Question 1

RNA干渉はC. elegansの遺伝子をサイレンスにするためにどのように働くのでしょうか？

Accepted Answer

二本鎖RNAは摂取後C. elegansの細胞に入り、Dicer酵素によって短い干渉RNA（siRNA）に21-23ヌクレオチドに切断されます。siRNAはRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）と結合し、相補的な塩基対形成により標的mRNAと結合し、mRNAの分解と遺伝子ノックダウンを引き起こします。

Question 2

RNAi実験のために細菌を準備する最初のステップは何ですか？

Accepted Answer

ターゲットdsRNAをコードするプラスミドを、RNAポリメラーゼIIIが欠損し、IPTG誘導性のT7 DNAポリメラーゼ遺伝子を含むHT115(DE3) E. coli株に変換します。また、コントロールとして空のプラスミドで細菌を変換します。変換された細菌をテトラサイクリンとカルベニシリンを含むLB寒天プレート上に広げ、37°Cで一晩インキュベートします。

Question 3

RNAi処理の前にワームの同期化が重要なのはなぜですか？

Accepted Answer

発育段階を同期させることで、観察される表現型の違いが発育の変異ではなく遺伝子ノックダウンによるものであることを確認できます。L4のワームを20°CのRNAiプレートに移し、一晩かけて若い成体になるようにし、その後新たなプレートに6-8時間移動させて産卵させます。これにより、分析用の発育同期化された子孫が得られます。

Question 4

研究者はどのようにRNAiを使用してリバース遺伝子スクリーニングを行いますか？

Accepted Answer

リバース遺伝子スクリーニングは、既知の遺伝子ライブラリから遺伝子をノックダウンし、表現型の結果を評価して遺伝子機能を発見します。研究者は多くのC. elegans遺伝子のdsRNAを発現する細菌をマルチウェルプレート上で培養し、それらをワームに与えます。表現型効果は正常なin vivo遺伝子機能を明らかにし、数千の遺伝子の高スループット解析のために自動化することができます。

Question 5

細菌培養の準備段階で何が起こるのか？

Accepted Answer

単一の細菌コロニーを選択し、100 μg/mlのアンピシリンを含む1 mlのLBブロスに加える。37°Cで激しく振とうしながら一晩インキュベートする。その後、アンピシリンの含まれる5 mlの新鮮なLBブロスを加え、37°Cで4-6時間インキュベートする。この培養物をRNAiワームプレートに加え、37°Cで一晩インキュベートして細菌の芝生を作る。

Question 6

RNAi処理された線虫を分析する際にどのような表現型が観察できるか？

Accepted Answer

RNAiノックダウンされたワームを対照と比較し、サイズ、発生段階、形態、および蛍光タグ付けされたタンパク質の局在化パターンの違いを記録します。科学者はまた、発生のタイミングへの影響を評価することもでき、例えば、ノックダウンされたときに発生を遅らせる遺伝子や、器官開発との他の生物学的プロセスに関与する遺伝子などです。

Question 7

C. elegansを視覚化するために顕微鏡スライドはどのように準備されますか？

Accepted Answer

ラベリングテープで2枚のガラススライドを間隔を保つようにテープで貼り合わせます。それらの間に清潔なスライドを置き、そこに4%の溶融寒天150 μlをピペットで移します。垂直なスライドで覆い、その後優しく分離します。寒天パッドに10 μlのナトリウムアジド麻酔剤を加え、プラチナワイヤーピックを使用してワームを移動させ、カバースライドを加え、顕微鏡下で観察します。

C. elegansにおけるRNA干渉入門 - 評価クイズ