膵神経可塑性をシミュレートする。

本実験の全体的な目的は、異なる膵臓微小環境に対する末梢ニューロンの反応的な変化を研究することである。まず、正常なヒト膵臓および疾患のある膵臓組織から全組織ライセートを作製する。次に、新生ラットからDRG細胞を単離し、続いて単離した組織ライセートでこれらの細胞を処理する。

次に、48時間インキュベートした後、その後の二重免疫蛍光染色のために細胞を固定します。結果から、異なる組織抽出液中で培養したニューロンにおける、神経突起の密度と分枝パターン、およびグリア密度の違いが示されます。この手法は、さまざまな胃腸疾患における神経可塑性変化の分子メディエーターの役割など、神経胃腸科学分野の研究を促進するのに役立ちます。

この手法は、膵疾患における異なる神経栄養特性に関する知見を提供できるだけでなく、癌や胃腸管全体の炎症状態などの他の系にも適用可能です。私たちがこの手法を用いるという着想を得たのは、小児科領域におけるOng病などの神経疾患の研究者の方々と共同研究を開始した時であり、それをヒト膵組織のホモジナイズという目的のために応用しました。5 mm × 5 mm × 5 mmの膵組織立方体を、-80 °Cから液体窒素へ直接移します。

次に、凍結ブロックを金属製解離ボールが入るホモジナイズチューブに移し、組織ホモジナイザーを用いて、解離直後に組織を融解させないようにホモジナイズします。固体粉末状になったホモジネートを、氷冷した 0.1 X PBS 300 ～ 500 µL で再懸濁します。ライシスバッファーを使用すると影響が出る可能性があるため、使用しないでください。

ニューロンを溶解し、均質液を4°Cで21,130 ×gにて15分間以上遠心分離します。組織抽出物を含む透明な上清を回収します。ヒト膵臓細胞株から細胞株上清を回収するには、通常の増殖培地を用いて、細胞を少なくとも70～80%のコンフルエンスまで培養します。

準備が整ったら、細胞を細胞培養グレードのPBSで少なくとも3回洗浄し、無血清培地で最大48時間培養します。次に、Bradfordタンパク質定量法を用いて、組織ホモジネートまたは細胞株上清のタンパク質濃度を測定します。その後、神経細胞培地中の抽出液または上清の最終濃度が100 µg/mLになるように、組織抽出液および細胞株上清を分注します。

それらを-80°Cで保存します。首を切断した生後2〜12日の新生ラットを用い、皮膚を切開して脊柱を露出させます。その後、前方椎弓切除術を行い、脊髄を露出させます。

次に、後根神経節（DRG）を露出させて摘出します。摘出したDRGを、ゲンタマイシンとメトロニダゾールを添加した氷冷MEMに入れます。尾側DRGから始めて上部頸髄DRGに向かって、順次DRGを回収してください。

完了後、24ウェルプレートに十分な量となる52個のDRGを回収します。次に、マイクロ剪刀を用いて、DRGを根および神経から分離します。その後、残っている末梢および中枢への投射を切り離します。

DRGを回収した後、コラゲナーゼ type two を添加したHBSS中で37 °Cで20〜30分間インキュベートします。インキュベート後、口径の小さいシリンジを用いてDRGをトリチュレーションします。

トリプシンが過剰になるとニューロンが破壊されますが、グリア細胞への影響は比較的少ないことに注意してください。DRGを含む培地が白濁したら、懸濁液を 93.9 ×g で5分間遠心分離します。その後、培地を除去し、再懸濁します。

培養の準備として、細胞をニューロベーサル培地で懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて、ニューロンとグリア細胞の総数を推定します。その後、あらかじめコーティングした13 mmのカバーガラスに細胞を播種します。

24ウェルプレートにおいて、使用するコーティングは実験目的に応じて決定します。次に、ウェルにNeurobasal培地を満たし、一晩置いて細胞をウェルに接着させます。翌日、組織抽出物を添加した培地または細胞株上清を添加した培地を解凍します。

次に、DRGから播種培地を吸引し、必要に応じてPBSで非常に穏やかに洗浄します。その後、組織抽出物添加培地または細胞株上清添加培地をゆっくりとピペッティングして細胞に加え、濃度を100 µg/mLにします。その後、組織抽出物または細胞株上清添加培地を用いて、37 °Cで48時間細胞を培養します。

培地を吸引し、免疫染色のために4%パラホルムアルデヒドで固定します。二重免疫蛍光染色を行う場合は、形態幾何学的解析のためにニューロン特異的およびグリア特異的なマーカーを使用してください。CCDカメラを搭載した倒立光学顕微鏡と自動解析ソフトウェアを用いて、200倍の倍率でニューライト密度を測定します。

50 µm四方の格子を重ね合わせ、交差する繊維の数を計測することで、神経細胞培養物の神経突起密度を測定します。各カバースリップにつき、代表的な顕微鏡写真4〜5枚を選定し、最も成長が密な4つの異なる領域についてこの解析を繰り返します。各カバースリップからランダムに選択した30個の単独神経細胞において、神経突起と細胞体周囲をマーキングし、神経細胞あたりの平均分枝数、平均分枝長、および細胞体周囲のサイズを測定します。ここでは、正常膵臓の組織抽出液で培養したDRG神経細胞を示します。

対照的に、慢性膵炎または膵がん組織抽出物と共に培養したDRGニューロンでは、より高い神経突起密度が示されています。ここでは、さまざまなヒト膵臓組織抽出物と共に培養した筋層間神経叢ニューロンを示します。

慢性膵炎または膵癌抽出物中で培養した筋層間神経叢ニューロンは、正常膵臓の抽出物中で培養したものよりも神経突起が長く、より複雑な分枝パターンを示します。後根神経節（DRG）ニューロンを膵癌細胞の培養上清とともに培養したところ、組織抽出物で観察されたのと同様に、神経密度の増加が認められました。しかし、この増加は、our teinや神経成長因子などの特定の神経栄養因子の枯渇または遮断によって可逆的に抑制されました。

Ggl細胞は、異なる膵臓組織抽出液に対しても異なる反応を示し、慢性膵炎または膵がんの抽出液を用いた組織では、DRG由来のグリア細胞培養においてグリア細胞の増殖と細胞数が促進されました。この効果は、慢性膵炎の抽出液よりも膵がんの抽出液でより顕著に現れました。一度習熟すれば、この手法は適切に実施することで、開発後4〜5時間で完了させることができます。

この手法は、炎症性および悪性胃腸疾患を含むさまざまな胃腸疾患における神経可塑性のメカニズムを探索するための、神経胃腸学分野の研究者に道を開きました。このビデオを視聴することで、膵臓の神経可塑性を研究するために末梢ニューロンを分離する方法、およびそのシステムを用いて胃腸疾患におけるその他の神経変化や神経可塑性アッセイを実施する方法について、深い知見を得ることができます。