Name: SynVivo合成微小血管網を利用した剪断接着マップの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学ぶ 合成微小血管網を用いた剪断接着マップの生成法。単一実験で生理学的剪断速度下での粒子接着を解析し、従来法に比べ時間と試薬を大幅に節約できます。計算データベースと連携した効率的な細胞接着研究手法です。

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SynVivo技術はNHLBIからの助成金番号2R44HL076034の下で開発されました。

1。プライミングSynVivo-SMNマイクロ流体デバイス<ol><li>デバイスの各ポート（入口/出口）は、2つのパラレルポートから構成されている-表面被覆部分に流れる毎に（接着分子、成長マトリックスなど）および/ ​​または播種アッセイ（ 図1Aを実行するための他のための細胞）。 </li><li>完全滅菌脱イオン（DI）水を含むペトリ皿にSynVivo-SMNマイクロ流体デバイス（ 図1B）を水没し、真空デシケーターにお皿を置く。空気のすべてがデバイスのチャネルから削除されるまでデシケーターを実行させておきます。これは、約15分かかります。 </li><li>水からデバイスを取り外す前に、細かい点ピンセットでデバイスの各ポートに水で下塗りタイゴンチューブ（0.06のOD」と0.02のID」）を配置します。チューブは長さが約1インチでなければなりません。デバイスは、水から除去することができる。 図1Cは、デビックの画像を示すチューブとE。 </li></ol> 2。所望のタンパク質（ 例えば 、アビジン）とマイクロ流体デバイスをコーティング<ol><li>ピペットを用いて、1流入口チューブの根元に水を一滴（約100μl）を配置します。慎重にプライムデバイスに使用されるチューブを取り外します。水滴は、デバイスを空気が入るのを防ぐであろう。 </li><li> 20μg/ mlの濃度でアビジンを搭載し1ミリリットルの注射器を準備します。 24 Gのステンレス鋼針やチューブに注射器を接続します。デバイスの入口ポートにチューブを挿入する。ジョーのクランプで利用されていない入口ポートをクランプ。 </li><li>装置の完全なかん流を可能にするために10分間、1μlの/分の流速でアビジンを注入する。フロー時間の終了時に、顎クランプでチューブをクランプし、4℃で一晩装置を配置する。 </li></ol> 3。接着実験のためのビオチン化粒子を流れる<ol><li>デバイスができるようにする室温に来る。電動ステージと高性能カメラを搭載した倒立蛍光顕微鏡の上には置か。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中5×10 6粒子/ mlの濃度で2μmのビオチン化粒子の溶液を調製する。 1ミリリットルの注射器に粒子をロードします。 PBSのみの第二の1ミリリットルの注射器を準備します。シリンジポンプに各シリンジをロードし、針とチューブに接続します。 </li><li>ピペットを用いて、流入口チューブの根元に水を一滴（約100μl）を配置します。丁寧にコーティングするために、デバイスを使用し、チューブを取り外します。水滴は、デバイスを空気が入るのを防ぐであろう。 </li><li>慎重に入口ポートのそれぞれにステップ3.2からチューブのビオチン化粒子と、PBSのために挿入します。 図2（a）は、セットアップの画像を示す。 </li><li> 2.5μL/分の流量で、ビオチン化粒子を注入開始。顕微鏡上の入口ポートを監視します。最初の兆候で粒子から、タイマーを開始し、3分間の流れを継続する。 </li><li>同時に2.5μlの/分の流速でPBSの流れを凝視しながら3分間の終わりに、ビオチン化された粒子の流れを止める。 PBSを結合していない粒子を洗い流すために3分間デバイス内に流れるようになります。 </li></ol> 4。画像を取得し、イメージングソフトウェア（NIKON要素）を用いて関心領域（AOI）測定の実行<ol><li>装置全体の画像を取得する画像処理ソフトウェアで「スキャン大きなイメージ」機能を使用してください。 </li><li>順次番号分岐装置内のチャンネルの二倍の直径を持つ円形のAOIを作成します。チャンネル径が100μmであるため、この場合は、200μmのAOI径を設定します。 </li><li> MS Excelのシートに各AOIの粒子数をエクスポートするために、イメージングソフトウェアで自動化されたカウント機能を使用してください。 </li><li>同様に、全体の中の粒子の数をエクスポートするために自動化されたカウント機能を使用デバイス。 </li></ol> 5。計算流体力学（CFD）モデルを用いて粒子フラックス解析<ol><li> CFDシミュレーションはSynVivo-SMNのデバイストポロジのために市販のソフト（CFD-ACE +、ESI社）を使用して実行されます。結果は、実験観察を分析するためのデータベースに格納される。壁のせん断速度、速度、粒子束、およびデバイスにおける接着に関するシミュレーション結果情報を格納します。 </li><li>シミュレーション結果は、所与の入口粒子濃度に基づいて、それぞれのAOIに入る粒子の数を決定するために使用される。 </li></ol> 6。生成剪断接着地図<ol><li>式6.1に示すように分岐部を流れる粒子によって分岐内の付着した粒子を分割することにより密着性の％を計算します。 <img alt="式（1）" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51025/51025eq1.jpg" /> 付着粒子の数と粒子が流れることは、pから得られる場合rotocolは、それぞれ4.3と5.2を繰り返します。 </li><li>ステップ（5.1）でデータベースから取得したネットワークおよび式6.1から得％の接着値の各分岐部に剪断速度を用いて剪断接着マップをプロットする。 </li></ol>

