブロスで接種した単一のコロニーを選び、摂氏37度で200RPMの振とうインキュベーターで一晩インキュベートし、翌朝、リン酸緩衝生理食塩水で細菌の一晩培養の小さなアリコートを1〜50で希釈します。次に、600ナノメートルで光学密度を測定します。

次に、37°Cで約3〜4時間インキュベートした新鮮なTSBの20ミリリットルを含む新しいチューブに細菌懸濁液の2つのODを加えて、一晩の細菌培養物を希釈し、合計10〜50ODに達するまで200RPMで振とうインキュベーターで段階をログします。Pseudomonas aerosaが対数期に達したら、摂氏4度で15分間の重力、2,700倍の遠心分離によって細菌細胞を収集し、上清を捨てます。その後は。

Resusは、細菌ペレットを1ミリリットルの滅菌PBSに懸濁し、完全に渦巻いて完全に再懸濁します。次に、1ミリリットルの細菌懸濁液と、摂氏50度に事前に平衡化した9ミリリットルの液体TSAを混合します。この混合物を摂氏50度の予温重油に加えます。

すぐに室温で6分間撹拌します。攪拌は、オイル中に目に見える渦を生じさせる必要があります。続いて、混合物を摂氏4度に冷却し、最低速度で35分間撹拌します。

その後、さらに20分間氷で休ませます。その後、寒天ビーズを50ミリリットルのファルコンチューブに移し、2, 700回遠心分離します。摂氏4度で15分間の重力

鉱油を正確に除去し、寒天ビーズペレットを滅菌PBSで洗浄します。3回の洗浄後、手順を6回繰り返します。ビーズは、最後の洗浄後に遠心分離機を使用する代わりに、重力によってペレット化することができます。

寒天ビーズを20〜30ミリリットルのPBSに再懸濁し、0.5ミリリットルのビーズを無菌的に均質化します。次に、均質化されたビーズの100マイクロリットルを滅菌PBSの900マイクロリットルで希釈し、連続して希釈します。ビーズを10からマイナス6まで6倍に1対10の比率で希釈します。

次に、TSAプレート上のプレートの連続希釈を未希釈液を含めて行います。10からマイナス6度までサンプルを採取し、プレートを摂氏37度でインキュベートします。倒立型光学顕微鏡を使用して、いくつかの分野でビーズの直径を測定します。

ビードの直径は、マウスが挑戦する前に100〜200ミクロンである必要があります。寒天ビーズ懸濁液中のミリリットルあたりのCFUの数を決定するために、TSAプレート上のコロニー形成単位の数を数えます。次に、寒天ビーズの容量を1ミリリットルあたり10〜7番目のCFUの2〜4倍に調整して、50マイクロリットルで1〜2倍10〜6番目の最適な接種物に到達します。

以前にケタミンとキシラジンで麻酔した6〜8週齢の雄マウスを温熱パッド上の仰臥位に置き、70%エタノールでそのコートを消毒します。皮膚を垂直に切り傷して気管を露出させます。次に、ピンセットを使用して、気管を覆っている筋肉を分離します。

次に、1ミリリットルの注射器で最大50マイクロリットルの寒天ビーズ懸濁液を取ります。その後、カテーテルで気管を挿管し、寒天ビーズ懸濁液入りの1ミリリットルシリンジをカテーテルに取り付けます。シリンジのプランジャーをそっと押して、ビーズが肺に埋め込まれ

次に、縫合糸クリップを使用して切開部を閉じます。この手順では。安楽死させたマウスを仰臥位に置き、70%エタノールで被毛を消毒します。

次に、皮膚の垂直カットによって気管と胸郭を露出させます。その後、横隔膜を切って肺を露出させます。ピンセットを使用して気管の下に縫合糸を挿入し、カテーテルで気管を挿管します。

次に、縫合糸の両端を引っ張って、カテーテルを気管の周りの糸ではなく気管に結合します。次に、1ミリリットルのシリンジを使用して1ミリリットルの細胞培養培地を取り、カテーテルに取り付けます。シリンジのプランジャーを押して肺を洗い、すぐに液体を回収して15ミリリットルのチューブに保管します。

