SynVivo合成微小血管網を利用した剪断接着マップの生成

本実験の全体的な目的は、合成微小血管ネットワークを用い、単一の実験から細胞粒子の接着に関するせん断接着マップを取得することです。これは、まずマイクロ流体デバイスを、本実験ではアビドン（Avadon）である目的のタンパク質でコーティングすることで達成されます。第2のステップとして、ビオチン化粒子を生理的なせん断速度でデバイス内に注入します。これらの粒子は、局所的なせん断速度に応じて異なるパターンでアビドンコーティングされたデバイスに結合します。

次に、ネットワーク内のせん断速度値の計算データベースを用いて、粒子のせん断接着マップを作成するために、結合した粒子の数をカウントします。その結果、単一の実験からせん断接着マップを取得できることが示され、従来のパラレルプレートフローチャンバーと比較して、時間と試薬の大幅な削減が可能になります。線形フローチャネルなどの既存の手法に対する本技術の主な利点は、単一の実験から共有マップを生成できるため、コストと時間を大幅に節約できる点にあります。

この手法は、薬物輸送担体が目的の標的に結合できるかなど、ドラッグデリバリー分野における重要な疑問への回答に役立ちます。私たちは当初、流体条件下での細胞の局所病変を理解するためにパドルプレートフローチャンバーを使用しており、そこでこの手法を着想しました。なお、本アッセイの目的は、粒子および細胞の接着に関する基礎的な知見を提供することにあります。

syn vivoプラットフォームは、がんや中枢神経系（CNS）へのデリバリー、感染症や炎症、血栓症、微小循環機能不全など、さまざまな他の系に適用可能です。マイクロ流体デバイスの手順を習得し、微量サンプルに慣れ、気泡の形成を避けるためのベストプラクティスを理解することは困難であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。手順のデモンストレーションは、当研究室のリサーチサイエンティストであるAshley Smithが行います。

SynVivo SMNマイクロ流体デバイスは、表面コーティング剤、定着させるための官能基または細胞を流し込むためのポートと、アッセイを実行するためのポートという、2組の平行ポートで構成されています。まず、デバイスを滅菌脱イオン水を入れたペトリ皿に完全に浸し、その皿を真空装置に入れます。デバイスのチャネル内からすべての空気が除去されるまで、脱気処理を行ってください。

デバイスを水から取り出す前に、約15分間この状態で保持します。細いピンセットを使用して、水でプライミングしたタイゴンチューブをデバイスの各ポートに挿入します。チューブの長さは約1インチにしてください。

これで、ピペットまたはシリンジを用いてデバイスを水から取り出すことができます。一方の入口ポートチューブの基部に水を1滴滴下します。その後、慎重にチューブを取り除きます。

水滴を置くことで、デバイスへの空気の流入を防ぎます。次に、20 µg/mL濃度のavadonを充填した1 mLシリンジを用意します。シリンジを24ゲージのステンレス製針とチューブに接続してください。使用していないインレットポートをジョークランプで固定します。

チューブをデバイスの導入ポートに挿入します。デバイス内を完全に灌流させるため、Avadonを1 µL/minの流速で10分間注入します。流動時間の終了後、

すべてのチューブをジョークランプで固定し、装置を4 °Cで一晩保存します。装置を室温に戻した後、電動ステージと高性能カメラを備えた倒立蛍光顕微鏡の上に設置します。

リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて、2 µmのビオチン化粒子を5 million particles/mLの濃度で調製します。この粒子溶液を1 mLシリンジに充填します。別途、PBSを入れた2つ目の1 mLシリンジを用意します。

各シリンジをシリンジポンプに装着し、ピペッターシリンジを用いてニードルおよびチューブに接続します。導入ポートチューブの基部に水滴を落とし、デバイスのコーティングに使用したチューブを慎重に取り除きます。その後、ビオチン化粒子用およびPBS用のチューブを、それぞれの導入ポートに慎重に挿入してください。

