Name: ザ·アフリカツメガエル卵母細胞のカットオープンワセリンギャップ電圧クランプ法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 学ぶカットオープンワセリンギャップ電圧クランプ法を用いて、アフリカツメガエル卵母細胞で電位依存性イオンチャネルの低ノイズ記録を行う手法。この方法は高速チャネル動態の高時間分解能解析に有用である。

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セントルイス心臓分子工学研究所のワシントン大学のすべてのメンバー。 （JSに）1010299 - バロウズは科学的なインターフェイスで、基金のキャリア賞を歓迎します。

<ol><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+internal+pore+opening+in+KV+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).</li>
<li>Stefani, E., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cut-open+oocyte+voltage-clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cut-open oocyte voltage-clamp technique.</a> Methods Enzymol. 293, 300-318 (1998).</li>
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<li>Stefani, E., Toro, L., Perozo, E., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+of+Shaker+K%2B+channels%3A+I.+Ionic+and+gating+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Gating of Shaker K+ channels: I. Ionic and gating currents.</a> Biophys. J. 66, 996-1010 (1994).</li>
<li>Wang, S., Liu, S., Morales, M. J., Strauss, H. C., Rasmusson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+the+activation+and+inactivation+kinetics+of+HERG+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiolt%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of the activation and inactivation kinetics of HERG expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Physiolt. 502 (Pt 1), 45-60 (1997).</li>
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<li>Silva, J. R., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensor+movements+describe+slow+inactivation+of+voltage-gated+sodium+channels+I%3A+wild-type+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Na%28V%291.4.+J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels I: wild-type skeletal muscle.</a> Na(V)1.4. J. Gen. Physiol. 141, 309-321 (2013).</li>
<li>Silva, J. R., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensor+movements+describe+slow+inactivation+of+voltage-gated+sodium+channels+II%3A+a+periodic+paralysis+mutation+in+Na%28V%291.4+%28L689I%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels II: a periodic paralysis mutation in Na(V)1.4 (L689I).</a> J. Gen. Physiol. 141, 323-334 (2013).</li>
<li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+voltage+clamp+to+record+small%2C+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li>
<li>Clare, J. J., Trezise, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClare%2C+JJ+%22Expression+and+analysis+of+recombinant+ion+channels+%3A+from+structural+studies+to+pharmacological+screening%22">Expression and analysis of recombinant ion channels : from structural studies to pharmacological screening</a>. , Wiley-VCH. (2006).</li>
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<li>Cohen, S., Au, S., Pante, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
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<li>Gagnon, D. G., Bissonnette, P., Lapointe, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+disulfide+bridge+linking+the+fourth+and+the+seventh+extracellular+loops+of+the+Na%2B%2Fglucose+cotransporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a disulfide bridge linking the fourth and the seventh extracellular loops of the Na+/glucose cotransporter.</a> J. Gen. Physiol. 127, 145-158 (2006).</li>
<li>Pantazis, A., Olcese, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPantazis%2C+A+%22Cut-Open+Oocyte+Voltage-Clamp+Technique.+In%3A+Roberts+G.+%28Ed.%29+Encyclopedia+of+Biophysics%3A+SpringerReference%22">Cut-Open Oocyte Voltage-Clamp Technique. In: Roberts G. (Ed.) Encyclopedia of Biophysics: SpringerReference</a>. Roberts, G. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. New York. (2013).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

カットオープン卵母細胞ワセリンギャップ電圧クランプ法は、データの迅速な解決を可能にし、低ノイズで、比較的長いプロトコル19に係る内部液と外液組成を制御し、安定した録画を増加させた。これらの利点は別として標準の2電極電圧クランプおよびパッチクランプ技術から、この手法を設定してください。特殊な装置が必要であり、プロトコルが比較的困難であるされていますが、システムが最適化された後、非常にいくつかの問題が発生します。これは、ナトリウム（HNA V 1.5）と、他の高速活性化チャネルの再現性のある録音が可能になります。 プロトコルの中で最も重要なステップは、V1電極と卵母細胞と串刺しに上部チャンバーの配置である。細胞および室孔の縁部との間のシールの気密性は、記録品質に大きな影響を有する。上部チャンバーは、可能な限り最高の再を実現するために、セルを下にプッシュする必要があります卵母細胞にダメージを与えることなくsistance。これは、卵母細胞の膨らみを作る必要とし、フラット化が、細胞質の経験と配慮が破裂を防止するための最適な圧力を決定するために必要...

