Name: 組織工学：層状細胞シートの送達のための多細胞3D足場の構築 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶ 温感性ポリマーpNIPAMを用いた細胞シートの作製と、層状構造を持つ組織工学パッチの構築法。平滑筋細胞と内皮細胞を用いた多細胞3D足場の作製技術を解説します。

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この研究は、カリフォルニア再生医学研究所（CIRM;RN2-00921-1)、NIHが資金提供するNational Research Award(F32-HL104924)、およびCIRMトレーニンググラント(TG21163)。 資料提供:Glycosan Biosystems Inc / BioTime、Stephen Badylak博士(ピッツバーグ大学)

PNIPAAMコーティングされたプレートの1。作成<ol><li> 60％トルエン/ 40％ヘキサン溶液2ml中のPNIPAAmを2.6g溶解する。 </li><li> PNIPAAMが溶解するまで、撹拌を10分間60℃に混合物を加熱する。 </li><li>ブフナー漏斗中の直径60mmの円と場所紙にろ紙をカット。 </li><li>予め秤量したガラスビーカーにブフナー漏斗を通して溶液を濾過（ヘキサンは、プラスチックを溶かすように、プラスチックを使用しないでください）​​。 </li><li>ベル真空（24 psi）でO / N（16時間）にビーカーと内容を配置します。注：残留物をイソプロピルと反応させるまでは、それが酸素と接触しないことを確認しますので、酸化する。 </li><li> PNIPAAMの重量を確立するためにビーカーを秤量する。 </li><li> w / w溶液50:50の作成、のPNIPAAmにイソプロピルアルコールを追加します。 </li><li> UV光の下で組織培養プレートの表面に溶液2mlを置き、5分間コート。 </li><li>二回温PBS 2mlでプレートを洗浄し細胞培養に使用する前に。 </li></ol>細胞シートの2。作成注：標的器官の一次細胞の細胞シートは、多数の異なる方法を使用して作成することができ、または、ここで説明したように、熱応答性ポリマーを用いて組織培養表面をコーティングすることにより。プリコーティングされた感熱プレートはまた、多くのベンダーによって提供されています。 注：このプロトコルは、35mmディッシュを用いて培養するためのものである。簡単に述べると、細胞をまず、隣接セル間の横方向の接続を確立するためにコンフルエンスで24時間、最低37℃でインキュベートする。細胞シートを解放するために、プレートは32°C以下の温度にさらされる。細胞シートは、その後、血管内皮細胞と血管新生許容ヒドロゲルを含む強塩基繊維マトリックスに転送される。 <ol><li>細胞集団を分離します。注：この方法は、個別の導出手順や細胞の種類に依存している。ラットの大動脈平滑ムーSCLE細胞（RASMC）は、この例で使用されている。これらは、ラットの腹部大動脈から単離した初代平滑筋細胞である。 </li><li>温かい2mlのPBSで細胞を洗浄する。 </li><li> 5分間、細胞にトリプシン（または他の切断/解離溶液）3mlのを追加します。 </li><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）を含む培地、またはリン酸緩衝溶液（PBS）を3mlの添加によりトリプシンを阻害する。 </li><li>円錐管中の細胞を収集し、アリコートを数える。 </li><li> 5分間1000rpmで（228×g）で細胞をスピン。 </li><li>上清を吸引し、その増殖培地中で細胞を再懸濁（SmGM2プラス弾丸キット培養液をRASMCに使用されます）。 </li><li> 100％コンフルエンスを達成する濃度でPNIPAAM塗装板 - 35mmの感熱プレート上の細胞を含む培地を配置します。注：のRASMCの場合その数は/ cm 2の 100,000個の細胞であると決定された。しかし、通過中の細胞の喪失に起因し、そのバージニア州の120％<html> LUEが使用されます。 </li><li> 37℃のCO / Nにおけるインキュベーターに置きます。