<ol><li>Weitz-Schmidt, G., Chreng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion assays.</a> Methods Mol Biol. 757, 15-30 (2012).</li>
<li>Parsons, S. A., Jurzinsky, C., Cuvelier, S. L., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+leukocyte+recruitment+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying leukocyte recruitment under flow conditions.</a> Methods Mol Biol. 946, 285-300 (2013).</li>
<li>Luscinskas, F. W., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jr+Endothelial-dependent+mechanisms+in+chronic+inflammatory+leukocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Jr Endothelial-dependent mechanisms in chronic inflammatory leukocyte recruitment.</a> Annu Rev Med. 47, 413-421 (1996).</li>
<li>Adriani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preferential+targeting+of+the+diseased+microvasculature+by+disk-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The preferential targeting of the diseased microvasculature by disk-like particles.</a> Biomaterials. 33, 5504-5513 (2012).</li>
<li>Decuzzi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+chamber+analysis+of+size+effects+in+the+adhesion+of+spherical+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Flow chamber analysis of size effects in the adhesion of spherical particles.</a> Int J Nanomedicine. 2, 689-696 (2007).</li>
<li>Zou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSGL-1+derived+from+human+neutrophils+is+a+high-efficiency+ligand+for+endothelium-expressed+E-selectin+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, 415-424 (2005).</li>
<li>Sakhalkar, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-inspired+biodegradable+particles+that+selectively+and+avidly+adhere+to+inflamed+endothelium+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-inspired biodegradable particles that selectively and avidly adhere to inflamed endothelium in vitro and in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15895-15900 (2003).</li>
<li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers+-+a+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide.</a> Platelets. 23, 229-242 (2012).</li>
<li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+their+use+in+the+study+of+neutrophil+transmigration+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions.</a> J Vis Exp. 66 (66), (2012).</li>
<li>Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mac-2+binding+protein+is+a+novel+E-selectin+ligand+expressed+by+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mac-2 binding protein is a novel E-selectin ligand expressed by breast cancer cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
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<li>Oh, H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+enhances+neutrophil+membrane+tether+growth+and+slows+rolling+on+P-selectin+but+reduces+capture+from+flow+and+firm+arrest+on+IL-1-treated+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ethanol enhances neutrophil membrane tether growth and slows rolling on P-selectin but reduces capture from flow and firm arrest on IL-1-treated endothelium.</a> J Immunol. 181, 2472-2482 (2008).</li>
<li>Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-selectin-mediated+lymphocyte-cancer+cell+interactions+under+low+fluid+shear+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions.</a> J Biol Chem. 283, 15816-15824 (2008).</li>
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<li>Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+adhesion+of+leukocytes+near+bifurcations+is+endothelium+independent%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent.</a> Microvasc Res. 80, 384-388 (2010).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifurcations%3A+focal+points+of+particle+adhesion+in+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Bifurcations: focal points of particle adhesion in microvascular networks.</a> Microcirculation. 18, 380-389 (2011).</li>
</ol>

