3.12: C. elegansにおけるRNA干渉入門

RNA干渉(RNAi)は、二本鎖RNAを生物に導入し、標的遺伝子のサイレンシングを行うために広く使用されている手法です。 ノーベル賞を受賞したRNA干渉の発見により、研究者はC.エレガンス遺伝子をサイレンシングしてその機能を決定することができました。 線虫のRNAiを誘導するには、まず標的遺伝子dsRNAを発現する大腸菌のプレートを調製し、線虫がそれを食べるようにします。その後、第4幼虫期の線虫をRNAiプレートに移し、産卵させます。 開発の望ましい段階で、子孫が収集され、表現型について採点されます。

RNAi技術は、C.エレガンスで逆遺伝スクリーニング、自動ハイスループットスクリーニング、および発生過程を研究するためのツールとして頻繁に使用されています。このビデオでは、RNA干渉の概念を説明し、C.エレガンスでのRNAi技術の使用方法を示し、科学者が広範な生物学的プロセスをよりよく理解するためのツールとしてRNAiをどのように使用しているかについて説明します。

まず、RNA干渉がどのように機能するかを示すことから始めましょう。C.エレガンスの場合、線虫にはバクテリアが供給され、サイレンシングしたい遺伝子に相補的な二本鎖RNAをコードするプラスミドで形質転換されています。 前述のように、C.エレガンスは形質転換された細菌を食べます。 現在知られていないメカニズムを通じて、dsRNAは一度摂取されるとC.エレガンスの組織に侵入します。

細胞内に入ると、酵素Dicerは二本鎖RNAを切断して、21〜23ヌクレオチドの長さの短い干渉RNA(siRNA)にします。次に、siRNAは「RISC」とも呼ばれるRNA誘導サイレンシング複合体と会合し、巻き戻されます。次に、siRNA/RISC複合体は相補的な塩基対形成を介して標的mRNAに結合します。これにより、mRNAが分解され、その遺伝子がノックダウンされます。

手順を開始する前に、目的の二本鎖RNAを発現する細菌を調製する必要があります。 何千もの遺伝子のdsRNAをコードするプラスミドを含む細菌のライブラリーが市販されています。 それ以外の場合は、標準的なクローニング技術を使用して、標的遺伝子配列をプラスミドにクローニングする必要があります。プラスミドには、抗生物質アンピシリンに対する耐性の遺伝子が含まれており、プラスミドを含む細菌コロニーを選択するために使用できます。

次に、標準的な手法を使用して、目的のdsRNAをコードするプラスミドを、二本鎖RNAを発現する大腸菌の(DE3)株に変換します。また、空のプラスミドをコントロールとして細菌を形質転換します。 重要なことに、これらの実験で使用された大腸菌の株には、二本鎖RNAを消化するRNAポリメラーゼIIIが欠けています。 この細菌には、プラスミド中のdsRNAを転写するT7 DNAポリメラーゼのIPTG誘導遺伝子も含まれています。 最後に、細菌(DE3)はテトラサイクリンとカルベニシリンの両方に耐性があり、RNAポリメラーゼIIIの発現を維持し、望ましくない細菌の増殖を防ぎます。

形質転換したHT115(DE3)細菌を、12.5μg/mlのテトラサイクリンと25μg/mlのカルベニシリンを含むLB寒天プレートに広げます。37歳で一晩インキュベートしますか?Cと翌朝の細菌コロニーがプレート上に存在します。次に、単一の細菌コロニーを選択し、100μg/mlのアンピシリンを含む1 mlのLBブロスに加えて、プラスミドを含む細菌を選択します。37歳で一晩インキュベートしますか?攪拌を伴うC。一晩インキュベーションした後、100μg / mlのアンピシリンを含む5mlのLBブロスを培養物に加え、37°Cでさらに4〜6時間インキュベー

バクテリアの準備ができたら、RNAiワームプレートを給餌用に準備する必要があります。RNAiワームプレートには、寒天、水、カルベニシリン、ワーム培地ミックス、およびプラスミド中のdsRNAを転写する細菌のT7 DNAポリメラーゼを誘導するIPTGが含まれています。 0.5 mLの細菌培養物をRNAiワームプレートに加え、37 ?C、バクテリアの芝生を作成します。