注意：プレートへの細胞接着を維持するために、37℃で細胞を維持することが重要である。 </li></ol>ファウンマトリックスの調製注：さまざまな3D繊維状マトリックスは、繊細な細胞シートとの間に強い繊維状マトリックスの層に使用することができる。いくつかの例には、これらの研究に使用ゲルフォーム、バイオガラス、天然の無細胞化材料26またはnanospun材料27,28ブタ膀胱マトリックス（UBM）は寛大に私たちの共同研究者、博士Badylakから提供された29。 <ol><li>使用前に、脱細胞化マトリックスが使用される場合、細胞内容物の欠如を含むマトリックスの特性を決定し、27,28、細胞特異的生存率、および空隙22 </li><li>所望のサイズおよび形状に予め滅菌行列をカット。注：ここでは、ホールパンチが4mmの直径の円を切断するために使用される。 </li></ol>ve_title &quot;&gt; 4。新生血管許容的ヒドロゲルに内皮細胞を播種注：内皮細胞は幹細胞または前駆細胞からの分化を含む多様な供給源から得ることができる。ここで、HUVECを使用している。 <ol><li>架橋時間がある限り、任意の許容性ヒドロゲル（フィブリン、コラーゲンゲル）を使用して、細胞が生存留まるように十分に短い。注：ここでは、ジスルフィド架橋で架橋されたヒアルロン酸（HA）ベースのゲルが使用される。 </li><li>会社のプロトコルに従って、HAハイドロゲルを準備します。 </li><li>内皮細胞を回収し、1×トリプシンを用いて、単一細胞溶液中に分散。注：のAccutaseまたは細胞解離緩衝液はまた、単一の細胞分散のために使用することができる。 </li><li> 15ミリリットルの円錐チューブに溶液/細胞を回収、PBSでFBS（これは、細胞が血清に接触しないことが重要である場合）、大豆トリプシン阻害剤の等量を用いて、トリプシン酵素を失活または10％。 </li><li> C言語細胞をount、パッチ寸法（以前に定量化）するために必要な体積を計算する。注：4mmのパッチについては、こちらを200万内皮細胞が使用される。 </li><li> 200万細胞を抽出し、新たな15ミリリットルコニカルチューブに入れる。 </li><li> 5分間（228×g）でスピン。 </li><li>コニカルチューブ中のペレットとして細胞を残し、上澄み液を吸引。 </li><li> 1比：1でHAとゼラチン液体材料を混ぜる。その後、ペレットを含むコニカルチューブに全体積の80％を追加します。 </li><li> 1 HA /ゼラチン混合物：1の内皮細胞を再懸濁</li><li>ステップ2からベースの繊維状マトリックスにHA /ゼラチン混合物中に懸濁した細胞を配置します。 </li><li>架橋剤の所望の総体積の5分の1（20％）を追加</li><li> 37℃で1時間インキュベートする。 </li></ol>細胞シートの5の単離<ol><li>で細胞培養フード内インキュベーターと場所からの細胞を含む35ミリメートルPNIPAAM処理プレートを外しRT。 </li><li>すぐに細胞から培地を吸引し、37℃に加熱された6％の通常のゼラチンの2ミリリットルを追加します。 </li><li>ゼラチンはまだ暖かいですが、通常のゼラチン（ムービー1）の表面下に沈め、ゼラチン中に金属格子を配置します。 </li><li>ゼラチンを硬化させること、5〜7分間氷の上にプレート全体を置きます。 </li><li> 7分後、慎重にプレートの側からゼラチンエッジを分離するために、スパチュラを使用し、その後、プレート（注）から金属格子持ち上げるために鉗子を使用します。6％のゼラチンを、そして細胞シートは、格子を持ち上げる必要があります。 </li><li>皿に細胞シートを移動し、慎重に構造物の上に格子を設定し、ベース繊維マトリックスヒドロゲルの組み合わせの上に置きます。注：細胞シートの頂端側は、まだトップの位置になります。 </li><li>温かいメディア（37℃）の2ミリリットルを追加します。 </li><li> O / Nがヒドロゲル表面に付着した細胞のシートを可能にインキュベートする。 </li><li> Tを削除する解決策は（約1時間）、または翌日を温めた後、彼は金属格子。 </li></ol>

