Name: 胚前脳からの内皮細胞の単離および培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 学ぶ 胚前脳から内皮細胞を単離培養する方法。CD31マイクロビーズを用いた磁気分離で純粋な脳室周囲内皮細胞を得られ、血管新生と神経血管相互作用の研究に活用できます。

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この作品は、統合失調症研究のための国民の同盟とうつ病（NARSAD）若手研究者賞と米国立衛生研究所のAVにR01NS073635を助成金によってサポートされていました。

1。試薬および溶液の調製の<ol><li> 35mm培養皿のコーティング：コラーゲン1型溶液を、20mM酢酸（〜100mgのタンパク質/バイアル）中の水溶液として供給される。滅菌組織培養グレードの水を用いて0.01％の使用濃度にコラーゲン溶液の適切な容量に希釈する。 2〜8℃で、室温（RT）又は37℃で3-4時間、コラーゲン溶液1ml、または一晩でコートディッシュコー​​トディッシュから余分な溶液を除去し、それを一晩乾燥させます。メディアを追加する前に、組織培養グレードの水またはPBSでお皿を洗浄します。被覆皿1ヶ月間4℃で保存することができる。 </li><li>完全ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を準備します。 （;吸油量1 mlの1×濃度）を、10％FBSおよび抗生物質 - 抗真菌溶液でDMEM（500ml）に補う。完全DMEM 2ヶ月間4℃で保存することができる。 </li><li>アリコートをDNアーゼI（0.001 mg / ml）を有するDMEM（50 ml）を調製し、（Dと称されるMEM-DNアーゼI）。 </li><li>コラゲナーゼおよびディスパーゼ（DMEM-collagenase/dispaseと呼ぶ）（1 mg / ml）を含むDMEMの別のアリコート（10ml）に調製する。 </li><li> EGF（5μg）を、ECGS（100mg）および抗生物質 - 抗真菌溶液5μlを加えた内皮細胞培養培地（ECCM、500ミリリットル）を、準備します。 ECCM 2ヶ月間4℃で保存することができる。 </li><li>使用前にすべてのメディアを予熱し。 </li><li> 0.5％BSAおよび2mM EDTAを含むPBS、pHが7.2：精製緩衝液を準備します。冷緩衝を維持（2〜8℃）。 </li></ol> 2。終脳の胚および解剖の除去実験動物を用いて、全ての実験は、マクリーン病院の動物のケアと使用委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関するNI​​Hガイドラインに準拠している。 <ol><li>時限妊娠CD1マウス（胎生15日目）を使用します。膣栓の発見の日は、胎生0（E0）と考えられている。 CD1ダムは一般的に大規模なリットルを生産するため、10月12日胚Sは妊娠ダムから期待されている。 </li><li>子宮切開のために、ケタミン（100 mg / kgの）/キシラジン（5 mg / kg）を腹腔内注射で妊娠マウスを麻酔。マウス約20〜30 gで、10ミリリットル/キログラムケタミン/キシラジン麻酔液の0.3ミリリットルを提供し、その痛みや苦痛は麻酔薬の腹腔内注射時に最小限であることを確認してください。注射のために手の拘束を使用してください。 </li><li>足指のピンチで深麻酔をチェックしてください。深く麻酔したマウスから胚を取り出します。母親から除去すると、すぐに各胚を首を切る。氷冷PBS中の滅菌ペトリ皿に胚ヘッドを配置します。 </li><li> 2013版：麻酔薬の過剰投与（130 mg / kgのペントバルビタール、IP）、動物の安楽死のためのAVMAガイドラインと一致して安楽死させる方法、とすぐに安楽死により子宮摘出に従ってください。 </li><li>実体顕微鏡下で、細かいマイクロチップはさみや細かい鉗子で頭から脳を削除します。注：高品質の解剖イオンが正常胚の脳から軟膜膜を除去することが不可欠である。これは実施によって達成される。細かい鉗子とマイクロチップのはさみはまた、良好な解剖を取得するための重要なツールです。 </li><li>軟膜膜を剥がすために、脳やマイクロチップのはさみをしっかりグリップを得るために鉗子を使用してください。中脳と後脳を取り出して、終脳を分離します。氷の中の2ミリリットルPBSで35mm培養皿にすべての胚から軟膜フリー終脳を転送します。 </li></ol> 3。細胞単離<ol><li>メスの刃との1〜2mmの断片に終脳をミンチし、完全DMEM 2ミリリットルを含む15ミリリットルファルコンチューブ内の組織を収集します。 </li><li>塊が消え、乳白色の懸濁液が達成されるまで、1ミリリットルピペットで静かに徹底的に組織を解離する。 </li><li>遠心分離機は、室温で5分間800〜1,000×gで細胞を解離し。 </li><li>慎重にゆっくりとCEの関連付けを解除したDMEM-DNアーゼIの上清を再懸濁ペレットを削除LLS再度RTで5分間、800〜1,000×gでで1 mlピペット及び遠心分離機を用いて。 </li><li>暖かい完全DMEMにペレットを再懸濁。無菌70μmのナイロンメッシュを通してフィルタセル。フィルタリング細胞を収集し、氷中に保管してください。 </li><li>細胞部分がメッシュ上に保持され、RTで1〜2分間DMEM-collagenase/dispase（2ml）でさらに消化集める。室温で5分間800〜1,000×gの遠心分離によって、DMEM-DNアーゼIにセル3回洗浄します。ステップ3.5で収集フィルタリング細胞とこれらの細胞をプール。完全DMEMで一度全細胞を洗浄します。細胞数および磁気標識ステップを決定するために進んでください。注：これは、磁気標識の前に単一細胞懸濁液を得ることが重要である。 </li></ol> 4。磁気標識<ol><li>このプロトコルは、10 7個の細胞の磁気標識を示す。 10 7以上の細胞数が低いため、同じ試薬量および10 7を超える細胞数のために使うと、試薬容量と総容量のスケールアップこのため（ 例えば、2×10 7全細胞のために、すべての示された試薬の二倍のボリュームを使用します）。氷の中のすべての試薬および細胞を維持する。 </li><li>血球計数器で細胞数を決定します。 </li><li>室温で10分間300×gで遠心細胞懸濁​​液。完全に上清を吸引し。 </li><li> CD31マイクロビーズを10μlに続く細胞ペレットに精製緩衝液の90μl/107セルを追加。製造業者によって提供されるマイクロビーズ、抗マウスCD31のモノクローナル抗体をコンジュゲートされる。 </li><li>よく混ぜ、冷蔵庫で15分間インキュベートする。注：磁気標識の間より高い温度および/またはより長いインキュベーション時間は、非特異的結合をもたらし得る。 </li><li> 10分間300×gで精製緩衝遠心1-2エルフテックス7細胞を追加することで細胞を洗浄。上清を除去し、精製緩衝液500μl中に細胞を再懸濁。磁気分離または精製ステップに進みます。 </li></ol> 5。 PUrification <ol><li> MACSセパレーターの磁場中でMSカラムに配置します。 </li><li>精製緩衝液500μlでカラムを洗浄します。 </li><li>カラムに細胞懸濁液を適用します。高い細胞数が列を詰まらせる可能性があるMSカラムに適切な数の細胞をロードします。注意：各MSカラムは、2×10 7セルの最大数を収容することができ、より高い細胞数を、より多くの列を使用しています。 </li><li>収集および非標識細胞を含むフロースルーを捨てる。 </li><li>精製緩衝液500μlで3回カラムを洗浄。洗浄工程の間に、列のリザーバは、その後の精製緩衝液の一定分量を追加する前に空であることを確認してください。 </li><li> MACS分離器から列を削除し、15ミリリットルファルコンチューブの上に置きます。 </li><li>プランジ​​ャは、MSカラムと共に供給される。 MSのカラムにピペット精製緩衝液の1ミリリットル、すぐにしっかりと列にプランジャーを押すことにより、磁気的に標識した細胞を洗い流す。 </li><li>プレートCEL35mm培養皿上のlsは、コラーゲンタイプ1でプレコートし、95％O 2および5％CO 2、37℃に設定したインキュベーター中ECCM中の細胞を成長させる。 </li><li> 4日ごとに培地を変更します。料理がコンフルエントのとき10〜12日後に実験やサブカルチャーのためのPVECsを使用してください。 </li></ol> 6。 PV ECのサブカルチャー<ol><li> ECCMを取り外し、滅菌PBS、1〜2 mlのPVECSの単層をすすぎます。 </li><li>穏やかに細胞単層を覆うように、0.25％トリプシン-EDTA溶液1.5mlを加える。 </li><li>インキュベーターに料理を返します。 5-7分以内に、細胞は、皿の表面から剥離します。 </li><li>細胞が剥離した後、直ちにトリプシンインヒビター等量のを追加し、数回粉砕する。 </li><li>無菌15ミリリットルファルコンチューブに細胞を移す。 5分間500×gでチューブを遠心分離する。 </li><li>上清を除去し、予め温めECCMの1ミリリットル中にペレットを再懸濁します。 </li><li>文化、IMを拡大するために細胞を播種老化または他のアッセイ。 </li></ol>