次に、2.5 µL/minの流速でビオチン化粒子を注入し始めます。顕微鏡で導入ポートを観察し、粒子が最初に現れた時点でタイマーを開始し、3分間流し続けます。

3分後、ビオチン化粒子のフローを停止させると同時に、PBSを2.5 µL/minの流速で流し始めます。未結合の粒子を洗浄するため、PBSをデバイス内に3分間流します。データ取得を開始するには、イメージングソフトウェアの広視野スキャン機能を使用してデバイス全体の画像を撮影し、次に、デバイス内の分岐点に順次番号を付け、チャネル径の2倍の直径を持つ円形の関心領域（ROI）を作成します。

このケースでは、チャネル径が100 micronsであるため、関心領域（area of interest）の直径を200 micronsに設定します。イメージングソフトウェアの自動カウント機能を使用して、各関心領域内の粒子数をスプレッドシートにエクスポートします。同様に、自動カウント機能を用いてデバイス全体の粒子数をエクスポートします。

CFDシミュレーションを実行し、その結果をさらなる解析のためにデータベースに保存します。結果に含まれる情報には、壁せん断速度、速度粒子フラックス、およびデバイスへの付着が含まれます。ここの情報は、定義された粒子濃度の入力条件下で、各関心領域に付着する粒子の数を決定するために使用されます。

せん断接着マップを作成するには、最終ステップとして、テキストプロトコルに詳述されている方法で接着率を算出してください。ネットワークの各分岐点におけるせん断速度と接着率の値を用いて、せん断接着マップをプロットします。この画像は、2 µmのビオチン化粒子を結合させた後の、典型的なavidinコーティング済みsyn vivo SMNデバイスを示しています。

粒子はネットワークの分岐点付近に優先的に付着することに注意してください。in vivo SMNネットワークにおける番号付きの分岐点をこちらで確認できます。この画像は、デバイスのCFDモデルによって生成されたサンプル壁せん断応力マップです。

デバイス内のせん断速度は、生体内の微小血管で観察されるのと同様に、250 s⁻¹から15 s⁻¹まで変化します。線形のマイクロ流路では、各流量に対して一定のせん断速度となるため、このような変動するせん断速度を同時に得ることはできない点に注意してください。ネットワークの各分叉点におけるせん断速度の値をここに示すプロットで確認すると、せん断速度のパターンは複雑であり、線形流路とは異なり単純な解析的関係では得られないことがわかります。

さらに、ネットワーク内には同じせん断ビンに属する分岐点が複数存在しており、これにより示されたデータの統計的信頼性が高まっています。以下に、ネットワーク内の粒子フラックスに関するCFD解析のサンプル結果を示します。これらは、実験ネットワークの分枝および分岐点における粒子フラックスを算出するために使用されます。

単一のsyn vivo SMN実験から算出されたせん断接着マップは、線形チャネル実験から得られたせん断接着マップで観察される逆相関関係に従います。しかし、SynVivoアッセイを使用すると、単一の実験でこのせん断マップを生成できるのに対し、線形チャネルでは複数回の実験ランを的に取得する必要があります。このビデオを視聴することで、単一の実験からせん断接着を生成するためのSynVivo SMNデバイスの使用方法について十分に理解できるはずです。

本実験を行う際は、SynVivo SMNマイクロ流体デバイスの開発後に気泡を混入させないことが重要です。この手法により、炎症分野の研究者が、単一の実験で異なるせん断速度における白血球と内皮細胞の相互作用を研究することが可能になりました。次世代のデバイスでは、現在は不可能な、単一のアッセイでの白血球のローリング、接着、および遊走の研究が可能になると期待されています。

本手順に続いて、薬剤、ドラッグデリバリーキャリア、および細胞の接着を調べる他の手法を実施することで、細胞間接着、細胞-薬剤接着、および薬剤キャリア接着に対する流動の生理学的影響などの疑問を検討することが可能です。