非宿主抵抗性に関与する遺伝子の同定のためのVIGS媒介フォワード遺伝スクリーニング

ここでの全体的な目的は、ウイルス誘導性遺伝子サイレンシング（VIGS）を用いて、非宿主抵抗性に関与する遺伝子を特定するための手法を実証し、内因性植物のVIGSを実現することです。標的遺伝子として、標的遺伝子の断片を含むタバコ rattle virus (TRV) 構築物を Nicotiana hamama 植物に接種します。次に、緑色蛍光タンパク質を発現する非宿主病原体の培養液を調製し、遺伝子サイレンシングさせた植物の葉に接種します。その後、暗所でUVライトを用いて、非宿主病原体の緑色蛍光コロニーを評価します。

非宿主抵抗性を損なわせる遺伝子サイレンシング植物を特定するため、ウイルスベクター内のインサートをシーケンシングして標的遺伝子を同定します。全体として、このVIX介在性前方遺伝学的スクリーニングの手法により、研究者は細菌病原体に対する植物の非宿主抵抗性に関与する遺伝子を容易に特定することが可能になります。短期間で、私たちは、非宿主抵抗性を担う遺伝子を特定するために、ウイルス誘発遺伝子サイレンシングによる前方遺伝学とGFP UV発現病原体を組み合わせることの重要性を認識しました。

以前、過剰反応によって誘導される細胞死および疾患によって誘導される細胞死をスコアリングすることにより、手間のかかるフォワードジェネティクススクリーンを行いました。まず、土なしポット用混合土にNicotiana benthamianaの種子を蒔き、育成チャンバー内で種子を発芽させます。3週間後、苗を個別のポットに移植し、タバコ rattle virusを接種する前に、温室で少なくとも2～3日間育成します。

ベクター接種用のイチジクについて、cDNAクローンを含むアグロバクテリウムの凍結ストックを徐々に融解させます。無菌条件下で、個々のアグロバクテリウム培養液をLuria-Bertaniアグロプレートに接種します。プレートを28°Cで最大2日間インキュベートします。

2株の植物に接種するための十分なアグロバクテリウム接種源を確保するため、各クローンにつき4つの複製コロニーを培養します。TRV 1をLuria berti液体培地に接種します。一晩培養した菌体を遠心分離で回収し、接種バッファーで再懸濁させた後、シェーカーを用いて室温、50 RPMで3時間インキュベートします。

遠心分離により細胞を回収した後、吸光度を測定し、細菌ペレットを5 mM MESバッファー（pH 5.5）で再懸濁します。次に、OD 600が0.3のTRV1細菌培養液を、ニードルレスシリンジを用いてNicotiana hamamaの3〜4枚の葉の軸側にTRV1接種部位として接種します。続いて、それぞれのTRV2コロニーの接種液を爪楊枝で葉に刺し込みます。PIGSによる効率的な遺伝子サイレンシングには旺盛な成長が重要であるため、適切な栄養を与え、低温条件下で2週間植物を維持してください。

例として、本実験では pseudomonas senge PV tomato T one を使用します。病原体は GFP-UV を発現可能なプラスミドを保持している必要があります。PGE 株を、10 µg/mL の Rifampicin および 50 µg/mL の Kanamycin を添加した King's B 液体培地で 28 °C、12 時間培養します。

遠心分離により細菌培養物を回収し、暗所で長波長UVランプを用いて緑色蛍光の有無を確認します。滅菌水で2回洗浄した後、細胞を任意の濃度の滅菌水で再懸濁し、OD 600を調整します。その後、それぞれの病原体をターゲットの軸側に接種します。

必要に応じて、遺伝子サイレンシングを導入した葉を直径約1.5 cmの円形に切り出します。同時に、標的遺伝子をサイレンシングした植物における非宿主病原体の増殖を試験し、比較のためにベクターコントロールも含めてください。細菌を接種し、2日から5日かけて増殖させます。

接種した葉を暗所で長波長UVライトに照射します。必ず皮膚と目の保護具を着用してください。葉の表面から放出される赤色蛍光を背景として、葉の軸側にある緑色蛍光のスポットとして細菌コロニーを観察します。

ポジティブコントロールとして機能する宿主病原体から放出される緑色蛍光を確認します。接種後2日から5日まで、毎日病原体の増殖を観察してください。サイレンシングによって1種類以上の非宿主病原体の増殖が認められたクローンのリストを作成します。

一次スクリーニングにおける偽陽性を除去します。選択したクローンを用いてVIGsを繰り返し、遺伝子サイレンシング植物の非標的病原体に対する応答を再度試験します。選択したクローンに対してコロニーPCRを行い、T RV twoベクター内のA TTB oneおよびTB twoプライマー、またはクローニング部位を挟むプライマーを用いてインサートを増幅させます。

PCR産物をアガロースゲルで電気泳動し、単一のバンドが増幅していることを確認します。次に、ATTBプライマーまたはクローニング部位を挟むプライマーを用いて、TRV2ベクター内の植物遺伝子挿入断片のシーケンシングを行います。得られた配列を用いてBLAST解析を行い、遺伝子の詳細を特定します。

タバコガラガラウイルス（TRV）ベースのベクターを用いて、Nicotiana hamanaにおいて多数の遺伝子をサイレンシングするための汎用プロトコルを、このフローチャートで示します。遺伝子サイレンシングされた植物の一部では、成長抑制、黄化、光退色表現型など、さまざまな表現型の変化が見られました。

これらのデータは、植物への接種前に暗所でUV光に曝露させた病原体の緑色蛍光と、接種3日後の成長を示しており、対照として白色光の下で曝露した同じ葉を示しています。この実験では、3種類の非宿主植物におけるG-F-P-U-V発現細菌の成長を追跡しています。

免疫を持つ野生型の非サイレンシングNicotiana hamama植物における非宿主病原体への感受性を、遺伝子サイレンシング植物の同定プロセスの実証に用いて検討しました。これらの病原体は増殖しませんでした。しかし、少なくとも2種類の非宿主病原体がNB sgt上で増殖しました。

単一遺伝子がサイレンシングされた葉。細菌増殖の定量データは、非ST耐性が損なわれた遺伝子サイレンシング植物を特定するプロセスを示しています。この figs を介した順方向遺伝学的手法を用いて、Nicotiana hamana の約 5,000 個の遺伝子をサイレンシングし、約1年半の期間にわたって非ST耐性が損なわれた植物を特定しました。

例として、本スクリーニングで同定された2つの遺伝子サイレンシング植物における非宿主病原体の増殖をここに示します。本手法により、数百の遺伝子に対してウイルス誘導性遺伝子サイレンシングを行い、その後、植物体内で非宿主病原体の増殖を観察してサイレンシング植物を評価し、非宿主抵抗性を解析する方法を提示できたと考えています。このウイルス誘導性遺伝子サイレンシングを用いたプロトコルを利用することで、約2〜3週間の期間で数百の遺伝子をサイレンシングさせ、その後、GFPで標識された非宿主病原体の増殖を1日あたり約2〜3時間、合計2〜5日かけて評価することが可能です。