合計3ミリリットルの培地でこの手順を3回繰り返し、肺の収集と分析のために気管支肺胞洗浄液を氷上に保存します。マウスから肺を切除します。滅菌PBSですすいでください。

次に、ローブを分離します。それらを2ミリリットルの滅菌PBSが入った丸底チューブに入れ、氷上に保存します。肺を無菌的に均質化し、連続的に行います。

ホモジネートをPBSで1対10の比率で希釈します。次に、TSAプレート上の未希釈サンプルを含む連続希釈液をプレート化し、摂氏37度で一晩インキュベートします。氷からBAL流体を取り出し、逆光光学顕微鏡で1対2の比率でトルコ溶液でデュートします。

バーカー細胞カウントチャンバー内の細胞の総数をカウントし、BVAL 流体を重力 330 倍、摂氏 4 度で 8 分間遠心分離します。次に、上清を廃棄し、10%ウシ胎児血清を含有する細胞培養培地にペレットを1ミリリットルあたり100万細胞の濃度で再懸濁する。顕微鏡は、段ボール製のフィルターがその中心を向いた状態で、細胞回転の適切なスロットにスライドしてろ過します。

各サンプルの150マイクロリットルをシトシンの適切なウェルにピペットで注入し、重力300倍で5分間細胞遠心分離する。次に、スポットディファレンシャルカウントの染色を顕微鏡で行うことができる後、細胞のスポットを観察する必要があります。この図は、PA oh one 参照株と RP 73 によるシュードモナス好気性慢性感染の経時変化を示しています。

各時点の臨床ひずみ。ヒストグラムは、菌血症による死亡率を赤で、生存率を灰色で、感染を解消した動物の割合を白で、慢性感染を確立できた動物の割合を緑で表しています。シュードモナス・アエロゲンRP 73臨床株は、PA oh one実験室株と比較して、慢性感染症の確立においてより効率的である。

生き残ったマウスは指定された時点で安楽死させられ、肺を採取し、均質化してTSAプレートで培養し、細菌負荷を決定しました。マウス肺におけるP oh one株およびRP 73株の成長曲線は、感染後3日目の細菌量がRP 73と比較してP oh oneの方が多いことを示しています。次に、慢性感染が確立される7日以降、細菌負荷は、RP73臨床株による慢性感染の7日後に、両方の株について肺あたり10〜4番目および10〜5番目のCFUで安定し、BAL液中の炎症細胞動員を評価しました。

総白血球の数は、RP 73に感染したマウスでは、非感染マウスと比較してかなり多くなっています。最も多く見られる細胞は好中球であり、慢性感染に対する自然免疫系によるかなりの応答を示しています。下のボックスの矢印は、好中球と、細胞回転後のスライド上のスポットに見られるマクロファージを示しています。

ここに示されているのは、慢性感染の7日後のマウス肺の組織切片上のヘマチンとエオシンの染色であり、矢印で示されているrp.73臨床株ビーズは、細菌細胞の気管支内腔とマイクロコロニーで観察できます。感染した領域では、気管支と肺実質は、大量の炎症細胞の動員を特徴としています。

感染していないマウスの気道は炎症細胞から透明でしたが、 BESの直径と最終濃度は非常に重要な詳細です。良い結果を得るには、BEのサイズが冷却フェーズ中のステアリング速度に影響され、バクテリアの開始量がビーズの最終希釈に影響を与える可能性があることを覚えておくことが重要です。さらに、マウスの死亡率が低く、慢性感染症の割合が高い原因となる適切なシュードモナス株を選択することで、使用するマウスの数を最小限に抑えることができます。

マウスの感染後、細菌カウントが行われます。さらに、気管支VIRレベルでは、細菌感染に対する潰瘍反応を研究するために、液体サイトカイン分析、メロペルオキシダーゼアッセイ、および組織学的分析を行うことができます。シュードモナスのような日和見病原体を扱うと、あごひげを生やす可能性があり、手袋を着用する、バイオセーフティキャビネットの下で細菌を扱う、滅菌技術を使用するなど、常にアプリケーションを使用する必要があることを忘れないでください。

適切な動物モデルの開発により、新規の抗菌分子と抗炎症分子の前臨床試験が可能になりました。これは、嚢胞性線維症または他の呼吸器疾患に罹患した患者における肺感染症の将来の治療介入にとって重要なステップです。