<ol><li>Shen, Q., S, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+stimulate+self-renewal+and+expand+neurogenesis+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.</a> Science. 304, 1338-1340 (2004).</li>
<li>Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+system+to+study+interactions+between+endothelial+cells+and+neural+cells+of+the+developing+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system.</a> BMC Neurosci. 8, 3 (2007).</li>
<li>Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+primary+neural+progenitor+and+endothelial+cells+in+a+macroporous+gel+promotes+stable+vascular+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo.</a> 19, 1469-1485 (2008).</li>
<li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).</li>
<li>Vasudevan, A., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+embryonic+CNS%3A+a+new+twist+on+an+old+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh.+Migr%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale.</a> Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).</li>
<li>Won, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).</li>
<li>Dong, Q. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).</li>
<li>Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+colony+stimulation+factor-1+receptor+results+in+loss+of+microglia%2C+disrupted+brain+development+and+olfactory+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Young+neurons+from+medial+ganglionic+eminence+disperse+in+adult+and+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain.</a> 2, 461-466 (1999).</li>
<li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li>
</ol>

利害の対立が宣言されていません。

PVEC年代は、より生理学的に関連する神経血管の相互作用に焦点を当てた研究のための他の組織源からの大人の脳内皮細胞とのECよりもあり、また治療の可能性を持っている。 PVECの準備のためには、死んだ細胞は、CD31マイクロビーズに非特異的に結合することができるので、優れた実行可能性を達成するために、高速動作するように郭清を伴う重要な始まりです。単一細胞懸濁液は、従来の磁気標識工程により達成されていない場合も、これは、細胞塊がカラムの目詰まりの原因となるので、トラブルシューティングをもたらすであろう。この方法の利点は、磁気ビーズ、時間がかかり、EC製剤4,7用の磁気ビーズに基づく分離方法において使用されることがしばしば困難工程から細胞を剥離するために、トリプシンとのインキュベーションのために必要がないことである。さらに、この分離技術は、胚脳組織を大量に必要としない。 PVECのは一貫APPRの単一時限妊娠マウスを利用して製造することができるoximately、12日間継代培養し、 インビトロでの多種多様およびin vivo実験に使用した。 <p class="jove_c...