特殊な電圧クランプ技法を制御膜電位におけるイオン電流の記録を可能にする。広く使用される2つの電極電圧クランプ（TEVC）およびパッチクランプ技術は、多くのイオンチャネルの電気生理学的特性に関する信頼できる情報を提供する。しかしながら、これらの方法の両方は、高速電位依存性ナトリウムチャネルおよびアフリカツメガエル卵母細胞のもののような膜における他の高速活性化チャネルに対する信頼性のあるデータの取得を妨げる欠点を有する。 Bezanillaとステファニー·ラボラトリーズは、結果的に卵母細胞2のカットのオープンワセリンギャップ電圧クランプ法（COVG）を開発しました。技術をNa +、K +、およびCa 2 +チャネル3-8を記録するために広く適用されている。 COVG記録中に、異種タンパク質を発現する卵母細胞膜は、3つの領域に分割されている。イオン電流のデータは次のように卵母細胞の上部領域から記録されている上部領域を取り囲む浴を容易かつ迅速に変更することができるコマンド電位にクランプされる。中間領域の頂部領域9と同電位にクランプされることにより、リーク電流を保護します。卵母細胞開度（カットオープン）サポニン溶液またはカニューレの使用を介して発生する場所底部領域である。化学的または底部領域での膜のマニュアル開はグランドにクランプされた内部電位の制御を可能にし、下部チャンバ溶液で細胞内部の連続をレンダリングする。上部チャンバー内の溶液交換は、外部環境を変えるのに対して、下室への解決策の灌流は、内部環境の特性を調整することができます。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1.jpg" width="500px" /> 図1。卵母細胞のカット開放電圧クランプバースセットアップ図（A）トップ互いから分離された3つの浴のダウン図である。 COVG用チャンバーの寸法は、図に表示されます。 （B）試験位置にある風呂セットアップの側面図。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 COVG技術の利点は、低電流ノイズ（3 kHzでは1nA）、外部媒体のイオン組成、内部メディア、高速時間分解能（の減衰20-100秒の時定数を調節する能力の制御を含む容量過渡）、数時間9安定した録音。欠点は、それが特殊な装置を必要とし、2つの電極電圧クランプ（TEVC）10と比較して行うことはより困難であることである。 COVGアプローチは非常に特殊な装置や複雑な手順要素が必要ですが、それは貴重の取得を可能にすることができることができ、電気生理学的データ。このような高速の動態およびテール電流4に電流をゲートするように、このデータは、チャネルランダウンを含め、他の電圧クランププロトコルに関連する問題のいくつかがなく記録することができます。 COVGのセットアップへの軽微な変更は、温度コントローラと電圧クランプ蛍光法（VCF）の使用を可能にすることができる。 COVGアセンブリ内の電圧クランプ蛍光測定要素を含めることは、同時に、現在の11-13を記録しながら、タンパク質コンホメーション変化を監視する機能を付与することによりデータ出力を増大させることができる。