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パラレルプレートフローチャンバーは、細胞 - 細胞および細胞 - 粒子間相互作用に重要な洞察を提供しながら、このような高い試薬の消費および剪断接着マップを生成するために複数の実験ランの必要性など、いくつかの制限を受ける。 SynVivo合成微小血管ネットワーク（SynVivo-SMNs）の使用は、生体内の状態に模倣条件での一回の実験からの剪断接着マップの生成を可能にします。また、試薬を大幅に節約（&gt; 95％）も得られる。 SynVivo-SMNとパーティクル付着実験を実行している中で最も重要なステップは、実験前に、チップ内の気泡のない条件を確保することです。気泡の導入は、チップの領域を「空気がロックされた」へのアクセスの不安定性および欠如を流れるように導くであろう。そのため、細心の注意は、デバイスのポートからチューブの挿入および抽出の際に注意が必要です。目で見られるバブルの場合プライミング工程中の電子装置は、一つの気泡を除去するために再度プライミング工程を繰り返すことができる。あるいは、装置の無気泡プライミングを確実にするために低流量（0...

細胞間および粒子 - 細胞相互作用を研究するための現在のアッセイは、典型的には粒子または細胞は、タンパク質マトリックスまたは接着細胞上でインキュベートされた静的なウェルプレートフォーマットを含む。指定されたインキュベーション時間の終了時に、付着粒子または細胞の数を、顕微鏡1を用いて定量する。これらのアッセイは、これらの相互作用の背後にある生物化学的プロセスに重要な洞察を提供するにもかかわらず、主要な制限は、生理的な流体（典型的な微小循環の）流れと粒子の付着への影響がないことである。 この制限を克服するために、 インビトロのフローチャンバーは、近年開発されている。これらのフローチャンバーの共通要素は、 インビボ 2 の血管において観察される壁せん断速度と一致するように、低レイノルズ数で灌流透明な装置である。血管壁は、流れcの一面に生体分子の被膜または細胞の増殖のいずれかによってモデル化されるhamber 3。粒子4-7又は8-16の細胞は、次いで種々の剪断速度下で粒子を付着させるの数を定量化するために流速の所望の範囲内に流される。 しかし、生化学的現象を研究し、検証するための平行板フローチャンバーの使用は、かなり高価であり、時間がかかる。これは、複数の実験が付着粒子/細胞の数に対する流体剪断の地図を生成するために行われる必要があるという事実に主に起因する。また、プレートフローチャンバーは、それらの大きなサイズ（高さ&gt;250μmで、幅&gt; 1mm）のに試薬を大量に必要とする。最後に、これらのデバイスは、正確に生体内に存在する幾何学的特徴（ 例えば 、分岐点）とフロー条件（ 例えば 、フローを発散対収束）をモデル化しないでください。 リソグラフィベースの微細加工17〜19の最近の進歩により、ラボ·オン·チップのフィールドを加速していますデバイス20〜21。これらのデバイスは、マイクロメートル領域における寸法の平行板フローチャンバーの小型化されたバージョンの開発に尽力してきました。ディメンションの減少も試薬、細胞や実験に必要とされる粒子の体積の面で大きなメリットが得られます。しかしながら、現在利用可能なデバイスの重要な制限は、in vivoで観察複合体微小血管系を模倣していない微小血管をモデル化する線形チャネルの使用である。 我々は最近、生体内の条件の合成表現、その結果、使い捨てのプラスチック基板上に微小血管のネットワークを再作成するための新たな方法論を開発しました。これらのデバイスは、SynVivo、合成微小血管ネットワーク（SMN）と呼ばれるPDMSベースのソフトリソグラフィプロセスを使用して開発されている。 SynVivo-SMNデバイスは、細胞/粒子の密着22の剪断接着マップを得るために使用することができ、研究では、薬物送達及びh 23を標的とin vivoデータ24〜25と比較して検証されていAVE。本論文では、それによって、資源と時間の大幅な節約をもたらす1-5μLと小さい容量の中で単一の実験から、せん断接着マップの生成を可能にするプロトコルを提示する。