RNAiプレートに線虫を添加する前に、線虫の発生段階を同期させることが重要であり、表現型に観察された違いが発生段階のアーティファクトにならないようにすることが重要です。開発段階を同期させるために、まずプラチナワイヤーピックを火炎滅菌します。

ワームピックを使用して各RNAiプレートにL4ワームを追加し、20°Cで一晩インキュベートしますか?C、彼らが若い産卵成虫になることを可能にします。 次に、若年成人を新しいRNAiプレートに移し、20歳で6〜8時間インキュベートします。C、その間に卵が産まれます。 すべての成虫が取り除かれると、これらの卵子は発達的に同期します。最後に、線虫が分析対象の発生段階に達するまで、RNAiプレート上で増殖させます。

線虫を視覚化するためには、スライドを4%寒天パッドで調製する必要があります。まず、スライドガラス2枚をラベリングテープでテープで固定し、寒天パッドの厚さを均一にするスペーサーを作成します。2つのスペーサーの間にきれいなスライドガラスを置き、約150μlの4%溶融寒天をスライドにピペットで移します。溶融した寒天をスペーサーに垂直な追加のスライドですばやく覆います。スライドをそっと離すと、寒天パッドがスライドの1つに接着されます。

次に、寒天パッドにアジ化ナトリウムなどの麻酔薬を10μl加えて、動物を固定します。プラチナワイヤーピックを使用して、麻酔薬でワームを寒天パッドに移し、カバースリップを追加します。最後に、顕微鏡でワームを観察します。RNAi遺伝子のノックダウンを受けた線虫と対照群を比較し、サイズ、発生段階、形態、蛍光タグ付きタンパク質の局在パターン、およびその他の潜在的な表現型の違いに注意してください。

RNA干渉の最も価値のあるアプリケーションの1つは、逆遺伝子スクリーニングを簡単に実行できることです。リバースジェネティックスクリーニングは、既知の遺伝子コレクションをノックダウンし、表現型の結果を評価することにより、遺伝子機能を発見するアプローチです。例えば、研究者は、C.エレガンス(C. elegans)ゲノムのほぼすべての遺伝子についてdsRNAを発現する細菌のライブラリーを使用することができます。これらの細菌はマルチウェルプレートで培養され、線虫に供給されます。その後、多くの遺伝子のRNAiノックダウンの表現型への影響を評価することができ、正常なin vivo遺伝子機能についての洞察を得ることができます。

自動遺伝子スクリーニングは、リバース遺伝子スクリーニングの一種で、非常に高いスループットを実現しています。自動化された遺伝子スクリーニングでは、何千もの細菌クローンをロボットで処理し、定量分析のための特殊な機器を使用することで、線虫の全ゲノムを非常に簡単にノックダウンできます。

例えば、抗菌ペプチド遺伝子nlp 29のトランスジェニック蛍光レポーターを発現する線虫は、細菌の摂食を介して数千の遺伝子のRNAiノックダウンを受けます。同時に、ワームは真菌胞子に導入されます。その後、真菌に対する抗菌ペプチドの応答を評価することができます。

C.エレガンスの発生は、RNAiを使用して頻繁に研究されています。 科学者は、RNA干渉を使用して、関心のある遺伝子(または遺伝子のコレクション)をノックダウンし、その遺伝子が発生および/または発生タイミングのプロセスにどのように影響するかを正確に評価できます。例えば、RNAiのノックダウンにより、ノックダウンされたときに発生を遅らせる遺伝子や、臓器の発達に関与する遺伝子が明らかになる場合があります。

ちょうどJOVEのC.エレガンスにおけるRNA干渉の紹介を見ました。 RNA干渉がどのように機能するか、および細菌の摂食を介してC.エレガンスでRNA干渉を使用する方法を検討しました。RNA干渉は、自動化されたハイスループットスクリーニングを含む逆遺伝スクリーニングのための貴重なツールであり、発生の研究にも有用なツールです。 ご覧いただきありがとうございます!