<table><tbody><tr><td>外部ソリューション</td><td>ブランド</td><td>カタログ番号</td><td>[最終]、重量、または容量</td></tr><tr><td>N-メチル-D-グルカミン (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>25mM</td></tr><tr><td>MES ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>90mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>研究製品 International</td><td>H75030</td><td>20mM</td></tr><tr><td>水酸化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2mM</td></tr><tr><td>MES ハイドレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>変数 (pH から 7.4)</td></tr><tr><td>内部溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-メチル-D-グルカミン (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>105mM</td></tr><tr><td>MES ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>10mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>研究製品インターナショナル</td><td>H75030</td><td>20mM</td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸 (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>2mM</td></tr><tr><td>MES 水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>可変 (pH 7.4)</td></tr> <tr><td>脱分極液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>110mM</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>1.5mM</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>ケーソン</td><td>C021</td><td>0.8mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>研究製品 インターナショナル</td><td>H75030</td><td>10mM</td></tr><tr><td>ピペット溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>3M</td></tr><tr><td>サポニン溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>サポニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>0.125g</td></tr><tr><td>内部溶液</td> 上記<td>参照</td><td></td><td>50mL</td></tr><tr><td>寒天ブリッジ溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-メチル-D-グルカミン (NMDG)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>100ml 1M</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>研究製品 インターナショナル</td><td>H75030</td><td>1.2g</td></tr><tr><td>MES ハイドレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>変数 (pH 7.4)</td></tr> <tr><td>顆粒寒天</td><td>研究製品国際</td><td>A20250</td><td>3%</td></tr><tr><td>NMDG貯蔵溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMDG、HEPES、MES、水和物溶液</td><td>上記</td><td></td>を参照 <td>40ml</td></tr><tr><td>水</td><td></td><td></td><td>60ml</td></tr><tr><td>材料/機器の名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント/説明</td></tr><tr><td>高性能卵子クランプ</td><td>ダガン</td><td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>データ取得システム</td><td>Axon CNS</td><td>&nbsp;Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>オシロスコープ</td><td>Tektronix&nbsp;</td><td>TDS 210</td><td></td></tr><tr><td>ラックパワー</td><td>フィルターAPC&nbsp;</td><td>G5</td><td></td></tr><tr><td>加熱/冷却バス温度コントローラー</td><td>Dagan</td><td>HCC-100A</td><td></td></tr><tr><td>PC</td><td>Dell</td><td>Optiplex 990</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software</td><td>Molecular Devices, LLC</td><td>pCLAMP10.3</td><td></td></tr><tr><td>TMC 振動制御卓上プラットフォーム</td><td>TMC</td><td>64 SERIES</td><td></td></tr><tr><td>TMC 振動制御エアテーブル</td><td>TMC</td><td><a name="範囲!C10">20シリーズ&nbsp;</a></td><td></td></tr><tr><td>V1/I電極データコレクタ</td><td></td><td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>MX10Lマイクロマニピュレータ</td>のダガン部分 <td>Siskiyou</td><td>MX10L</td><td></td></tr><tr><td>バス/ガード(I / V) ヘッドステージ(適切なコネクタ付き)</td><td>CA-1B</td><td></td>顕微鏡の<td>ダガン</td>部分</tr><tr><td></td><td>オマノ</td><td>OM2300S-JW11</td><td></td></tr><tr><td>温度制御バス</td><td>カスタムまたはダガン</td><td>カスタムまたはHE-204C</td><td>Cool Polymers(Dシリーズ)の材料で作られたカスタムチャンバー。ダガンはまた、プレフェブリケーテッドステージ(HE-204C)を提供しています。</td></tr><tr><td>カスタムAgClペレット容器</td><td>カスタム</td><td>カスタム</td><td>加工</td></tr><tr><td>カスタム加工 Ag/AgCl電極、ペレット、2.0mm</td><td>ワーナーE-206</td><td></td><td></td></tr><tr><td>外部卵子バス</td><td>カスタムまたはダガン</td><td>カスタムまたはCC-1-T-LB</td><td>ダガンからカスタム加工または購入</td></tr><tr><td>内部卵子バス</td><td>カスタムまたはダガン</td><td>カスタムまたはCC-TG-ND</td>ダ<td>ガン</td></tr><tr><td>からカスタム加工または購入寒天ブリッジおよびプル電極用キャピラリー</td><td>ワー</td><td>ナーG150T-4</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡、マイクロマニピュレーター、バス用回転マウント</td><td>シスキユー</td><td>SD-1280P</td><td></td></tr><tr><td>ファイバーライト</td><td>ドーラン・ジェンナー</td><td>LMI-600</td><td></td></tr><tr><td>レギュラーブリーチ</td><td>クロロックス</td><td>470174-764</td><td></td></tr><tr><td>Xenopus laevis 卵子</td><td>Nasco</td><td>LM535M (性的に成熟した女性)</td><td></td></tr><tr><td>90 Na+ 外部ソリューション</td><td>ソリューション シート</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 Na+ 内部ソリューション</td><td>シート</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 M KCL</td><td>ソリューション シート</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>NMDG ストレージ ソリューション</td><td>シート</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5mLトランスファーピペット</td><td>SciMart</td><td>GS-52</td><td></td></tr><tr><td>改質KCl電極インジェクター</td><td>BD</td><td>309659</td><td>プラスチックシリンジの先端を溶かして電極に溶液を注入できるようにしました。また、WPIのMicrofilを購入することもできます。</td></tr><tr><td>Microvaccum</td><td>カスタム</td><td>カスタム</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>VWR63040-458</td><td></td><td></td></tr><tr><td>卵子ハンドリングツール(ピペットポンプ)</td><td>VWR53502-222</td><td></td><td></td></tr>脱<tr><td>イオン水噴出ボトル</td><td>VWR16649-911</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ワセリンワセリンフィッシャー</td><td>サイエンティフィック</td><td>19-086-291&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VCF記録に必要な追加材料:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VCF顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>Eclipse FN1</td><td></td></tr><tr><td>Nikon CFI APO 40XW NIR 対物レンズ</td><td></td><td>Nikon N40X-NIR</td><td></td></tr><tr><td>X-Y 固定ステージ直立顕微鏡用トランスレーターシステム</td><td>Sutter Instruments</td><td>MT500-586</td><td></td></tr><tr><td>External VCF Oocyte Bath</td><td>Custom</td><td></td><td>カスタム加工。チャンバーの寸法は2.7 x 1.9 x 0.4 cmです。</td></tr><tr><td>内部VCF卵母細胞バス</td><td>カスタム</td><td></td><td>カスタム機械加工。チャンバーの寸法は1.6 x 1.6 x 0.4 cmです。</td></tr><tr><td>改良型温度制御バス</td><td></td><td></td><td>カスタムカスタムチャンバーは、クールポリマー(Dシリーズ)の材料で作られています。変更された温度調節器の浴室の寸法は、水平チャンバーが2.7 x 1.9 x 0.3 cm、垂直チャンバーが1 x 2.5 x 0.5 cmです。</td></tr></tbody></table>