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開示するものは何もありません。

プロトコルにおける重要なステップは次のとおりです。温度応答性高分子の板表面を被覆し、プレートを冷却した後、細胞シートを操作する。異なるセルは、異なる物理的特性を示すので、接着性のような、昇降時間は、各異なる細胞型について最適化されるべきである。このプロトコルの第2、及び最も重要な挑戦的な成分は、細胞シート、組織アセンブリのための方法の重要な態様での操作に集中する。細胞シート内の単一細胞層は非常に脆く、鉗子で操作した場合、容易に引き裂くことができる。細胞シートを所定の位置に保持されていない場合また、それらは収縮する傾向があり、容易に折り畳むことができる。支援画面を使用して提案された細胞シートの転送が脆弱な細胞シートの操作を補助する。 この原稿で提示設計手法は、組織工学アプリのさまざまな細胞シートを作成することはかなり低コスト·アプローチを提供していますカチオン。また、大学の研究室内PNIPAAMコーティングしたプレートを作成すると、複数の細胞型、および表面に適合させることができるプロトコルに、この方法及び修正を標準化することができる。細胞シートではなく、組織化されていない単一の細胞の...

細胞および/または単一材料の注入だけでは、他の臓器系ではさまざまな成功を示しており、心臓再生では限られた成功しか得られません。5,7-12 現在、幹細胞由来の細胞は、組織への直接細胞注入や血液供給への灌流など、さまざまな送達方法を使用して損傷した組織に送達されています。13-17 また、細胞を単独で移植したり、材料を単独で移植したり、材料担体と組み合わせて移植したりして、損傷した臓器の再生を助けている人もいます。18-21 この設計は、材料強度、複数の材料および複数の細胞タイプでのパターニングを提供する複数の戦略を組み合わせたものです。 
具体的には、塩基の無細胞化繊維マトリックスが構築物に基本的な物理的強度を提供し、必要に応じて患者に縫合するのに適しています。 ベースマトリックス中の空隙空間は、移植された構築物の血管新生を迅速に確立するための新生血管許容ヒドロゲル22中の内皮細胞で満たされている。 次に、この複合材料は、細胞間コミュニケーションを強化し、天然組織をより忠実に模倣することを可能にする、事前にパターン化された細胞シートと統合されます。1,23-25 層状セルラーパッチの全体的な製造プロセスは、図1のフローチャートで概説されています。

<table><tr><tbody><td colspan="4">Reagents</strong</td></tr><tr><td>>Calcein-AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td>Cell tracker / live dye</td></tr><tr><td>Lysotracker Red</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td>Cell tracker</td></tr><tr><td>Neutral Red</td><td>Sigma</td><td>N7005</td><td>Visible Cell dye</td></tr><tr><td>pNIPAAM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>412780250</td><td>Poly(N-isopropylacrylamide)</td></tr><tr><td>トルエン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244511-1L</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296090-1L</td><td></td></tr><tr><td>RAOSMC</td><td>ロンザ</td><td>R-ASM-580</td><td>ラット 大動脈平滑筋細胞</td></tr><tr><td>SmGM2</td><td>ロンザ</td><td>CC-4149</td><td>平滑筋培地</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Invitrogen</td><td>C-003-5C</td><td>ヒト静脈内皮細胞</td></tr><tr><td>HyStem</td><td>グリコサン/Biotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>VWR インターナショナル</td><td>BDH1133-4LP</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>コーニング セルグロ</td><td>25-053-C1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ギブコ</td><td>14287-072</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ギブコ</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Specific Equipment</strong</td></tr><tr><td>>ろ紙</td><td>アールストロム&nbsp;</td><td>〒6310-0900&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ブフナーファンネル&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>Z247308&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>UpCellプレート&nbsp;</td><td>ヌンク&nbsp;</td><td>2014年11月&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>UVライト</td><td>ジェライトカンパニー&nbsp;</td><td>UVOクリーナー Model No.42</td><td></td></tr></tbody></table>

