組織工学：層状細胞シートの送達のための多細胞3D足場の構築

本手順の全体的な目的は、細胞シートを用いて組織工学パッチを構築することです。これはまず、細胞培養表面を温度感受性ポリマーであるポリプロピルアクリルアミド（p nipamとも呼ばれる）で処理することによって達成されます。第2のステップでは、目的の細胞をポリマーコーティングされた表面で高密度に培養し、細胞シートを作成します。

次に、プレートの温度を下げることでシートを剥離させ、細胞をシート状のままプレートから脱離させます。最終ステップでは、細胞シートを破れさせないように注意しながら、移植用の構築物へと移動させます。最終的に、単純な光学顕微鏡を用いることで、移植可能な組織工学材料を作成する操作過程において、細胞シートが作成され、維持されていることを確認できます。

細胞をハイドロゲルのようなマトリックスに埋め込む既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、細胞の側縁を機能的な組織として形成し、維持できる点にあります。また、これらの手法は組織工学分野におけるさらなる研究を可能にします。例えば、このように組織化された状態で移植された場合、細胞の生存率はどの程度になるかといった検討が挙げられます。

本手順の実演は、私の研究室の博士研究員であるWilliam Turner博士とSnapshot sand do氏が行います。まず、2.6 gのP nipamを、60%トルエンおよび40%ヘキサンの混合溶液 2 mLに溶解させます。次に、混合物を60 °Cで10分間加熱し、P nipamが溶解するまで攪拌します。

次に、ろ紙を直径60 millimeterの円形に切り、ブフナー漏斗に入れます。溶液をブフナー漏斗でろ過し、あらかじめ重量を測定したガラスビーカーに回収します。ビーカーと内容物をベル真空デシケーターに入れ、一晩静置します。

その後、p nipamが入ったビーカーを計量します。続いて、p nipamにイソプロピルアルコールを加え、50 50重量比の溶液を作成します。次に、この溶液を2 mL、組織培養プレートの表面に滴下し、UV光下で5分間コーティングします。

次に、細胞培養に使用する前に、プレートを2 mLの温めたPBSで2回洗浄します。この手順では、まず細胞を2 mLの温めたPBSで洗浄し、ラット大動脈平滑筋細胞を単離します。続いて、3 mLのトリプシンまたは他の解離液を細胞に加え、5分間インキュベートします。

次に、10% FBSを含む培地またはPBSを3 mL、細胞に加えます。その後、細胞をコニカルチューブに回収し、細胞数をカウントします。続いて、細胞を1000 RPMで5分間遠心分離します。

上清を吸引し、細胞を増殖培地で再懸濁します。次に、細胞を含む培地を35 mmの感温プレートに、100% Confluenceに達する濃度で播種し、37 °Cで一晩インキュベートして細胞をプレートに接着させます。その後、血管内皮細胞を回収し、単一細胞懸濁液として分散させます。

単一細胞分散には、1x trypsin、Accutase、または細胞解離バッファーを使用することも可能です。次に、同量の大豆トリプシンインヒビターまたはPBSで希釈した10%FBSを用いて、トリプシン酵素を不活化させます。その後、細胞を15 mLコニカルチューブに回収します。

ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測し、4 mmのパッチサイズに必要な細胞数を算出します。その後、200万個の内皮細胞を分取し、新しい15 mLコニカルチューブに入れます。次に、細胞を5分間遠心分離し、上清を吸引して、細胞をコニカルチューブ内でペレット状に残します。ここで、メーカーのプロトコルに従ってハイアロン酸ハイドロゲルを調製します。

高濃度オーリンと液体ゼラチンを1:1の比率で混合します。続いて、最終総容量の80%をペレットの入ったコニカルチューブに移し、内皮細胞を高濃度オーリンゼラチン混合液中で再懸濁させます。次に、懸濁させた細胞を線維性マトリックスへと移します。

最終総容量の20%に相当する架橋剤を加え、37 °Cで1時間インキュベートします。このステップでは、細胞を含む35 mmのP nypa処理済みプレートをインキュベーターから取り出し、細胞培養フード内に置きます。室温にて、細胞から培地を速やかに吸引除去します。

次に、ゼラチンがまだ温かいうちに、37 °Cに加温した6% normal gelatinを2 mLプレートに加え、メタルラティスをnormal gelatinの表面下に沈むように配置します。その後、プレート全体を氷上に5〜7分間置き、ゼラチンを凝固させます。7分後、スパチュラを用いて、プレートの側面からゼラチンの端を慎重に剥がします。

次に、ピンセットでプレートから金属格子を持ち上げます。細胞シートをディッシュに移し、繊維状マトリックスハイドロゲル複合体の上に配置します。組織培養プレートに37 °Cの培地を2 mL加え、細胞シートがハイドロゲル表面に接着するように一晩インキュベートします。

その間に、溶液が温まったら金属格子を取り除きます。ここでは、細胞をPippaコーティングされた表面で培養し、その後、シート状に繊維状マトリックスの表面へ移動させました。ゼラチン金属格子を用いて移行させなかった初期の試行では、小さくぼろぼろになったパッチ状の結果となりました。

この画像は、MitoTrackerで染色した赤色のラット大動脈平滑筋細胞、Calcium AMで緑色に蛍光染色したヒト臍帯静脈内皮細胞、および透過光画像を組み合わせた、初期パッチ設計の合成写真です。そして、こちらは細胞シートとより強固な基底線維状マトリックスヒドロゲルを組み合わせた合成写真です。この合成画像は、強固な基底線維状マトリックスを通してパッチの底面から撮影されており、この細胞シートの合成写真は基底線維状マトリックスの上方から撮影されています。

シート状のハイドロゲル複合細胞がベースの繊維状マトリックスハイドロゲル複合体を被覆しており、細胞の密集によりエッジ部分で蛍光強度が増加していることがわかります。これは構築物の透過像であり、DPIにおける自家蛍光を発する天然繊維ベースマトリックスがここに示されています。この手順に続く他の組織工学実験によって、細胞の配向や相互作用が移植の成功にどのように影響するかといった、他の疑問に対する答えを得ることができます。

この技術により、組織工学の研究者は、複数の細胞型を移植する複雑な手法を模索することが可能になります。溶媒の取り扱いは非常に危険であることに留意してください。本手順を実施する際は、適切なマスクの着用や化学薬品用フードの使用など、常に予防措置を講じてください。