ザ·<em&gt;アフリカツメガエル</em蛍光測定で&gt;卵母細胞のカットオープンワセリンギャップ電圧クランプ法

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

カットオープン卵母ワセリンギャップ（COVG）電圧クランプ技術は、卵母細胞における異種イオンチャネルの電気生理学的および動力学的特性の分析を可能にする。カットオープンセットアップからの記録は、低振幅ゲート電流、急速なイオン電流の活性化、および非アクティブ化を解決するために特に有用である。 2電極電圧クランプ（TEVC）技術上の主な利点は、増加したクランプ速度、改善された信号対雑音比、および細胞内および細胞外環境を調節する能力が挙げられる。 ここでは、人間の心臓のナトリウムチャネル（HNA V 1.5）を採用し、切り開い設定やプロトコルだけでなく、電圧クランプ蛍光測定機能を追加するために必要な変更を示すために、 アフリカツメガエル卵母細胞で発現。 このようなHNA V 1.5の速度で活性化イオンチャネルの特性は、完全にwhicで、TEVCを用いて室温付近では解決できないhは、卵母細胞膜の全体が電圧制御を困難にクランプされる。しかしながら、カットオープン技術では、細胞膜の小部分のみの単離は、パッチクランプ技術に関連するチャネルランダウンを防止しつつ、正確に速い反応速度を記録するために必要な迅速な締付けを可能にする。 COVG法、イオンチャネル動態及び電気生理学的特性に関連してさらにタンパク質の動きが細胞外に適用さフルオロフォア、遺伝的にコード化された蛍光タンパク質の挿入、または非天然アミノ酸の組込みのシステインコンジュゲーションを介して追跡される電圧クランプ蛍光法を用いてアッセイすることができる関心1の領域へ。この追加データは、蛍光分子を取り巻く微小環境の変化を介してタンパク質の電位依存性のコンホメーションの再編成についての速度論的な情報が得られます。