組織工学：層状細胞シートの送達のための多細胞3d足場の構築

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

そのような大人の人間の心のような多くの組織は、十分に損傷後に再生することができません。組織工学における2,3の戦略は、回復と修復に体を支援するために技術革新を提案する。例えば、TEアプローチは、心筋梗塞（MI）後の心臓リモデリングを減弱、おそらくほぼ正常プレMIレベルに総心臓機能を高めることができるかもしれません。4、心臓組織の正常な再生がの適切な送達を含む任意の機能的な組織と同様に移植された細胞/組織移植片の統合と生存に有利な環境合図で複数の細胞タイプ。送達ビヒクル、細胞の生存に及ぼす影響、材料強度、及び細胞 - 組織組織の促進として評価可溶性シグナル、細胞間相互作用、およびマトリックス材料：操作された組織が含む複数のパラメータに対処すべきである。のみこれらの必須要素を無視し、移植片細胞の直接注入を利用する研究。2,5,6これらの成分を組み合わせた組織の設計は、まだ開発されなければならない。ここでは、「組織」における新たな血管の形成を増強するための標的臓器の細胞型および内皮細胞を含む生物学的由来の材料の2つの異なる種類のパターン化された細胞シートの積層を使用して統合された設計の例を提示する。これらの研究は、心臓のような組織の発生に焦点を当てているが、この組織の設計は、最小限の設計および材料の変更と心臓以外の多くの臓器に適用することができ、再生治療のための既製品であることを意味する。プロトコルは5詳細な手順が含まれています。温度感受性ポリ（N -isopropylacrylamide）（PNIPAAM）が被覆組織培養皿に使用される。その後、組織特異的細胞は強い横癒着による細胞シートを形成するためにコーティングされたプレート/マイクロパターン表面の表面上で培養される。第三に、ベースマトリックスは、血管新生permissiを多孔性マトリックスを組み合わせることにより、組織のために作成されヒドロゲルおよび内皮ve細胞。最後に、細胞シートは、完全な構築物を作るPNIPAAM被覆皿から持ち上げ、ベース要素に転送される。

フロー図（ 図1）は 、多層パッチを製造する全体的な方法を示している。細胞シートは、32℃以下の温度をドロップすることによってPNIPAAM処理プレートから剥がれた。その後、細胞シートは、下層繊維性マトリックス（ 図1）に播種した内皮細胞を含有する架橋されたヒドロゲルの上に配置される。前処理された感熱プレートは、細胞シートを作成するために使用することができる。特別トポロジカル表面は、特にパターンのセル30（ すなわち、整列させる）ために使用されます。 ベース繊維状マトリックスは、天然組織マトリックスまたはエレクトロを脱細胞化から生成することができる。ここでは、繊維性材料シートは、パッチベース（ 図2A）のために直径4mmに切断した。この材料の特徴付けは、空隙を充填するために使用することができるハイドロゲルの量を決定するために重要である。ここで使用される行列はpreviouされましたずるいことを特徴と発表した。22 </p...

複雑な組織の高度に組織化された構造を作成するためには、複数の材料と細胞タイプを統合された複合材料に組み立てる必要があります。 この組み合わせ設計は、強力な繊維状マトリックスベースを含む2つの異なる生物学的由来の材料を含む臓器特異的な層状細胞シートと、新しい血管形成を促進するための内皮細胞を組み込んでいます。