血管新生、神経発生および神経細胞移動は、中枢神経系（CNS）の開発、修復および再生における重要な事象である。いくつかのエレガントな研究は、内皮細胞が可溶性因子の放出を介して直接接触することによりニューロンの増殖およびその逆を刺激することが示されている。我々はそれが好奇心これらの研究1-3の大部分であることが見出さ神経前駆細胞/神経幹細胞は、胚の脳から単離されている間、それらは成人の脳、他の成体組織源から、または内皮細胞株と内皮細胞と共培養される。これは、部分的には、胚の脳から内皮細胞の純粋な集団を単離し、培養に関連する技術的な問題が原因である可能性があります。しかし、血管形成、神経発生、および神経細胞の移行は、より堅牢な胚の脳の正常な成人の脳に比べて桁違いに生じる同時イベントです。 embryoniの脳室周囲血管網Cの前脳（終脳）は、大脳基底核の原基内にある容器から発信され、胎生11（E11）4,5で終脳背側腹側からの整然とした勾配の形で開発しています。脳室周囲血管網の血管のこの神経叢は起源、解剖学的位置、成長パターン、および発生調節4,5に基づき、軟膜血管とは異なります。脳室周囲の血管新生勾配の伝播方向は、終脳の横断神経遺伝勾配と一致します。終脳内では、脳室周囲の血管新生勾配及び移行のGABAニューロンの勾配は接線方向にも空間的に6に重なる。タイミングに関しては、血管新生勾配は、約日までに神経遺伝勾配及びGABAニューロン勾配の進んでいる。したがって、内皮細胞は、脳室周囲空間的および時間的によく終脳の神経発生をサポートするために重要な手がかりを提供するように配置され、ニューロン移動4,6。したがって、神経前駆細胞及び/又はニューロンと共培養実験において、胚性脳室周囲の内皮細胞の使用は、神経血管の相互作用を研究し、神経変性疾患または虚血性/外傷性脳損傷の治療のための新規な手段を開発するためのより良好なモデルを提供するであろう。 我々は、上皮細胞の混入を制限することなく、分子的および脳室周囲血管網4,6（軟膜のECと区別するPVECs称される）の内皮細胞からの機能的に区別される軟膜血管内皮細胞を分離するだけでなく、軟膜膜を除去することの重要性を強調。ここでは、私たちが日常的にPVECsの豊かで純粋な収量を得るために、我々の研究室で使用する方法について説明します。これらの内皮細胞は、単一の時限妊娠マウスから単離された胚性前脳から調製される。これらは、膨張継代培養し、将来の使用のために正常に凍結することができる。

<table><tbody><tr><td>DNase I</td><td>Σ</td><td>D-4527</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>コラーゲン、ラットテール由来の1型溶液&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>C3867</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>品質生物製剤</td><td>114057-131</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>M4055</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマ</td><td>A2058</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MSコラム</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CD31マイクロビーズ</td><td>Miltenyiバイオテック</td><td>130-097-418</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MACSセパレーター</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-102</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MACSマルチスタンド</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>セルストレーナー70&マイクロ;m</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>352350</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>抗生物質および抗真菌剤溶液</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>シグマ</td><td>F4135</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ/ディスパーゼ</td><td>ロシュ</td><td>10269638001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEMの&nbsp;</td><td>ロンザ</td><td>12-604F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>35 mm 培養皿</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>353001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>15mlファルコンチューブ&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>352097</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml ファルコンチューブ</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>352098</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ECCMキット</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>355054</td><td>キット 内皮細胞増殖サプリメント、EGF、大豆トリプシン阻害剤</td></tr><tr><td>内皮細胞増殖サプリメント(ECGS)が含まれていますBD</td><td>バイオサイエンス</td><td></td> <td>354006&nbsp;</td></tr><tr><td>RBECGM</td><td>セルアプリケーション</td><td>R819-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM F12&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td>10565-018</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>305050-061</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>組織培養グレードの水ライフ</td><td>テクノロジー</td><td>ズ15230162</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.25% トリプシン</td><td>ライフ テクノロジーズ</td><td>15050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>大豆トリプシン阻害剤</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>5425</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>354234</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Qtracker 655 Cell Labeling Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q25021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CellLight原形質膜-RFP、BacMam 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>C10608</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ビオチン化イソレクチンB4抗体</td><td>Sigma</td><td>L2140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>反フォン・ヴィレブランド・ファクター</td><td>シグマ</td><td>F3520</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>アンチCD31/PECAM-1</td><td>BD Pharmingen</td><td>550274</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>VECTASHIELD ハードセット封入剤 with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>バトラーシャインアニマルヘルスサプライ</td><td>44028</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>ロイド研究所</td><td>1009</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td></td><td>Motic SMZ-168</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>オリンパス CK-40</td><td>CK-40</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td>オ<td>リンパス FSX-100</td><td>FSX-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>細かい鉗子</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>7 inox</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>細目マイクロチップハサミ</td><td>ロボズ 手術器具</td><td>RS5611</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

