3.6: C. elegansの基礎研究のためのメンテナンスについて

線虫の正しい手入れと維持は、実験を成功させるために不可欠です。

スペースをほとんど必要とせず、安価に収納でき、繁殖力が高く、操作も簡単です。しかし、簡単に持ち運べるからといって、科学が弱虫であるわけではありません。実際、シドニー・ブレナーがC.エレガンスを「科学への自然の贈り物」と呼んだことは有名で、1974年に導入されて以来、この線虫はノーベル賞を受賞した多くの実験で取り上げられてきました。

このビデオでは、実験室でC.エレガンスを維持するための基本的な方法(ハウジングと給餌、取り扱い、およびワームの凍結と解凍)を示します。

野生では、C.エレガンスは土壌中に生息し、分解する植物を食べます。研究室では、線虫をできるだけ幸せに保つことが重要であるため、非常に特殊な方法を使用して線虫を飼育し、餌を与えます。

25歳で育てたとき?C、C.エレガンスは、16°Cで成長したときよりも2.1倍速くライフサイクルを完了します。 ライフサイクルが速いということは、ワームがより早く成熟し、より多くの卵を産み、より多くの食物を消費することを意味します。 ワームが飢えたり、混雑しすぎたりすると、ダウアーステージと呼ばれる幼虫のステージに入ります。 ダウアーの幼虫はストレスに強く、老化しません。

C.エレガンスを固体培地に維持すると、線虫増殖培地またはNGM培地で調製した寒天プレート上で増殖します。プレートを作成する前日に、液体LB培地にOP50 E.coliの単一コロニーを接種します。37歳で培地をインキュベートしますか?Cは振って一晩。

固体培地を作るには、これらの成分の適切な量を測定し、三角フラスコ内の脱イオン水と組み合わせます。

少なくとも15分間オートクレーブした後、寒天を55°Cまで冷まします。水浴の中のC。 メディアが55に冷えたら?C ガラス容器を素手で快適に保持できるはずです。 適切な無菌技術を使用して、この時点で医薬品や抗生物質などの添加物を追加できます。渦巻き模様にして混ぜます。次に、溶融したNGMをペトリプレートにピペットで入れ、2/3になるまで充填します。 新しく作ったプレートをベンチで一晩乾かします。

翌朝、OP50を3500 x gで10分間ペレット化し、LB培地中の細菌を10倍の濃度に再懸濁します。次に、中央の芝生を各プレートにピペットで移します。 ピペットチップをNGMの表面に触れないようにし、培養物がプレート壁に触れないように注意してください。 プレートをベンチで一晩乾かしておきます。 乾いたら、プレートをUV光にさらして滅菌します。 これで、ワームの培養に使用する準備が整いました。

ワイヤーを約3〜4cmカットし、ピペットの先端の内側に0.5cm入れます。ブンゼンバーナーでワイヤーをガラスに密封します。ガラスから突き出たワイヤーの長さは約3〜3.5cmですが、個々の好みによって異なります。

ハードエッジを使用してワイヤーの端を平らにします。次に、平らにした部分を上に曲げてスコップを形成します。 最後に、ワームや寒天の損傷を防ぐために、ピックの端を研磨します。

ワームを摘むには、炎の上のピックのワイヤーを滅菌します。次に、NGMプレートの厚くて粘着性のあるOP50 E.coliで先端をコーティングします。寒天表面に穴を開けたり傷つけたりしないように注意してください。

解剖スコープを覗きながら、ワームがピックにくっつくまで、平らにされた粘着性のあるピックにワームを軽くすくい取ります。

ワームがピックに乗ったら、すぐに先端を新しいプレートの新しい表面に軽く保持し、バクテリアの芝生を横切ってスライドさせて移します。 ワームはピックから這い出るはずです。 ワームはピックに長時間留まるか、乾燥する可能性があります。