<table><tbody><tr><td>SynVivo-SMN</td><td>CFD Research</td><td>SMN-001</td><td>CFDRC</td></tr><tr><td>CFD-ACE+</td><td>ESI Inc.</td>にて独占<td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Invitrogen</td><td>43-4401</td><td>このアッセイには、任意のアビジン源が機能します</td></tr><tr><td>ビオチン化粒子</td><td>Polysciences</td><td>24173-1</td><td>ビオチン化粒子の任意のソースがアッセイに機能します</td></tr><tr><td>タイゴンチューブ</td><td>VWR</td><td>63018-044</td><td>サイズは、SynVivo-SMN</td></tr><tr><td>NIKON Elements</td><td>NIKON Instruments</td><td>N/A</td><td>その他のイメージングでの使用に適していますソフトウェアを使用できます</td></tr></tbody></table>

synvivo合成微小血管網を利用した剪断接着マップの生成

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

セル/粒子接着アッセイは疾患の病態生理に関与して生化学的相互作用を理解する上で重要であり、新たな治療薬の開発のための探求の重要な用途がある。静的条件を用いたアッセイは、 生体内環境との相関性を制限する、剪断に対する密着性の依存性を捕捉することができない。生理学的な流体の流れの下での密着性を定量化する平行板フローチャンバーは、剪断接着マップを生成するための複数の実験を必要とする。加えて、それらはインビボ規模および形態を表し、実験のための試薬 ​​の大量（〜ml）を必要としない。本研究では、マイクロ流体デバイス、SynVivo-SMNベースの微小血管ネットワークを用いて単一の実験からの剪断接着マップの生成を示す。このデバイスは、幾何学的な規模、形態学的要素、フロー機能との細胞間相互作用を含む、 生体内血管系で複合体を再作成in vitroでのフォーマット、それによって基本のため、生物学的に現実的な環境を提供し、細胞挙動、薬物送達、および創薬応用研究。アッセイは、マイクロチップのアビジン被覆表面とのビオチン2μmの被覆粒子との相互作用を研究することによって実証された。微小血管系において観察剪断の全範囲は、生理的条件下で粒子に対するせん断マップ対接着を可能にする単一のアッセイで得られる。

図1Aは、概略的かつSynVivo-SMN装置の明視野像を示す。 図1Bは、スライドガラス上に搭載SynVivo-SMN装置を示す。 図1Cは 、真空デシケーター中で水でプライミング以下のチューブを有する装置を示している。 図2aは、実験的な設定までのイメージを示す。 図2Bは、2ミクロンビオチン化粒子の結合後の典型的なアビジン被覆SynVivo-SMN装置を示す。粒子が優先的にネットワーク内の分岐点の近くに準拠していることに注意してください。 図3Aは、SynVivo-SMNネットワーク内の番号付き分岐を示している。 図3Bは 、装置のCFDモデルによって生成されたサンプル壁剪断マップを示す。剪断速度250秒-1から15秒の範囲で変化するデバイス-1</...