胚の脳内皮細胞は、血管新生および神経血管の発達との相互作用の研究における重要なツールとして機能することができる。胚前脳、軟膜および脳室周囲の2血管網は、空間的に独特であり、異なる起源と成長パターンを持っている。軟膜および脳室周囲血管網から​​の内皮細胞は、固有の遺伝子発現プロフィールおよび機能を有している。ここでは、胚前脳（終脳）の脳室周囲血管網（PVECs）からの内皮細胞の純粋な集団の単離、文化、および検証のためのステップバイステップのプロトコルを提示する。このアプローチでは、胎齢15日のマウスから得た軟膜膜を欠く終脳は、みじん切りされたコラゲナーゼ/ディスパーゼを用いて消化し、単一細胞懸濁液中に機械的に分散した。 PVECsは強い磁場を使用してマイクロビーズに結合させanti-CD-31/PECAM-1抗体で陽性選択を用いて細胞懸濁液から精製される分離方法。コンフルエントとなるまで、さらに継代培養細胞は、精製された内皮細胞培養培地中のコラーゲン1コーティングした培養皿上で培養される。位相差光学顕微鏡、蛍光顕微鏡で可視化されるようPVECsは、このプロトコルの展示石畳と紡錘形の表現型を用いて得られる。 PVEC培養の純度は、内皮細胞のマーカーで設立されました。私たちの手では、この方法では、確実にかつ一貫してPVECsの純粋な集団が得られます。このプロトコルは、前脳の血管新生への機械論的な洞察を得るPVEC相互作用、および神経細胞の種類とのクロストークを理解し、治療的血管形成のための途方もない可能性を秘めていることを目的とした研究の利益になる。

1-12日目からPVECsの表現型の特徴は、位相差光学顕微鏡検査（ 図2）によって示されている。細胞分裂（ 図2A）の1日目を表示形態学特性上皿に付着した細胞。 5-8日の間、石畳からPVECs遷移は、内皮細胞およびそのin vivoの状態（ 図2Bおよび2C）により類似の典型的な形の形態をスピンドルます。 12日目までにPVEC文化が完全な合流点（ 図2D）を実現。 PVECsは、コロニー（ 図2E-G）を拡大することが容易で継代培養することができます。内皮細胞培養の純度は、内皮細胞のマーカーで設立されました-イソレクチンB4、CD-31/PECAM-1、フォンヴィレブランド因子（VWF）とVE-カドヘリンとサブカルチャー（ 図2H-K）の後に百パーセントであることが決定された。 高倍率のCD1胚から調製PVECsの画像だけで...