C.エレガンスが研究のモデルとして人気がある理由の一つは、培養物を長期間保存しても悪影響を及ぼさないことです。

まず、飢餓状態になったばかりの幼虫を0.5 mLのM9バッファーで洗い、穏やかに渦巻いてすべての幼虫と成体動物をほぐした後、微量遠心分離機またはクライオチューブに移します。次に、M9バッファーに等量の30%グリセロールを添加します。最後に、バイアルを断熱ボックスに詰め、-80°Cで保管します。

ワームを回収するには、-80°Cの冷凍庫からチューブを取り出し、内容物が完全に溶けるまで室温で解凍します。OP50芝生で新しいNGMプレートに液体をピペットで移し、20°Cでインキュベートします。2〜3日後、10〜15匹の動物を新しいプレートに移し、1世代にわたって繁殖させます。 子孫を収集し、正しい表現型を採点します。

C.エレガンスが研究室でどのように維持されているかを見てきたので、実験のために摂食、ハウジング、および取り扱い条件がどのように変更されるかを見てみましょう。

ノーベル賞を受賞したRNA干渉の発見により、研究者はC.エレガンス遺伝子をサイレンシングしてその機能を決定することができました。

線虫のRNAiを誘導するには、まず標的遺伝子dsRNAを発現する大腸菌のプレートを調製し、線虫がそれを食べるようにします。

次に、第4幼虫期の線虫をRNAiプレートに移し、産卵させます。 開発の望ましい段階で、子孫が収集され、表現型について採点されます。私たちはゲノムの約半分を線虫と共有しているため、収集された洞察の多くは人間の病気に適用できます。

C.エレガンスは、その短いライフサイクルのために、老化のモデルとして特に適しています。

まず、成体の雌雄同体がNGMプレートに卵を産むことができるようにすることで、C.エレガンスの時間同期した個体群が生成されます。ワームは6〜8時間卵を産み、その後取り除かれます。

線虫が目的の段階になると、細菌汚染を防ぐためにアンピシリンを含む新しいNGMプレートに移され、繁殖を防ぐためにFUDRが送られます。

この時点から、成虫はすべての線虫が死ぬまで2〜3日ごとに観察されます。 死んだワームをプレートから取り除き、生きているワームと死んだワームの数を記録します。

遺伝的または環境的な侮辱の文脈で寿命を分析すると、老化プロセスに関する重要な洞察を得ることができます。

レーザーを使用して、生きたC.エレガンスで軸索切開術または個々の軸索の切断を行い、神経細胞がどのように再生するかを研究することが可能です。

しかし、線虫はじっとしていないため、マイクロビーズの溶液中の10%アガロースパッドに配置されます。 カバースリップが上に置かれます。 マイクロビーズは、パッドとカバースリップの相互作用の摩擦係数を増加させ、ワームを所定の位置に効果的に凍結します。

これで、軸索切開術を行うためのスライドの準備が整いました。ニューロンが視界に入り、顕微鏡の中心に配置されます。次に、フットペダルを使用してレーザーを発射します。 最適なレーザー出力は、隣接する構造を傷つけることなくニューロンを切断します。 動物ごとにできるだけ多くの軸索が切断されます。

次に、アガロースパッドをスライドから慎重に取り除き、線虫を播種したNGMプレート上で20°Cで回復させます。軸索切開術後8〜48時間の間に、ニューロンは再生のためにスコアリングする準備をすることができます。 切り傷の遠位部分では、ニューロンが切り株を形成します。しかし、近位部分ではニューロンが再生し、細長い神経突起を形成します。

JoVEが基本的なCeanorhabditis elegansのメンテナンスを引き受けるのを見てきました。このビデオでは、C.エレガンスの飼育と給餌、それらの取り扱い、線虫の凍結と回復についてレビューしました。

また、C.エレガンスを強力な研究ツールにしているいくつかのアプリケーションについても簡単に紹介しました。C.エレガンスは多くの点で哺乳類と異なりますが、遺伝的構成が似ていること、維持管理の容易さ、簡単な操作が、哺乳類の生物学と病気を理解するための重要なモデルとなっています。 ご覧いただきありがとうございます!