図4のディスプレイは、サポニン溶液として卵母細胞の透過性の変化は、卵母細胞の底部に印加される。5サポニン透過化以下の拡散によって細胞内液交換の速度を示している図 。 20〜40分は、定常状態の2,18に来るために必要とされています。 記録プロトコルから生成された図6aショートレースします。図は、電圧プロトコル（挿入図）に応じて、イオン電流（P/-8リーク減算後）を示している。図中の各トレースは、異なる印加電圧を表す。最も遅い速度論とトレースはナトリウムチャネルを開くことができる最低の電位を表しています。内向き電流は、膜を脱分極するため、通常、伝統的な方法を用いて、これらの電位が低いために電圧制御を維持することは困難である。今度はこの脱分極は、正のフィードバックループを作成する複数のチャネルを活性化する<html> 。カットのオープン技術の改良されたクランプ速度があってもこのような困難な電位でチャネルを記録するのに必要な電圧制...

カットオープンワセリンギャップアプローチは、高速チャネル動態の高解像度で、アフリカツメガエル卵母細胞で発現電位依存性イオンチャネルからのイオンおよびゲート電流の低ノイズの録音を得るために使用される。マイナーな変更を加えて、電圧クランプ蛍光法は、カットオープン卵母プロトコルに結合することができる。

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

この手順の目的は、zap cyteに発現させた電位依存性イオンチャネルから、高速なチャネルキネティクスを高い時間分解能で捉え、イオン電流およびゲーティング電流の低ノイズ記録を得ることであります。まず、記録したイオンチャネルのmRNAをカエル卵細胞に注入します。次に、キャピラリーチューブを成形し、塩を含むアガロース溶液を充填することでアガーブリッジを作製します。次に、UO部位やアガーブリッジを含むすべてのコンポーネントを指定の位置に配置し、切開したリグを実験に向けて準備します。最後のステップとして、電圧クランプ記録を可能にするために、マイクロ電極をUO部位に挿入します。最終的に、この記録プロトコルを用いて、卵細胞膜に存在するイオンチャネルからのイオン電流を示します。カットオープン電位固定法（cut open voltage clamp technique）の主な利点は、非常に多くのイオンチャネル集団を、低ノイズで安定して記録できることです。また、チャネルのキネティクスを迅速に解析することも可能です。Oサイト、上部チャンバー、およびアガーブリッジの配置など、習得が困難な手順があるため、この手法を視覚的に提示することは極めて重要です。この手順では、ホウケイ酸キャピラリーチューブの一端を中程度の炎で加熱し、アガーブリッジを少なくとも6個作成します。それぞれのチューブについて、キャピラリーチューブの先端が青色炎の上部に位置するようにしてください。キャピラリーチューブが加熱されたら、ピンセットを使用して90度に曲げます。曲げ部分は急激な角ではなく、滑らかな曲線にする必要があります。そうしないと、ガラスの内径が大幅に減少して充填が困難になり、ブリッジの抵抗が増大する可能性があります。その後、曲げていない方の端から約25 millimetersの位置でキャピラリーチューブを加熱します。最初の曲げと同じ方向に、この位置で2回目の90度の曲げ加工を行います。キャピラリートラックが冷却した後、ダイヤモンドチップ付きガラスカッターを使用して、ブリッジの脚を約5 mmにトリミングします。次に、3つの電流供給ブリッジのキャピラリーチューブに白金線を挿入します。チューブの外に白金線が露出しないよう、余分な白金線を切り取ります。先端の細い器具を用いて白金線をキャピラリーチューブのさらに奥へと押し込み、白金線がキャピラリーチューブの両端のガラス端よりも1 mm短くなるように調整します。次に、あらかじめ調製しておいたアガー溶液に、脚を上にした状態でキャピラリーブリッジを1本ずつ加えます。ブリッジ内に気泡や隙間がなくなったことを確認したら、ブリッジをアガー溶液から取り出し、ペーパータオルに乗せて乾燥させます。あるいは、小さなピペットチップを装着したシリンジでアガー溶液を押し込み、ブリッジを充填す

the-xenopus-oocyte-cut-open-vaseline-gap-voltage-clamp-technique-with

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

これは、アフリカツメガエル卵母細胞からパッチクランプ記録の紹介を目的としています。それは、卵黄膜の除去、gigaohmシール（gigaseal）の形成、および外部のアウトトポロジへのパッチの任意の変換をカバーしています。...