このビデオでは、10〜12日以内に、胚前脳からの内皮細胞の純粋培養を調製するための簡単​​で信頼性の高い戦略を示し、脳血管新生のさまざまな側面に焦点を当てた研究のために有用であろう。

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

本手順の目的は、脳血管新生および神経血管相互作用を研究するために、胚脳から内皮細胞の純粋培養を調製することです。まず、胚脳から外膜を剥離し、頭部を単離します。次に、採取した組織を解離、ろ過、および消化させることで、単一細胞懸濁液を作製します。第3のステップは、CD 31マイクロビーズを用いて細胞を磁気的に標識することです。最終ステップでは、磁気分離によってCD 31標識細胞を精製し、その後、それらを培養します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡観察や血管新生アッセイによるさらなる研究のために、純粋な室傍心室血管内皮細胞集団が作製されます。本手法は、細胞および分子メカニズムに焦点を当てた研究に有用です。脳解析においては、脳室周囲内皮細胞の相互作用や神経細胞種とのクロストークを解明するためのツールとして活用できます。また、治療的な解析ミッションにおいても非常に大きな可能性を秘めています。脳から内皮細胞の純粋な集団を単離および培養することに伴う技術的な困難を解消するために、本手法の実演は極めて重要です。本プロトコルでは、CD1マウスの雌から得られたE15胚の頭部を、実体顕微鏡下で氷冷PBS中に配置します。微小チップ剪刀と精密ピンセットを用いて、脳を摘出します。適切な解剖は非常に重要であり、練習を積み、器具を最良の状態に保つことで習得できます。次に、ピンセットで脳をしっかりと固定し、マイクロチップ鋏を用いて皮膜を剥離します。この工程はこの手順の中で最も困難ですが、必要な技術は練習によって身につきます。次に、中脳と後脳を取り除き、頭部を単離します。続いて、皮膜を除去した頭部を、2 mLのPBSが入った氷上の35 mm培養皿に移します。すべての爪を一つのシャーレに集めます。まず、メスを用いて爪を1〜2 mmの断片に細かく刻みます。これらの組織を、2 mLの完全DMEMを含む15 mLチューブに回収します。1 mLピペットでトリチュレーションを行い、凝集塊が消失して乳白色の懸濁液が得られるまで、組織を穏やかに、かつ十分に解離させます。この懸濁液を800から1000 Gで5分間遠心分離します。室温で、吸引により上清を注意深く除去し、再懸濁します。ペレットをDS oneを含むDMEMに懸濁します。次に、穏やかなトリトン処理を用いて細胞を再度解離させ、遠心分離の手順を繰り返します。その後、ペレットを温めた完全DMEMに再懸濁します。懸濁した細胞を70 µmのナイロンメッシュでろ過し、メッシュ上に保持された細胞分を回収して、コラゲナーゼとDNaseを含む2 mLのDMEMでさらに消化します。数分間待機した後、遠心分離を用いて組織を3回洗浄し、ペレットをDMEMで再懸濁します。洗浄した回収分を、氷上に保持しておいたろ過液と合わせて1つのチューブにまとめます。次に、遠心分離を用いて完全DMEMで混合物を洗浄し、再懸濁します。その後、ヘモサイトメーターで細胞数を算出し、磁気標識に進みます。本プロトコルの液量は最大1,000万個の細胞に適しています。細胞数が多い場合は、適宜スケールアップしてください。まず、細胞懸濁液を室温で300 Gにて10分間遠心分離し、上清を完全に吸引除去した後、細胞ペレットに冷却した精製バッファー90 µLを加え、続いてCD 31結合マイクロビーズ10 µLを加えます。200 µLピペットを用いて細胞を十分に混合し、冷蔵庫内で15分間インキュベートします。この際、ラベリングの特異性を維持するため、時間を延長しすぎないようにしてください。冷却した精製バッファー1～2 mLを加えて細胞を洗浄し、300 Gで10分間遠心分離します。上清を除去し、細胞を500 µLの冷却した精製バッファーに再懸濁します。次に、max separatorの磁場内にMSカラムをセットします。続いて、室温の精製バッファー500 µLでカラムを洗浄します。次に、細胞懸濁液をカラムに適用します。このカラムは最大20 million cellsまで対応可能です。