接着実験で使用されるフローチャンバーは、通常、直線的な流路で構成されており、せん断接着マップを生成するために異なる流量での複数の実験を必要とします。 SynVivo-SMNは、マイクロリットルの容量を利用した1回の実験でせん断接着マップを作成できるため、時間と消耗品を大幅に節約できます。

SynVivo合成微小血管網を利用した剪断接着マップの生成

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

本実験の全体的な目的は、合成微小血管ネットワークを用い、単一の実験から細胞粒子の接着に関するせん断接着マップを取得することです。これは、まずマイクロ流体デバイスを、本実験ではアビドン（Avadon）である目的のタンパク質でコーティングすることで達成されます。第2のステップとして、ビオチン化粒子を生理的なせん断速度でデバイス内に注入します。これらの粒子は、局所的なせん断速度に応じて異なるパターンでアビドンコーティングされたデバイスに結合します。次に、ネットワーク内のせん断速度値の計算データベースを用いて、粒子のせん断接着マップを作成するために、結合した粒子の数をカウントします。その結果、単一の実験からせん断接着マップを取得できることが示され、従来のパラレルプレートフローチャンバーと比較して、時間と試薬の大幅な削減が可能になります。線形フローチャネルなどの既存の手法に対する本技術の主な利点は、単一の実験から共有マップを生成できるため、コストと時間を大幅に節約できる点にあります。この手法は、薬物輸送担体が目的の標的に結合できるかなど、ドラッグデリバリー分野における重要な疑問への回答に役立ちます。私たちは当初、流体条件下での細胞の局所病変を理解するためにパドルプレートフローチャンバーを使用しており、そこでこの手法を着想しました。なお、本アッセイの目的は、粒子および細胞の接着に関する基礎的な知見を提供することにあります。syn vivoプラットフォームは、がんや中枢神経系（CNS）へのデリバリー、感染症や炎症、血栓症、微小循環機能不全など、さまざまな他の系に適用可能です。マイクロ流体デバイスの手順を習得し、微量サンプルに慣れ、気泡の形成を避けるためのベストプラクティスを理解することは困難であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。手順のデモンストレーションは、当研究室のリサーチサイエンティストであるAshley Smithが行います。SynVivo SMNマイクロ流体デバイスは、表面コーティング剤、定着させるための官能基または細胞を流し込むためのポートと、アッセイを実行するためのポートという、2組の平行ポートで構成されています。まず、デバイスを滅菌脱イオン水を入れたペトリ皿に完全に浸し、その皿を真空装置に入れます。デバイスのチャネル内からすべての空気が除去されるまで、脱気処理を行ってください。デバイスを水から取り出す前に、約15分間この状態で保持します。細いピンセットを使用して、水でプライミングしたタイゴンチューブをデバイスの各ポートに挿入します。チューブの長さは約1インチにしてください。これで、ピペットまたはシリンジを用いてデバイスを水から取り出すことができます。一方の入口ポートチューブの基部に水を1滴滴下します。その後、慎重にチューブを取り除きます。水滴を置くことで、デバイスへの空気の流入を防ぎます。次に、20 µg/mL濃度のavadonを充填した1 mLシリンジを用意します。シリンジを24ゲージのステンレス製針とチューブに接続してください。使用していないインレットポートをジョークランプで固定します。チューブをデバイスの導入ポートに挿入します。デバイス内を完全に灌流させるため、Avadonを1 µL/minの流速で10分間注入します。流動時間の終了後、すべてのチューブをジョークランプで固定し、装置を4 °Cで一晩保存します。装置を室温に戻した後、電動ステージと高性能カメラを備えた倒立蛍光顕微鏡の上に設置します。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて、2 µmのビオチン化粒子を5 million particles/mLの濃度で調製します。この粒子溶液を1 mLシリンジに充填します。別途、PBSを入れた2つ目の1 mLシリンジを用意します。各シリンジをシリンジポンプに装着し、ピペッターシリンジを用いてニードルおよびチューブに接続します。導入ポートチューブの基部に水滴を落とし、デバイスのコーティングに使用したチューブを慎重に取り除きます。