アフリカツメガエルの卵母細胞で発現イオンチャネルのパッチクランプ記録

BKチャネルのイオン電流をパッチクランプ技術を使用して記録されます。...

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

我々は単一細胞の蛍光を用いて立体構造変化の部位特異的解析と並んで膜タンパク質のイオン輸送の動態を測定する方法を説明します。この手法は、イオンチャネル、トランスポーター、イオンポンプに適応可能であり、タンパク質サブユニット間の距離の制約を決定するために利用することができます。...

膜タンパク質の構造動力学を調べるその場で部位特異的蛍光標識を持つ

私たちは、Xenopus卵子における酵素の不均一発現と、原子吸光分光光度法による個々の細胞へのRb+またはLi+の取り込みを測定することにより、K+逆輸送P型ATPaseの活性を定量化する方法を説明しています。この方法は、放射性同位元素フラックス実験に代わる高感度で安全な方法であり、複雑な速度論的研究を容易にします。...

のNa、KとH、K-ATPaseのインによって陽イオン輸送を測定する<em&gt;アフリカツメガエル</em原子吸光法による&gt;卵母：アイソトープアッセイの代替

TRPV4のを研究するためによく使用されるメソッドを補完するために、二つの方法が記載されている：その機械的感受性は、低浸透チャレンジの際に遺伝子組換え酵母中のCa 2 +-エクオリン発光測定により研究することができる。また、オンセルまたは切除されたモードでクランプ全細胞の2電極電圧クランプまたはパッチによりアフリカツメガエル卵母細胞に注入TRPV4-RNAで検査することができる。...

酵母発光測定とアフリカツメガエル卵母細胞電気生理学的検定試験

遺伝的にコード化された電圧指標を使用して膜電位の変化をイメージングする方法が説明されています。...

遺伝的にコードされた蛍光電圧センサーの2種類のイメージング膜電位

単一卵胞の単離、細胞質RNAマイクロインジェクション、周囲の細胞層の除去、およびXenopus卵子におけるタンパク質発現のための最適化された手順が説明されています。さらに、リガンド依存性イオンチャネルを用いた電気生理学的実験における迅速な溶液変化のための簡単な方法が提示されます。...

アフリカツメガエル卵母細胞：マイクロインジェクションのために最適化された方法、濾胞細胞層の除去、および電気生理学的実験における高速解法の変更

この記事では、マレイミド色素の代わりに蛍光非天然アミノ酸（fUAA）を用いて、イオンチャネルの構造的再配列を調べる従来の電圧クランプ蛍光光度法（VCF）の強化について説明します。この手順には、 アフリカツメガエル卵母細胞DNA注入、RNA / fUAA共注入および同時電流および蛍光測定が含まれる。...

電圧クランプ<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;蛍光性の非天然アミノ酸を用いた卵母細胞

ショウジョウバエmelanogaster光受容体からの全細胞記録は、様々な条件下での自然発生的な暗いバンプ、量子隆起、光に対する肉眼的応答、および電流 - 電圧関係の測定を可能にする。 D. melanogaster遺伝子操作ツールと組み合わせて、この方法は、遍在するイノシトール - 脂質シグナル伝達経路およびその標的であるTRPチャネルの研究を可能にする。...

全細胞電圧クランプ記録のための電気生理学的方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;感光体

アフリカツメガエル卵からの希釈されていない細胞質抽出物の調製およびライブイメージングの方法を記載する。...

アフリカツメガエル 動的細胞質組織を可視化するための卵抽出物調製およびライブイメージング法

ここでは、 アフリカツメガエル...

アフリカツメガエル卵母細胞からのギャップ接合電流の記録

学ぶカットオープンワセリンギャップ電圧クランプ法を用いて、アフリカツメガエル卵母細胞で電位依存性イオンチャネルの低ノイズ記録を行う手法。この方法は高速チャネル動態の高時間分解能解析に有用である。

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