組織工学：層状細胞シートの送達のための多細胞3D足場の構築

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

本手順の全体的な目的は、細胞シートを用いて組織工学パッチを構築することです。これはまず、細胞培養表面を温度感受性ポリマーであるポリプロピルアクリルアミド（p nipamとも呼ばれる）で処理することによって達成されます。第2のステップでは、目的の細胞をポリマーコーティングされた表面で高密度に培養し、細胞シートを作成します。次に、プレートの温度を下げることでシートを剥離させ、細胞をシート状のままプレートから脱離させます。最終ステップでは、細胞シートを破れさせないように注意しながら、移植用の構築物へと移動させます。最終的に、単純な光学顕微鏡を用いることで、移植可能な組織工学材料を作成する操作過程において、細胞シートが作成され、維持されていることを確認できます。細胞をハイドロゲルのようなマトリックスに埋め込む既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、細胞の側縁を機能的な組織として形成し、維持できる点にあります。また、これらの手法は組織工学分野におけるさらなる研究を可能にします。例えば、このように組織化された状態で移植された場合、細胞の生存率はどの程度になるかといった検討が挙げられます。本手順の実演は、私の研究室の博士研究員であるWilliam Turner博士とSnapshot sand do氏が行います。まず、2.6 gのP nipamを、60%トルエンおよび40%ヘキサンの混合溶液 2 mLに溶解させます。次に、混合物を60 °Cで10分間加熱し、P nipamが溶解するまで攪拌します。次に、ろ紙を直径60 millimeterの円形に切り、ブフナー漏斗に入れます。溶液をブフナー漏斗でろ過し、あらかじめ重量を測定したガラスビーカーに回収します。ビーカーと内容物をベル真空デシケーターに入れ、一晩静置します。その後、p nipamが入ったビーカーを計量します。続いて、p nipamにイソプロピルアルコールを加え、50 50重量比の溶液を作成します。次に、この溶液を2 mL、組織培養プレートの表面に滴下し、UV光下で5分間コーティングします。次に、細胞培養に使用する前に、プレートを2 mLの温めたPBSで2回洗浄します。この手順では、まず細胞を2 mLの温めたPBSで洗浄し、ラット大動脈平滑筋細胞を単離します。続いて、3 mLのトリプシンまたは他の解離液を細胞に加え、5分間インキュベートします。次に、10% FBSを含む培地またはPBSを3 mL、細胞に加えます。その後、細胞をコニカルチューブに回収し、細胞数をカウントします。続いて、細胞を1000 RPMで5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞を増殖培地で再懸濁します。次に、細胞を含む培地を35 mmの感温プレートに、100% Confluenceに達する濃度で播種し、37 °Cで一晩インキュベートして細胞をプレートに接着させます。その後、血管内皮細胞を回収し、単一細胞懸濁液として分散させます。単一細胞分散には、1x trypsin、Accutase、または細胞解離バッファーを使用することも可能です。次に、同量の大豆トリプシンインヒビターまたはPBSで希釈した10%FBSを用いて、トリプシン酵素を不活化させます。その後、細胞を15 mLコニカルチューブに回収します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測し、4 mmのパッチサイズに必要な細胞数を算出します。その後、200万個の内皮細胞を分取し、新しい15 mLコニカルチューブに入れます。次に、細胞を5分間遠心分離し、上清を吸引して、細胞をコニカルチューブ内でペレット状に残します。ここで、メーカーのプロトコルに従ってハイアロン酸ハイドロゲルを調製します。高濃度オーリンと液体ゼラチンを1:1の比率で混合します。続いて、最終総容量の80%をペレットの入ったコニカルチューブに移し、内皮細胞を高濃度オーリンゼラチン混合液中で再懸濁させます。次に、懸濁させた細胞を線維性マトリックスへと移します。最終総容量の20%に相当する架橋剤を加え、37 °Cで1時間インキュベートします。このステップでは、細胞を含む35 mmのP nypa処理済みプレートをインキュベーターから取り出し、細胞培養フード内に置きます。室温にて、細胞から培地を速やかに吸引除去します。次に、ゼラチンがまだ温かいうちに、37 °Cに加温した6% normal gelatinを2 mLプレートに加え、メタルラティスをnormal gelatinの表面下に沈むように配置します。その後、プレート全体を氷上に5〜7分間置き、ゼラチンを凝固させます。7分後、スパチュラを用いて、プレートの側面からゼラチンの端を慎重に剥がします。次に、ピンセットでプレートから金属格子を持ち上げます。細胞シートをディッシュに移し、繊維状マトリックスハイドロゲル複合体の上に配置します。組織培養プレートに37 °Cの培地を2 mL加え、細胞シートがハイドロゲル表面に接着するように一晩インキュベートします。その間に、溶液が温まったら金属格子を取り除きます。ここでは、細胞をPippaコーティングされた表面で培養し、その後、シート状に繊維状マトリックスの表面へ移動させました。ゼラチン金属格子を用いて移行させなかった初期の試行では、小さくぼろぼろになったパッチ状の結果となりました。この画像は、MitoTrackerで染色した赤色のラット大動脈平滑筋細胞、Calcium AMで緑色に蛍光染色したヒト臍帯静脈内皮細胞、および透過光画像を組み合わせた、初期パッチ設計の合成写真です。そして、こちらは細胞シートとより強固な基底線維状マトリックスヒドロゲルを組み合わせた合成写真です。この合成画像は、強固な基底線維状マトリックスを通してパッチの底面から撮影されており、この細胞シートの合成写真は基底線維状マトリックスの上方から撮影されています。シート状のハイドロゲル複合細胞がベースの繊維状マトリックスハイドロゲル複合体を被覆しており、細胞の密集によりエッジ部分で蛍光強度が増加していることがわかります。これは構築物の透過像であり、DPIにおける自家蛍光を発する天然繊維ベースマトリックスがここに示されています。この手順に続く他の組織工学実験によって、細胞の配向や相互作用が移植の成功にどのように影響するかといった、他の疑問に対する答えを得ることができます。この技術により、組織工学の研究者は、複数の細胞型を移植する複雑な手法を模索することが可能になります。溶媒の取り扱いは非常に危険であることに留意してください。本手順を実施する際は、適切なマスクの着用や化学薬品用フードの使用など、常に予防措置を講じてください。

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JoVE Journal

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組織工学：層状細胞シートの送達のための多細胞3D足場の構築

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