その後、ビオチン化粒子用およびPBS用のチューブを、それぞれの導入ポートに慎重に挿入してください。次に、2.5 µL/minの流速でビオチン化粒子を注入し始めます。顕微鏡で導入ポートを観察し、粒子が最初に現れた時点でタイマーを開始し、3分間流し続けます。3分後、ビオチン化粒子のフローを停止させると同時に、PBSを2.5 µL/minの流速で流し始めます。未結合の粒子を洗浄するため、PBSをデバイス内に3分間流します。データ取得を開始するには、イメージングソフトウェアの広視野スキャン機能を使用してデバイス全体の画像を撮影し、次に、デバイス内の分岐点に順次番号を付け、チャネル径の2倍の直径を持つ円形の関心領域（ROI）を作成します。このケースでは、チャネル径が100 micronsであるため、関心領域（area of interest）の直径を200 micronsに設定します。イメージングソフトウェアの自動カウント機能を使用して、各関心領域内の粒子数をスプレッドシートにエクスポートします。同様に、自動カウント機能を用いてデバイス全体の粒子数をエクスポートします。CFDシミュレーションを実行し、その結果をさらなる解析のためにデータベースに保存します。結果に含まれる情報には、壁せん断速度、速度粒子フラックス、およびデバイスへの付着が含まれます。ここの情報は、定義された粒子濃度の入力条件下で、各関心領域に付着する粒子の数を決定するために使用されます。せん断接着マップを作成するには、最終ステップとして、テキストプロトコルに詳述されている方法で接着率を算出してください。ネットワークの各分岐点におけるせん断速度と接着率の値を用いて、せん断接着マップをプロットします。この画像は、2 µmのビオチン化粒子を結合させた後の、典型的なavidinコーティング済みsyn vivo SMNデバイスを示しています。粒子はネットワークの分岐点付近に優先的に付着することに注意してください。in vivo SMNネットワークにおける番号付きの分岐点をこちらで確認できます。この画像は、デバイスのCFDモデルによって生成されたサンプル壁せん断応力マップです。デバイス内のせん断速度は、生体内の微小血管で観察されるのと同様に、250 s⁻¹から15 s⁻¹まで変化します。線形のマイクロ流路では、各流量に対して一定のせん断速度となるため、このような変動するせん断速度を同時に得ることはできない点に注意してください。ネットワークの各分叉点におけるせん断速度の値をここに示すプロットで確認すると、せん断速度のパターンは複雑であり、線形流路とは異なり単純な解析的関係では得られないことがわかります。さらに、ネットワーク内には同じせん断ビンに属する分岐点が複数存在しており、これにより示されたデータの統計的信頼性が高まっています。以下に、ネットワーク内の粒子フラックスに関するCFD解析のサンプル結果を示します。これらは、実験ネットワークの分枝および分岐点における粒子フラックスを算出するために使用されます。単一のsyn vivo SMN実験から算出されたせん断接着マップは、線形チャネル実験から得られたせん断接着マップで観察される逆相関関係に従います。しかし、SynVivoアッセイを使用すると、単一の実験でこのせん断マップを生成できるのに対し、線形チャネルでは複数回の実験ランを的に取得する必要があります。このビデオを視聴することで、単一の実験からせん断接着を生成するためのSynVivo SMNデバイスの使用方法について十分に理解できるはずです。本実験を行う際は、SynVivo SMNマイクロ流体デバイスの開発後に気泡を混入させないことが重要です。この手法により、炎症分野の研究者が、単一の実験で異なるせん断速度における白血球と内皮細胞の相互作用を研究することが可能になりました。次世代のデバイスでは、現在は不可能な、単一のアッセイでの白血球のローリング、接着、および遊走の研究が可能になると期待されています。本手順に続いて、薬剤、ドラッグデリバリーキャリア、および細胞の接着を調べる他の手法を実施することで、細胞間接着、細胞-薬剤接着、および薬剤キャリア接着に対する流動の生理学的影響などの疑問を検討することが可能です。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

フォトリソグラフィ法によりエッチングし、PDMSから製造されるマイクロ流体フローチャンバーは、EC機能不全や炎症に関連付けられた機能的転帰を調べるために適用されます。代表的な実験では、EC単層を活性化サイトカインの単球の細胞接着を調節する差動せん断応力の能力が実証されています。...