未標識細胞を含むすべてのフロースルーを回収し、廃棄してください。精製バッファー 500 µL でカラムを3回洗浄します。次の中和精製バッファー分注液を加える前に、必ずカラムのリザーバーが空であることを確認してください。次に、カラムをmax separatorから取り外し、15 mLチューブの上に設置します。1 mLの精製バッファーをカラムに加え、すぐに付属のプランジャーをカラムプレートにしっかりと押し込み、磁気標識された細胞を洗い出します。洗い出された細胞は、コラーゲンタイプIであらかじめコーティングされた35 mm培養皿に回収されます。次に、37 °C、95% oxygen、5% carbon dioxideに設定したインキュベーター内で、ECCMを用いて細胞を培養します。培地は4日ごとに交換してください。培養皿内で増殖する細胞を、毎日顕微鏡で観察します。位相差顕微鏡で観察した、脳室周囲内皮細胞（PVE CS）の1日目から12日目にかけての表現型特性の変化を示します。1日目にディッシュに接着した細胞は、5日から8日の間に細胞分裂に特徴的な形態を示します。PVE CSは、石畳状の形態から、内皮細胞に典型的であり、より生体内（in vivo）の状態に近い紡錘形の形態へと移行します。12日目までに、PVEC培養物は完全なコンフルエントに達します。サブカルチャー後は、コロニーを拡大するためにp vsを容易に継代することができます。血管内皮細胞マーカー（ISOlectin B4、von Willebrand factor、CD31、PE-CAM1、およびVE-cadherin）を用いて、内皮細胞培養の純度が100%であることを確認した。CD1胚および、内皮細胞がGFPを発現しているTie2-GFP胚から調製したPVEsの高倍率画像において、ISOlectin B4による染色は、一部のコラーゲンコート済み培養皿において、一般的な石畳状や紡錘形の形態、および細い突起を持つ多角形の形態を示した。Matrigel非存在下において、PVEsは生体内の脳室周囲血管ネットワークに特有の特性に類似した格子状パターンを形成した。これはpve. Cs.Anの高い血管新生能を反映しています。20,000個のPVE CSをマトリックスゲルでコーティングした培養皿に添加して血管新生アッセイを行ったところ、これらのPV Csは18時間以内に強固な管腔形成を示しました。CD1胚から単離したPVとそれ以外の細胞をQドットナノ結晶でラベルすることで、遊走、運動形態、細胞機能アッセイ、およびin vivo実験を含むpve CSの長期的な研究が可能になります。これらのナノ結晶は、生細胞の細胞質に強力で安定した蛍光をもたらします。Pve EECSには、cell light plasma membraneなどの細胞トレーサーをトランスフェクションすることが可能です。生細胞イメージング実験において細胞形態を鮮明に可視化するため、RFP back MAM 2.0を用いました。Pve CSを数種類の培地で培養し、染色前に位相差顕微鏡およびISO selectinを用いて細胞形態を比較しました。ECCMで培養したPV CSは紡錘形の形態を示し、12日目までにコンフルエントになりましたが、ラット脳内皮細胞増殖培地で培養したpve CSは非常に伸長した形態を示し、20日目までにコンフルエントになりました。一方、D-M-E-M-F 12培地で培養したPV CSは、紡錘形の形成は見られず、平坦で多角形の形態のみを示し、非常に急速に増殖して4日目までにコンフルエントになりました。PVECは、表現型と機能を維持したまま、ECCMを用いて最大3継代まで培養されています。したがって、PVECの培養にはECCMが推奨される培地となります。習熟すれば、適切に実施することでこの工程を3時間で完了させることができます。脳室周囲内皮細胞と神経前駆細胞の共培養は、成体脳やその他の由来の内皮細胞よりも、神経新生および神経細胞の移動を大幅に促進する可能性があります。したがって、これらは多くの異なるシナリオにおいて、神経機能の回復を支援するために有用であると考えられます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

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