オンチップ·血管内皮の炎症性表現型

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Primary Human Umbilical Vein endothelial cells...

の開発と特性評価<em&gt;インビトロ</em&gt;微小血管ネットワークおよび内皮の定量的測定の[Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt;私</sub&gt;と一酸化窒素の生産

この原稿は、内皮の生理学的特性を再現微小血管を設計するための射出成形方法を提供します。マイクロ流体ベースのプロセスは、このような流れ、細胞組成、幾何学、および生化学的勾配などの調整可能な条件、との特許の3D血管ネットワークを作成します。製造プロセスと潜在的な用途の例について説明します。...

微細と3D微小血管の組立

このプロトコルは、ポリ(エチレングリコール)ジアクリレート(PEGDA)ハイドロゲルに埋め込まれた血管由来の生体模倣マイクロ流体ネットワークを製造するための、イメージ誘導レーザーベースのハイドロゲル分解の実装を概説しています。これらの生体模倣マイクロ流体システムは、組織工学アプリケーション、in...

血管由来のマイクロ流体ネットワークの画像誘導、レーザーベースの試作

誘導多能性幹細胞(iPSC-EPs)に由来する内皮前駆体は、心血管疾患治療に革命を起こさせ、より忠実な心血管疾患モデルの作成を可能にする可能性を秘めています。本明細書において、三次元(3D)コラーゲン微小環境におけるiPSC-EPの封入およびこれらの細胞の血管球電位の定量分析について説明する。...

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

設計された組織は、重要な栄養素やガスを提供し、代謝廃棄物を除去するために適切な血管ネットワークに大きく依存しています。この研究では、内皮細胞と支持細胞の段階的な播種プロトコルにより、制御された3D環境における血管挙動の開発を研究するための高スループットプラットフォームで、高度に組織化された血管ネットワークを作成する。...

発芽血管を研究するためのテッセレーション足場の段階的な細胞播種

ここでは、マイクロ流体チップと、新生血管形成の初期微小環境を再現する、自動制御された高効率循環マイクロ流体システムを提供し、高い発光せん断応力、経経皮流の生理学的レベル、および様々な血管内皮成長因子(VEGF)分布によって内皮細胞(ECs)を同時に刺激することを可能にする。...

新血管新生初期事象を模倣する微発性モデル

このプロトコルの目的は、長期的な培養のためのアクセス可能で簡単な技術を使用して、血管化されたヒトの皮膚同等物の生成および体積分析を記述することです。可能な限り、ステップの根拠は、研究者が研究ニーズに基づいてカスタマイズする能力を可能にするために記述されています。...

自己組み立て型血管化ヒト皮膚等価物の生成

このプロトコルでは、生理学的に関連する微小血管環境を再現し、白血球接着/遊走カスケード全体を再現することができる生体模倣マイクロ流体アッセイが、炎症性疾患における白血球 - 内皮細胞相互作用を研究するために採用される。...

炎症時の白血球-内皮細胞相互作用を研究するための微生理学的システム

発芽血管新生は、発生と疾患の基本であり、複雑な分子的および機械的プロセスに関与しています。ブタの頸動脈からの細胞芽を解析し、硬さ依存性の血管新生と明確なリーダーフォロワー細胞力学を明らかにする、汎用性の高い2.5D ex vivo...

生体組織における発芽血管新生の ex vivo 機械的特性評価のための2.5Dモデル

学ぶ 合成微小血管網を用いた剪断接着マップの生成法。単一実験で生理学的剪断速度下での粒子接着を解析し、従来法に比べ時間と試薬を大幅に節約できます。計算データベースと連携した効率的な細胞接着研究手法です。

SynVivo合成微小血管網を利用した剪断接着マップの生成

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